CN114940992B - lncRNA TAB2-AS调控TAB2在猪卵巢颗粒细胞中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了lncRNA TAB2‑AS调控TAB2在猪卵巢颗粒细胞中的应用。本发明以lncRNA TAB2‑AS和TAB2基因为研究对象，通过构建过表达和抑制lncRNA TAB2‑AS，发现lncRNA TAB2‑AS促进TAB2基因的表达，通过RNA pulldown验证lncRNA TAB2‑AS可与TAB2的mRNA结合，通过检测培养不同时间的猪卵巢颗粒细胞中lncRNA TAB2‑AS和TAB2的表达量发现lncRNA TAB2‑AS先于TAB2基因表达。本发明通过探究lncRNA TAB2‑AS对TAB2基因的调控作用，对研究lncRNA TAB2‑AS和TAB2，以及其他lncRNA在颗粒细胞功能、卵巢发育、卵巢闭锁的机制中具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及lncRNA TAB2-AS调控TAB2在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
背景技术
长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸，具有一定功能但没有编码能力的RNA；可以通过调控表观遗传、转录以及转录后修饰等调控基因的表达。在表观遗传水平上，lncRNA可以通过招募染色质重构和修饰复合体等，改变染色体的结构、修饰状态等调控基因的表达；在转录水平上，lncRNA可以与转录因子结合形成相应的复合体，进而调控基因的表达，或其本身是转录因子；在转录后调控过程中，lncRNA可以与基因的mRNA直接结合进而影响其生物学功能，还可以充当“分子海绵”来调节miRNA的表达，进而影响下游靶基因的表达等。此外已有研究表明，lncRNA可以通过影响卵巢颗粒细胞增殖、分化、凋亡等，在卵泡发育、排卵等过程中发挥重要作用。因此，对lncRNA的研究有助于进一步了解卵泡发育、排卵的分子机制。
TAK1结合蛋白2（TAK1-binding protein 2，TAB2），又称TFG-β激酶I结合蛋白2，是一种接头蛋白，可以与TRAF6和TAK1结合。目前TAB2对卵巢颗粒细胞功能的影响尚未清楚，研究TAB2及TAB2与长链非编码RNA的相互作用对卵巢颗粒细胞功能的影响，有助于进一步了解颗粒细胞增殖、凋亡的分子机制，进而了解卵泡发育的机制。
发明内容
为解决相关问题，本发明的首要目的在于提供一种调控猪卵巢颗粒细胞TAB2表达的方法。
本发明的另一目的在于提供lncRNA TAB2-AS调控TAB2在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种调控猪卵巢颗粒细胞TAB2表达的方法，体外环境下，lncRNA TAB2-AS正调控猪卵巢颗粒细胞中TAB2的表达；通过调节lncRNATAB2-AS的表达水平，可实现猪卵巢颗粒细胞中TAB2表达的调控；所述的lncRNA TAB2-AS核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步地，增加外源性lncRNA TAB2-AS，TAB2 mRNA表达量上升，TAB2蛋白表达量上升；抑制lncRNATAB2-AS表达，TAB2 mRNA表达量下降，TAB2蛋白表达量下降。
进一步地，所述的增加外源性lncRNA TAB2-AS通过基因过表达技术实现，采用的基因过表达载体通过如下方式制备得到：
（1）提取猪卵巢颗粒细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段；
（2）将目的片段连接到用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体。
步骤（1）中进行PCR 扩增所用引物如下所示：
lncRNA TAB2-AS Forward：5′-CGCGGATCCACTGCCCCAACAGTAAAGCA-3′；
lncRNA TAB2-AS Reverse：5′-CCGCTCGAGGCCCTCATAAGTGCCGATGT-3′。
进一步地，所述的抑制lncRNA TAB2-AS表达通过反义寡核苷酸实现，采用的反义寡核苷酸序列如下：
ASO-lncRNA TAB2-AS：5′-AAAGGGCTGTAGGTACTGCT-3′。
lncRNA TAB2-AS调控TAB2在猪卵巢颗粒细胞中的应用，体外环境下，由增加外源性lncRNATAB2-AS表达引起的抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡的功能表型，能在抑制TAB2表达后恢复；或者，体外环境下，由抑制lncRNA TAB2-AS表达引起的促进猪卵巢颗粒细胞凋亡的功能表型，能在增加外源性TAB2后恢复。
进一步地，所述的增加外源性TAB2通过基因过表达技术实现，采用的基因过表达载体通过如下方式制备得到：
（1）提取猪卵巢颗粒细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段；
（2）将目的片段连接到用限制性内切酶BamH I和Xba I酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体。
步骤（1）中进行PCR 扩增所用引物如下所示：
TAB2 Forward：5′-CGGGATCCGAATGGCCCAAGGAAGCCAC-3′；
TAB2 Reverse：5′-GCTCTAGAAAGCAGTGAAACTCTCCCCC-3′。
进一步地，所述的抑制TAB2表达通过RNA干扰技术实现，采用的小干扰片段序列如下：
si-TAB2：5′-CCCATAGCCAATATAACAT-3′。
本发明中所述lncRNA TAB2-AS（long non-coding RNA TAB2 antisense RNA，暂命名）为针对猪卵巢颗粒细胞进行RNA-seq所获得的lncRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
发明人前期通过构建lncRNA TAB2-AS的过表达载体和合成其反义寡核苷酸，检测lncRNA TAB2-AS对猪卵巢颗粒细胞功能的影响，发现lncRNA TAB2-AS能促进猪卵巢颗粒细胞增殖，抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡。
发明人前期利用RNAs高通量测序结合生物信息学技术分析发现TAB2是lncRNATAB2-AS的潜在靶基因。
本研究的验证结果如下：
1、LncRNA TAB2-AS促进TAB2基因的转录
分别转染1000 ng的lncRNA TAB2-AS过表达载体（pcDNA3.1-lncRNA）和100 nM的lncRNA TAB2-AS反义寡核苷酸（ASO-lncRNA）到猪卵巢颗粒细胞后，采用qRT-PCR和WesternBlot实验检测TAB2基因的表达量。实验结果（图1）表明，过表达lncRNA TAB2-AS促进TAB2mRNA和蛋白的表达，而干扰lncRNA TAB2-AS抑制TAB2 mRNA和蛋白的表达。
2、LncRNA TAB2-AS与TAB2基因的mRNA结合
采用RNA pulldown实验结合琼脂糖凝胶电泳和qRT-PCR实验的方式，检测了lncRNA TAB2-AS与TAB2 mRNA的结合情况。WB结果（图2中a）表明，lncRNA TAB2-AS不与TAB2的蛋白结合。琼脂糖凝胶电泳结果（图2中b）表明，在RNA pulldown产物中，lncRNATAB2-AS探针组（ChIRP-lncRNA TAB2-AS）可以检测到TAB2的表达，而对照组（ChIRP-NC）中未能检测到TAB2的表达。qRT-PCR结果（图2中c）也表明，在RNA pulldown产物中，ChIRP-lncRNATAB2-AS组的TAB2 mRNA表达量显著高于对照组。
使用NCBI网站的Blast功能进行lncRNA TAB2-AS和TAB2的序列比对，发现lncRNATAB2-AS与TAB2的3’非编码区存在两段互补序列，根据序列比对结果将lncRNA TAB2-AS分成2段（1-155bp、150-243 bp），构建相应的过表达载体（pcDNA3.1-lncRNA-1、pcDNA3.1-lncRNA-2），并分别转染到猪卵巢颗粒细胞中，采用qRT-PCR检测TAB2的表达量。实验结果（图2中d）表明，与对照组相比，pcDNA3.1-lncRNA-1组和pcDNA3.1-lncRNA-2组中TAB2 mRNA表达量均显著上调，但pcDNA3.1-lncRNA-1组和pcDNA3.1-lncRNA-2组之间TAB2mRNA的表达量差异不显著。
3、LncRNA TAB2-AS在猪卵巢颗粒细胞中先于TAB2基因表达
根据猪卵巢颗粒细胞的生长与贴壁情况，分别采用qRT-PCR实验检测培养了12、18、24和30 h四个时间节点的猪卵巢颗粒细胞中lncRNA TAB2-AS和TAB2的表达量。实验结果（图3）表明，在猪卵巢颗粒细胞中，培养18、24和30 h的细胞中lncRNA TAB2-AS的表达量均显著高于培养12 h的细胞；而在培养12 h和18 h的细胞中TAB2的表达量差异不显著，培养24 h和30 h的细胞中TAB2的表达量显著上调。
4、调控TAB2可以调控lncRNA TAB2-AS对猪卵巢颗粒细胞的促进作用
分别将lncRNA TAB2-AS过表达载体（或反义寡核苷酸）和TAB2的RNA小干扰片段（或过表达载体）共转染到猪卵巢颗粒细胞中，采用Annexin V-FITC/PI双染法检测猪卵巢颗粒细胞的凋亡情况。Annexin V-FITC/PI双染结果（图4中a-b）表明，过表达lncRNA TAB2-AS能够抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡，而抑制TAB2的表达能抑制lncRNA TAB2-AS的这种作用；干扰lncRNA TAB2-AS能促进猪卵巢颗粒细胞凋亡，而过表达TAB2可以抑制lncRNA TAB2-AS的这种作用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
LncRNA TAB2-AS通过调控TAB2的转录影响颗粒细胞功能，参与卵泡发育。本发明以lncRNA TAB2-AS和TAB2基因为研究对象，以猪了卵巢颗粒细胞为细胞模型，采用qRT-PCR、Western Blot和Annexin V-FITC/PI双染等实验方法，从多个角度验证了lncRNATAB2-AS对TAB2的转录调控，对研究lncRNA TAB2-AS和TAB2对卵巢卵泡发育、卵泡闭锁机制等具有很好的应用价值。
附图说明
图1是qRT-PCR和Western Blot实验检测lncRNA TAB2-AS对TAB2表达的影响研究结果图；其中，a、b分别为过表达lncRNA TAB2-AS对TAB2 mRNA、蛋白的影响，c、d分别为抑制lncRNA TAB2-AS对TAB2 mRNA、蛋白的影响；
图2是lncRNA TAB2-AS和TAB2的结合情况图；其中，a是WB实验检测结果；b是琼脂糖凝胶电泳检测结果，c是qRT-PCR实验检测结果，d是qRT-PCR检测lncRNA TAB2-AS分段后TAB2的表达情况；
图3是qRT-PCR实验检测培养了不同时间的猪卵巢颗粒细胞中lncRNA TAB2-AS和TAB2的表达情况图；
图4是EdU实验检测lncRNA TAB2-AS过表达载体和TAB2的RNA小干扰片段共转染、lncRNA TAB2-AS反义寡核苷酸和TAB2过表达载体共转染对猪卵巢颗粒细胞增殖的影响研究结果图；其中，a是lncRNA TAB2-AS过表达载体和TAB2的RNA小干扰片段共转染的影响，b是lncRNA TAB2-AS反义寡核苷酸和TAB2过表达载体共转染的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1：构建lncRNA TAB2-AS和TAB2过表达载体
根据RNAs高通量测序得出的lncRNA TAB2-AS位置及序列信息，在NCBI网站上查找其前后序列，并设计lncRNATAB2-AS的扩增引物；通过Primer5软件分析查找lncRNA TAB2-AS序列上存在的酶切位点，发现lncRNA TAB2-AS序列上无BamH I和XhoI两种限制性内切酶酶切位点，而pcDNA3.1载体中存在，从而在lncRNATAB2-AS的扩增引物上下游分别加上BamHI和XhoI酶切位点序列。
在NCBI网站上查找TAB2基因的序列（NCBI Gene ID：100156182），并设计相应的CDS区引物；通过Primer5软件分析发现TAB2基因的CDS区序列无BamH I和Xba I两种限制性内切酶酶切位点，而pcDNA3.1载体中存在，从而在TAB2的CDS区引物上下游分别加上BamH I和Xba I酶切位点序列。
以猪卵巢颗粒细胞RNA反转录出的cDNA为模板，分别扩增lncRNA TAB2-AS序列和TAB2的CDS区序列，经纯化回收、连接pcDNA3.1载体、转化、筛选、测序鉴定序列正确后，抽提无内毒素质粒（无内毒素质粒小量提取试剂盒购自广州Magen公司），分别命名为pcDNA3.1-lncRNA和pcDNA3.1-TAB2。
本发明所用到的扩增引物：
lncRNA TAB2-AS Forward：5′-CGCGGATCCACTGCCCCAACAGTAAAGCA-3′（SEQ IDNO.2）；
lncRNA TAB2-AS Reverse：5′-CCGCTCGAGGCCCTCATAAGTGCCGATGT-3′（SEQ IDNO.3）。
TAB2 Forward：5′-CGGGATCCGAATGGCCCAAGGAAGCCAC-3′（SEQ ID NO.4）；
TAB2 Reverse：5′-GCTCTAGAAAGCAGTGAAACTCTCCCCC-3′（SEQ ID NO.5）。
注：黑色加粗字体部分为保护碱基，下划线为酶切位点；
lncRNA TAB2-AS的序列（SEQ ID NO.1）：
CCAACAGTAAAGCATATAAATTTCTCTCCAAAAAAAGGGCTGTAGGTACTGCTATTGTTGCTGGTTTTGAAACTGTACTTTCCCAACAGTAATCTCTGGTGAAAGTTCTGTGGGACACCGGCAGGTAAAGCAAGCTTAACCTTGTTGCTGTCAGTATATAGTGTGACCTACAGACATAAGTCTTGTAATATTGTTTGCAGTTCACTGTGCAGCATCGTATGTCTTCACAGAACATCGGCACTT。
实施例2：猪卵巢颗粒细胞的培养
（1）本发明中猪卵巢颗粒细胞购自广州市白云区孔旺记屠宰场，挑选健康、正常的卵巢保存于含1%双抗（青霉素、链霉素，下同）的PBS中，迅速带回实验室进行后续处理；
（2）用含1%双抗的PBS清洗卵巢数次，75%酒精浸泡30 min，含1%双抗的PBS清洗数次，将样品封好并转移至细胞房；
（3）使用镊子夹取卵巢，用1 mL一次性无菌注射器吸取1-2mL卵泡液于含有4 mLDMEM高糖培养基的15mL无菌离心管中，室温下1000rpm离心5 min，弃上清；
（4）用适量预热的含1%双抗的PBS清洗细胞2次，室温下1000 rpm离心5 min，弃上清；
（5）加入3 mL细胞完全培养基（含1%双抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基），轻轻吹打重悬细胞，随后将细胞接种于75 cm2细胞培养瓶（提前加入12 mL细胞完全培养基），并置于37℃、5% CO2培养箱中培养；
（6）48 h后于倒置显微镜下观察猪卵巢颗粒细胞生长状况，并根据其生长状况进行后续实验。
实施例3：猪卵巢颗粒细胞的接种和转染
（1）实施例2中培养的颗粒细胞汇合度达到70~90%时，弃培养基，用预热的含1%双抗的PBS清洗2次，室温下1000 rpm离心5 min，弃上清；
（2）加入5mL胰蛋白酶消化细胞，放入培养箱中3~5min，显微镜下观察至大部分细胞漂起，立即加入等量完全培养基终止消化；
（3）用预热的含1%双抗的PBS清洗2次，室温下1000 rpm离心5 min，弃上清；
（4）用适量的完全培养基轻轻吹打地重悬细胞，将细胞均匀接种于细胞培养板各孔中，用完全培养补足体积，轻轻摇匀，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；
（5）24h左右，观察细胞状态，待细胞汇合度达80%左右时即可进行转染或药物处理；
（6）转染：转染步骤参照Invitrogen公司的Lipofectamine®3000转染试剂盒说明书进行，转染完成后，继续置于37℃、5%CO2培养箱中培养，随后根据实验设计进行后续实验，每组至少3个重复。
实施例4：qRT-PCR
本发明中的qRT-PCR检测采用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（2X）试剂盒（购自Thermo Scientific公司）。实验采用比较Ct值法检测样品基因的含量，具体计算公式如下：
基因相对表达量=2-｛〈﹙实验组目的基因Ct值﹚-﹙实验组内参基因Ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因Ct值﹚-﹙对照组内参基因Ct值﹚〉｝
本发明以GAPDH为内参基因。
本发明所用到的qRT-PCR引物为：
qRT-PCR-lncRNA TAB2-AS Forward：5′-GGGCTGTAGGTACTGCTATTGTT-3′（SEQ IDNO.6）；
qRT-PCR-lncRNA TAB2-ASReverse：5′-GGTCACACTATATACTGACAGCAAC-3′（SEQ IDNO.7）；
qRT-PCR-TAB2 Forward：5′-GCTCACAGTCTTCTGCCCAT-3′（SEQ ID NO.8）；
qRT-PCR-TAB2 Reverse：5′-CTCCTGTGGTGGCATTAGCA-3′（SEQ ID NO.9）；
qRT-PCR-GAPDH Forward：5′-GGACTCATGACCACGGTCCAT-3′（SEQ ID NO.10）；
qRT-PCR-GAPDHReverse：5′-TCAGATCCACAACCGACACGT-3′（SEQ ID NO.11）。
细胞总RNA的提取参照Takara公司TRIzol操作说明书，具体步骤如下：
（1）用PBS清洗颗粒细胞2次后，直接按10 cm2/mL的比例加入TRIzol，冰上静置10min以充分裂解细胞，4℃、12000xg离心5min，转移上清于新1.5mL RNase-free管中；
（2）加入0.2 mL氯仿（每1mL TRIzol），剧烈震荡15~30s，冰上静置5min，4℃、12000xg离心15min，转移上层水相于新1.5mL RNase-free管中；
（3）加入0.5mL异丙醇（每1mL TRIzol），轻轻上下颠倒混匀，冰上静置10min，4℃、12000xg离心10min，弃上清；
（4）加入1mL 75%乙醇-DEPC水（每1mLTRIzol）以洗涤RNA，4℃、12000xg离心5min，弃上清；
（5）真空干燥5-10min，注意避免RNA沉淀干燥过度；
（6）加15-20μL DEPC水以溶解RNA沉淀。
使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）cDNA反转录试剂盒反转录总RNA。
实施例5：Western Blot
（1）总蛋白抽提：弃培养基，用适量PBS清洗细胞2次，弃PBS，按100 μL/106个细胞的比例加入蛋白裂解液（购自BestBio公司），4℃轻轻振荡15-20 min，4℃ 12000 rpm离心10 min，取上清用于下游实验。
（2）蛋白定量：①将0.5 mg/mL的蛋白标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20 μL加入96孔板中，并用PBS补足至20 μL；②加2 μL蛋白样品于96孔板中，并加PBS补足至20 μL；③在标准品孔和样品孔中，每孔加入200 μL BCA工作液，37℃孵育30 min后，测定A562，根据结果绘制标准曲线，计算蛋白样品浓度。
（3）蛋白变性：将20 μg蛋白样品与5 × SDS loading buffer的混合液于95-100℃沸水中煮5-10 min。
（4）SDS-PAGE电泳：加入样品，140 V电泳40-50 min，随后根据蛋白Marker，切下含目的蛋白的胶条。
（5）转膜：使用eBlot™ L1快速湿转仪进行转膜，程序为仪器默认程序。
（6）封闭：转膜结束后，1× TBST洗1次，使用5%脱脂奶粉室温封闭1-2 h。
（7）一抗孵育：封闭结束后，1× TBST洗1次，分别使用TBST 1:3000稀释一抗TAB2Polyclonal Antibody（购自Proteintech公司）和1:10000稀释一抗GAPDHPolyclonalAntibody（购自Proteintech公司），4℃孵育过夜。
（8）二抗孵育：一抗孵育后，1× TBST洗3次，每次8 min；随后使用TBST 1: 10000稀释的二抗Goat anti-rabbit IgG-HRP（购自Abcam公司），室温孵育2 h。
（9）曝光与结果分析：二抗孵育结束后，1× TBST洗3次，每次8 min；使用BCL显色试剂盒和化学发光仪进行曝光，用ImageJ软件分析蛋白灰度值。
实施例6：RNA pulldown
（1）制备细胞裂解液：制备过程参考贝博的RIPA裂解液说明书进行。
（2）链霉亲和素磁珠与带标签的RNA的结合：加50 μL链霉亲和素磁珠到1.5 mL离心管中，将离心管置于磁力架上，弃去上清，收集磁珠；用等量的20 mM Tris（pH= 5）洗2次，涡旋重悬磁珠，将离心管置于磁力架上，弃去上清；加入等量的1×RNACapture Buffer，涡旋混匀；加入50 pmol带标签的RNA（本研究中加的是锐博的ChIRP探针），吹打混匀后室温下孵育15-30 min。
（3）蛋白与带标签的RNA结合：孵育完成后，将离心管置于磁力架上，弃去上清；用等量的20 mM Tris（pH= 5）洗2次，涡旋重悬磁珠，将离心管置于磁力架上，弃去上清；加入100 μL 1×Protein-RNA Binding Buffer，混匀，将离心管置于磁力架上，弃去上清；加入100 µL RNA-Protein Binding Reaction混合液，涡旋混匀，4℃孵育30-60 min。
（4）RNA-蛋白复合物的洗涤和洗脱：带标签的RNA与蛋白结合后，将离心管置于磁力架上，弃去上清；加入100 μL 1×wash buffer洗涤，将离心管置于磁力架上，弃去上清；重复1次；加入50 μL Elution Buffer洗脱，轻轻吹打混匀，37℃孵育15-30 min；孵育完成后，将离心管置于磁力架上，收集上清（RNA-蛋白复合物）用于下游实验。
实施例7：颗粒细胞增殖检测
本发明使用EdU法检测细胞增殖，参照锐博公司Cell-Light™ EdU Apollo 567In vitro Kit说明书进行，具体操作步骤如下：
（1）取适量细胞接种于48孔板，培养细胞至融合度为50～80%；
（2）制备50 μMEdU培养基（完全培养基：EdU溶液=1000: 1），每孔加入200 μL 50 μMEdU培养基，放入37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h，PBS清洗细胞2次，每次3～5 min；
（3）细胞固定化：每孔加入200 μL 80%的丙酮（用PBS稀释），室温孵育15～30 min，PBS清洗细胞2次，每次3～5 min；
（4）细胞透化：每孔加入200 μL渗透剂（含0.5% TritonX-100的PBS）透化细胞，透化10 min，PBS清洗细胞2次，每次3～5 min；
（5）EdU染色：每孔加入200 μL的1× Apollo®染色反应液（避光配置，现配现用），室温、避光孵育30 min，PBS清洗细胞2次，每次3～5 min；
（6）细胞再透化：每孔加入200 μL渗透剂（含0.5% TritonX-100的PBS）透化细胞，透化10 min，PBS清洗细胞2次，每次3～5 min；
（7）DNA染色：每孔加入200 μL DAPI反应液，室温、避光孵育30 min；
荧光显微镜镜检并分析结果（每组至少3个重复）。
结果分析：
1、LncRNA TAB2-AS促进TAB2基因的转录
分别转染1000 ng的lncRNA TAB2-AS过表达载体（pcDNA3.1-lncRNA）和100 nM的lncRNA TAB2-AS反义寡核苷酸（ASO-lncRNA TAB2-AS）到猪卵巢颗粒细胞后，采用qRT-PCR和Western Blot实验检测TAB2基因的表达量。qRT-PCR结果表明，过表达lncRNA TAB2-AS促进TAB2 mRNA表达（图1中a），而干扰lncRNA TAB2-AS抑制TAB2 mRNA表达（图1中c）。WesternBlot结果表明，过表达lncRNA TAB2-AS促进TAB2蛋白表达（图1中b），而干扰lncRNA TAB2-AS抑制TAB2蛋白表达（图1中d）。
ASO-lncRNA TAB2-AS：5′-AAAGGGCTGTAGGTACTGCT-3′（SEQ ID NO.12）。
2、LncRNA TAB2-AS与TAB2基因的mRNA结合
采用RNA pulldown实验结合琼脂糖凝胶电泳和qRT-PCR实验的方式，检测了lncRNA TAB2-AS与TAB2 mRNA的结合情况。WB结果表明，lncRNA TAB2-AS不与TAB2的蛋白结合（图2中a）。琼脂糖凝胶电泳结果表明，在RNA pulldown产物中，lncRNATAB2-AS探针组（ChIRP-lncRNA TAB2-AS）可以检测到TAB2的表达，而对照组（ChIRP-NC）中未能检测到TAB2的表达（图2中b）。qRT-PCR结果也表明，在RNA pulldown产物中，ChIRP-lncRNA TAB2-AS组的TAB2 mRNA表达量显著高于对照组（图2中c）。
使用NCBI网站的Blast功能进行lncRNA TAB2-AS和TAB2的序列比对，发现lncRNATAB2-AS与TAB2的3’非编码区存在两段互补序列，根据序列比对结果将lncRNA TAB2-AS分成2段（1-155bp、150-243 bp），构建相应的过表达载体（pcDNA3.1-lncRNA-1、pcDNA3.1-lncRNA-2），并分别转染到猪卵巢颗粒细胞中，采用qRT-PCR检测TAB2的表达量。结果表明，与对照组相比，pcDNA3.1-lncRNA-1组和pcDNA3.1-lncRNA-2组中TAB2 mRNA表达量均显著上调，但pcDNA3.1-lncRNA-1组和pcDNA3.1-lncRNA-2组之间TAB2mRNA的表达量差异不显著（图2中d）。
3、LncRNA TAB2-AS在猪卵巢颗粒细胞中先于TAB2基因表达
根据猪卵巢颗粒细胞的生长与贴壁情况，分别采用qRT-PCR实验检测培养了12、18、24和30 h四个时间节点的猪卵巢颗粒细胞中lncRNA TAB2-AS和TAB2的表达量。结果表明，在猪卵巢颗粒细胞中，培养18、24和30 h的细胞中lncRNA TAB2-AS的表达量均显著高于培养12 h的细胞；而在培养12 h和18 h的细胞中TAB2的表达量差异不显著，培养24 h和30h的细胞中TAB2的表达量显著上调（图3）。
4、调控TAB2可以调控lncRNA TAB2-AS对猪卵巢颗粒细胞的促进作用
分别将lncRNA TAB2-AS过表达载体（或反义寡核苷酸）和TAB2的RNA小干扰片段（si-TAB2）（或过表达载体）共转染到猪卵巢颗粒细胞中，采用EdU法检测猪卵巢颗粒细胞的凋亡情况。结果表明，过表达lncRNA TAB2-AS能够促进猪卵巢颗粒细胞增殖，抑制TAB2的表达能逆转lncRNA TAB2-AS的这种作用（图4中a）；而干扰lncRNA TAB2-AS能抑制猪卵巢颗粒细胞增殖，过表达TAB2可以逆转lncRNA TAB2-AS的这种作用（图4中b）。
si-TAB2：5′-CCCATAGCCAATATAACAT-3′（SEQ ID NO.13）。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> lncRNA TAB2-AS调控TAB2在猪卵巢颗粒细胞中的应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> lncRNA TAB2-AS的序列
<400> 1
ccaacagtaa agcatataaa tttctctcca aaaaaagggc tgtaggtact gctattgttg 60
ctggttttga aactgtactt tcccaacagt aatctctggt gaaagttctg tgggacaccg 120
gcaggtaaag caagcttaac cttgttgctg tcagtatata gtgtgaccta cagacataag 180
tcttgtaata ttgtttgcag ttcactgtgc agcatcgtat gtcttcacag aacatcggca 240
ctt 243
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> lncRNA TAB2-AS Forward
<400> 2
cgcggatcca ctgccccaac agtaaagca 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> lncRNA TAB2-AS Reverse
<400> 3
ccgctcgagg ccctcataag tgccgatgt 29
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TAB2 Forward
<400> 4
cgggatccga atggcccaag gaagccac 28
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TAB2 Reverse
<400> 5
gctctagaaa gcagtgaaac tctccccc 28
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-lncRNA TAB2-AS Forward
<400> 6
gggctgtagg tactgctatt gtt 23
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-lncRNA TAB2-AS Reverse
<400> 7
ggtcacacta tatactgaca gcaac 25
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-TAB2 Forward
<400> 8
gctcacagtc ttctgcccat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-TAB2 Reverse
<400> 9
ctcctgtggt ggcattagca 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-GAPDH Forward
<400> 10
ggactcatga ccacggtcca t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-GAPDH Reverse
<400> 11
tcagatccac aaccgacacg t 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ASO-lncRNA TAB2-AS
<400> 12
aaagggctgt aggtactgct 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> si-TAB2
<400> 13
cccatagcca atataacat 19
Claims (10)
1.一种调控猪卵巢颗粒细胞TAB2表达的方法，其特征在于：体外环境下，lncRNA TAB2-AS正调控猪卵巢颗粒细胞中TAB2的表达；通过调节lncRNA TAB2-AS的表达水平，可实现猪卵巢颗粒细胞中TAB2表达的调控；所述的lncRNA TAB2-AS核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
增加外源性lncRNA TAB2-AS，TAB2 mRNA表达量上升，TAB2蛋白表达量上升；抑制lncRNA TAB2-AS表达，TAB2 mRNA表达量下降，TAB2蛋白表达量下降。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述的增加外源性lncRNA TAB2-AS通过基因过表达技术实现，采用的基因过表达载体通过如下方式制备得到：
（1）提取猪卵巢颗粒细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段；
（2）将目的片段连接到用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
步骤（1）中进行PCR 扩增所用引物如下所示：
lncRNA TAB2-AS Forward：5′-CGCGGATCCACTGCCCCAACAGTAAAGCA-3′；
lncRNA TAB2-AS Reverse：5′-CCGCTCGAGGCCCTCATAAGTGCCGATGT-3′。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述的抑制lncRNA TAB2-AS表达通过反义寡核苷酸实现。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述的反义寡核苷酸序列如下：
ASO-lncRNA TAB2-AS：5′-AAAGGGCTGTAGGTACTGCT-3′。
7.lncRNA TAB2-AS调控TAB2在猪卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于：体外环境下，由增加外源性lncRNA TAB2-AS表达引起的抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡的功能表型，能在抑制TAB2表达后恢复；或者，体外环境下，由抑制lncRNA TAB2-AS表达引起的促进猪卵巢颗粒细胞凋亡的功能表型，能在增加外源性TAB2后恢复；所述的lncRNA TAB2-AS核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的增加外源性TAB2通过基因过表达技术实现，采用的基因过表达载体通过如下方式制备得到：
（1）提取猪卵巢颗粒细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段；
（2）将目的片段连接到用限制性内切酶BamH I和Xba I酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：
步骤（1）中进行PCR 扩增所用引物如下所示：
TAB2 Forward：5′-CGGGATCCGAATGGCCCAAGGAAGCCAC-3′；
TAB2 Reverse：5′-GCTCTAGAAAGCAGTGAAACTCTCCCCC-3′。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的抑制TAB2表达通过RNA干扰技术实现，采用的小干扰片段序列如下：
si-TAB2：5′-CCCATAGCCAATATAACAT-3′。
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| 猪卵母细胞GV/MⅡ期mRNA/lncRNA差异表达的研究;焦亚飞;刘树林;叶升;高邦君;石德顺;黄奔;;中国畜牧杂志(第02期);第77-83页 * |
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