CN109402179B - 一种细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法 - Google Patents

一种细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，属于分子生物学技术领域。本发明中的细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，利用流式细胞分选仪，将200个带有载体荧光标签的阳性细胞群分选到96孔板的两个孔中，培养0h后进行片段分析（Fragment analysis，FA），可检测到CRISPR‑Cas9打靶该功能基因后目的基因座发生有效编辑的克隆；培养7天后，再次进行片段分析，此时片段分析峰图可根据不同细胞的增殖特性发生变化，其中增殖速度快的细胞出峰显著，而增殖速度慢的细胞群则出峰不明显，甚至不出峰；由此可快速判断食管癌功能基因敲除后的增殖表型。

Description

一种细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定 方法
技术领域
本发明涉及一种细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，由于其早期症状不明显，大多食管癌患者确诊时已是晚期，预后极差。目前我国食管癌患者5年生存率只有20%左右。尽管形势严峻，然而在肿瘤研究领域，食管癌的基础研究与药物开发却相对滞后，尤其是食管癌在世界范围内地区分布有显著的差异性，而中国是最主要的高发区，其中绝大多数属于鳞癌。因此开发食管癌高通量研究平台，十分必要。
CRISPR/Cas9—基因编辑的魔法剪刀手，作为一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑，使用CRISPR/Cas9系统开发食管癌高通量研究平台比较方便。CRISPR的基因打靶系统，可利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割，导致基因敲除等等。与传统基因编辑方法相比，CRISPR的打靶系统简单，载体构建简单，打靶效率很高，是细胞系基因敲除模型制作中广泛采用和认可的手段之一。
传统的细胞系敲除，即使采用CRISPR/Cas基因编辑系统，仍需在细胞转染后进行多轮抗性筛选以及极限稀释分离出单克隆细胞并扩大培养后方可进行表型分析，无论是极限稀释方法还是抗性筛选方法，筛选到阳性细胞后均需要将单个细胞扩大培养到一定程度后方可进行表型分析，耗费大量时间成本和人力成本；而且筛选效率低下，分析表型费时，很大程度上拖延了食管癌功能基因的研究进度和广度。
发明内容
本发明的目的是提供一种细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，能够快速判断食管癌功能基因敲除后的增殖表型，实现食管癌高通量的分子筛选，对食管癌相关基因功能研究具有很强的指导作用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，包括如下步骤：
1）通过CRISPR Cas9基因编辑技术获得食管癌功能基因敲除细胞；
2）使用流式细胞分选仪将所述食管癌功能基因敲除细胞中的阳性筛选标记细胞分选到细胞培养容器中，得到阳性筛选标记细胞群；
3）将所述阳性筛选标记细胞群直接提取DNA，然后针对基因敲除段设计检测引物进行PCR扩增，根据PCR扩增结果选择所述食管癌功能基因发生基因编辑并导致基因缺失的细胞群进行荧光PCR片段分析，获得第一峰图；同时将所述阳性筛选标记细胞群培养后提取DNA进行荧光PCR片段分析，获得第二峰图；
4）通过第一峰图和第二峰图中的峰值对比判断该食管癌功能基因敲除后的增殖表型。
流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下带荧光标签的细胞并测量其发射荧光的强度。流式细胞分选可根据不用的Marker分选，具有精度高，速度快等特点。荧光PCR片段分析是一种比较领先的片段分析技术，通常指以DNA为模板，由PCR过程所产生的，数目不等的核苷酸构成的大小不等的DNA片段，这些片段，利用其大小或者标记荧光的差异，进行分析的方法。通常是针对不同目标靶点设计引物，并且在合成引物时在末端进行荧光标记，不同大小片段采用不同颜色荧光标记，此时，进行多重聚合酶链反应（PCR），使得所有靶点的核酸片段都带荧光标记，收集细胞裂解DNA后，可进行毛细管电泳，利用荧光检测器对不同片段大小的产物进行识别和区分。
本发明的细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，结合以上内容，将CRISPR-Cas9技术与流式细胞分选技术以及片段分析技术有机整合到一起，可快速鉴定食管癌功能基因敲除后的相关表型。本发明的方法中从CRISPR-Cas9基因敲除到获取初步的表型，整个流程不足十天时间，比起常规单克隆细胞株筛选，挑到单克隆后再作增殖表型分析，节省大量人力和时间成本。本发明利用以上技术的有机结合，可实现食管癌高通量的分子筛选，为食管癌的临床研究提供分子治疗靶点。
所述食管癌功能基因为Rho family GTPase 2基因。该基因缩写为RND2基因，食管癌中该基因的表达量比起癌旁组织出现明显下调趋势，因此该基因与食管癌高度相关。
所述Rho family GTPase 2基因的sgRNA靶序列设计为两个或者三个。选择两个或者三个靶序列同时进行打靶，能够提高基因编辑的效率。
所述Rho family GTPase 2基因的sgRNA靶序列为：
sgRNA1：5’-ACTGGACATGCGGACTGACCTGG-3’；
sgRNA2：5’-AACCAGCACAACCTTGGCATTGG-3’；
sgRNA3：5’-GGGATGAGGTCAGACGTCAAGGG-3’。
使用本发明中提供的sgRNA靶序列能够提高CRISPR-Cas9技术对于RND2基因的编辑效率。
所述检测引物为：
RND2-PCR-F：5’-FAM-TGCGTGCTTGAGGAAGAGAG-3’；
RND2-PCR-R：5’-GGCAGTCAAGGGATCAGGTC-3’。
该引物的扩增片段覆盖了三个靶位点，能够准确且高效的扩增出该段目标序列。
步骤2）中分选所述阳性筛选标记细胞时，每个细胞群中的细胞数目≥200个。
本发明细胞群中细胞数目大于等于200个，细胞群的生长速度较快，短时培养后即可用于后续的检测，节约了大量的时间。
步骤3）中同时将所述阳性筛选标记细胞群培养6.5-7.5d后提取DNA进行荧光PCR片段分析，获得第二峰图。
本发明中的阳性筛选标记细胞群培养6.5-7.5d后，优势增殖表型已经表现出来，此时检测结果更为准确。
所述提取DNA的步骤如下所示：将培养后的阳性筛选标记细胞群消化后，离心弃上清，加9-11μL裂解液及3-5μL蛋白酶K，另加入9-10μL去离子水，然后于55-57℃ 10-20min、94-96℃ 3-7min进行裂解。
该种DNA提取方法方便快捷，并且提取得到的样品PCR扩增阳性率高。
所述荧光PCR片段分析所使用的仪器为ABI-3730XL测序仪。在合成引物时在末端进行荧光标记，不同大小片段采用不同颜色荧光标记，利用ABI-3730XL测序仪可以同片段大小的产物进行识别和区分。
所述荧光PCR片段分析的步骤为：
a）配制HIDI及Rox混合液，得HIDI及Rox混合液；
b）将所述HIDI及Rox混合液与所述PCR产物混合，得反应样品；
c）将所述反应样品进行变性，变性使用ABI-3730XL测序仪分析，分析数据，获得峰图。
荧光PCR片段分析中HIDI的作用为溶解PCR产物，使DNA变性，Rox则起到一个内参的作用，可对一些诸如加样误差等因素进行校正。
附图说明
图1为本发明实施例1中PCR鉴定RND2基因CRISPR-Cas9打靶效果图；
图2为本发明实施例1中培养0h的细胞群体的片段分析结果；
图3为本发明实施例1中培养7d的细胞群体的片段分析结果；
图4为本发明实施例1中培养0h和7d时细胞群中各类细胞的变化趋势示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。
细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法的实施例1
本发明细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法的发明构思为：利用CRISPR-Cas9技术将食管癌候选功能基因敲除，基因敲除后利用流式细胞分选技术分选出荧光阳性细胞群到96孔细胞培养板中，每孔细胞数为200个（200-300个都可以），这样细胞很快长满一个孔，此时收集细胞，提取DNA进行片段分析，根据片段分析峰图分析可知CRISPR-Cas9打靶该功能基因后可获得不同基因缺失或突变的克隆。此时，峰图存留，将分选至96孔板的另一个孔的细胞扩大培养至6孔板，再次收集细胞，提取DNA进行片段分析，此时获得的峰图与原始峰图对比分析即可获取细胞增殖信息。通过在食管癌细胞系EC9706中敲除Rho family GTPase 2（RND2）基因，可以观察到该基因在食管癌细胞系中的作用。
具体的，细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，主要包括以下步骤：
1、针对候选基因RND2，确定打靶位点：
根据sgRNA设计原则，以人类基因RND2的转录本（Transcript: RND2-202ENST00000587250.3）其中的Exon3作为模版，利用在线设计软件（http://crispor.tefor.net），获得三个特异性位点作为sgRNA靶序列，靶序列分别为：
sgRNA1（SEQ ID NO.1）：5’-ACTGGACATGCGGACTGACC TGG-3’；
sgRNA2（SEQ ID NO.2）：5’-AACCAGCACAACCTTGGCAT TGG-3’；
sgRNA3（SEQ ID NO.3）：5’-GGGATGAGGTCAGACGTCAA GGG-3’。
然后通过体外转录，合成得到sgRNA。
2、设计引物：
根据以上设计的靶序列，设计三对引物（上海百力格生物技术有限公司），并在引物序列的5’端添加BbsI酶切位点（其中添加下划线的碱基序列表示为添加的酶切位点），分别为：
H-RND2-IVT-1（SEQ ID NO.4）：5’-CACC G ACTGGACATGCGGACTGACC-3’；
H-RND2-IVT-2（SEQ ID NO.5）：5’-AAAC GGTCAGTCCGCATGTCCAGT C-3’；
H-RND2-IVT-3（SEQ ID NO.6）：5’-CACC G AACCAGCACAACCTTGGCAT-3’；
H-RND2-IVT-4（SEQ ID NO.7）：5’-AAAC ATGCCAAGGTTGTGCTGGTT C-3’；
H-RND2-IVT-5（SEQ ID NO.8）：5’-CACC GGGATGAGGTCAGACGTCAA-3’；
H-RND2-IVT-6（SEQ ID NO.9）：5’-AAAC TTGACGTCTGACCTCATCCC-3’。
值得注意的是表达sgRNA的pX461载体是用的是U6启动子，如果转录起始位点为碱基G的话，基因表达量会明显升高，故再设计引物时应考虑这个因素，额外添加一个碱基G，这种情况下，其对应的下游引物3’末端需要添加一个碱基C，来保证基因维持较高的表达量。
3、引物退火、配对获得带有粘性末端的双链DNA片段：
将步骤2中合成的6条引物以H-RND2-IVT-1+H-RND2-IVT-2和H-RND2-IVT-3+ H-RND2-IVT-4还有H-RND2-IVT-5+H-RND2-IVT-6的组合方式退火配对获得带有粘性末端的双链DNA片段。
具体程序如下：首先将合成的两对引物分别磷酸化，磷酸化反应体系为，引物H-RND2-IVT-1+H-RND2-IVT-2和H-RND2-IVT-3+H-RND2-IVT-4还有H-RND2-IVT-5+ H-RND2-IVT-6各加入1μL（100 μM），再加入1 μL 10×T4 Ligation Buffer （NEB），然后加入0.5 μLT4 Polynucleotide Kinase（NEB M0201S），最后加入6.5 μL ddH2O至总体积10μL，配制好反应体系以后，充分混匀，置于37℃孵育30 min；取出以上反应产物，转移至PCR仪中进行变性和退火，反应程序如下：95℃，5 min；95–25℃ at -5℃ /min。
4、获得线性化的载体DNA片段：
使用限制性内切酶BbsI将载体（pX461）DNA线性化，然后纯化回收，获得具有粘性末端的载体DNA片段，具体体系如下：向1.5ml离心管中依次加入1 μg pX461载体DNA；3 μL10×NEB Buffer 2.1；1 μL BbsI（NEB）最后补水至总体积30 μL，置于37℃培养箱孵育过夜。酶切后使用QIAquick PCR Purification Kit纯化酶切产物并回收至20μL ddH2O中。
5、通过连接反应、转化、重组子筛选获得完整的sgRNA和Cas9表达载体：
加入0.5 μL步骤（3）中得到的带有粘性末端的双链DNA片段和2 μL步骤（4）中得到的具有相同粘性末端的载体DNA，再加入0.5μL T4 DNA连接酶（NEB M0202S）和1 μL 10×T4ligation Buffer （NEB），反应1小时后转化大肠杆菌DH5α并涂氨苄青霉素抗性平板，置于37℃培养箱进行过夜培养，第二天下午挑选单菌落进行测序验证，最终可得到sgRNA和Cas9重组表达载体pX460-RND2-1和pX460-RND2-2以及pX460-RND2-3。
6、获得转染食管癌细胞系：
将构建好的表达载体等质量混合，然后通过脂质体介导的转染方式转染食管癌细胞系EC9706。
细胞培养和转染详细步骤如下：
EC9706细胞的培养和传代：细胞购于中科院细胞库，将细胞带回实验室置于CO2培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，用DPBS换液以冲洗掉死细胞和细胞代谢物，再加入新鲜的培养液RPMI1640+10%FBS+1%双抗（青霉素+链霉素））继续培养，每日在倒置显微镜下观察细胞形态和生长状况，待细胞长满培养瓶底90%左右开始传代。观察培养瓶中细胞生长状况，待细胞增殖至铺满瓶底的80~90%时，吸除瓶内的旧培养液，用预热的DPBS洗涤1-2次，再向培养瓶内加入胰蛋白酶消化液（0.25%胰酶+0.02%EDTA）1mL，37℃消化2min后将培养瓶放置于显微镜下观察。当细胞形态变圆、细胞间隙增大后，弃去胰蛋白酶并加入3mL RPMI1640以终止消化反应，用移液器轻柔反复吹打细胞，细胞脱离瓶壁后即形成细胞悬液，吸取适量悬液转移至新的培养瓶中，加入新鲜培养基混合均匀后置于CO2恒温培养箱中培养。待细胞达90%汇合度后，按上述传代方法将F2细胞接种到24孔板上培养24h。
RPMI1640细胞的转染：将pX460-RND2-1和pX460-RND2-2以及pX460-RND2-3载体DNA各取1μg，两种质粒共计3μg为实验组，加入到150μL减血清培养基（Opti-MEM）中进行稀释；取0.75μL脂质体Lipofectamine 3000稀释于150μL减血清培养基（Opti-MEM）中，然后将脂质体稀释液加入至DNA稀释液中，充分混匀，置于室温条件下孵育20min。将上述步骤中已接种培养细胞的24孔板中的培养基弃去，然后将复合物按顺序分别加入相应的细胞中，每孔加入300μL，另额外加三孔以作为平行对照实验组和未加入转染混合物的细胞作为阴性对照组。所有细胞在37℃ 5%浓度CO2培养箱中孵育4h后，弃去培养基，更换新鲜的培养基继续培养。
7、分选细胞群：
转染48h后，弃去培养基，采用胰酶消化法将细胞重悬于含有500μL新鲜培养基的离心管中，1500rpm离心5min后，丢弃大部分培养基上清，留约200μL培养基于管底，用移液器轻轻吹打混匀，再加400μL新鲜培养基混匀后转移至流式管中。通过流式细胞仪将CFP阳性细胞群分选至已经加有150μL新鲜培养基的96孔细胞培养板中，每个培养孔分选200个CFP阳性细胞。
8、琼脂糖凝胶鉴定筛选结果：
将分选的细胞群分为两组，其中一组细胞直接搜集，裂解获得DNA进行普通PCR琼脂糖凝胶鉴定以及片段分析；另一组细胞扩大培养7天后，再次裂解细胞获得DNA进行片段分析。
其中裂解以及PCR鉴定步骤主要如下：
①裂解细胞，提取DNA：
细胞消化后，离心弃上清，加10μL裂解液及4μL蛋白酶K，另加入9.6ul去离子水，PCR仪中进行裂解，反应条件为56℃ 15min，95℃ 5min。
②PCR鉴定：
根据RND2基因信息，在包含靶序列的片段上，设计5’端带有FAM修饰的荧光标记探针引物：
RND2-PCR-F：5’-FAM-TGCGTGCTTGAGGAAGAGAG-3’；
RND2-PCR-R：5’-GGCAGTCAAGGGATCAGGTC-3’。
通过PCR扩增包含打靶位点目的片段（理论长度为371bp），用此引物进行PCR。
PCR体系为：（Vazyme，P111）2*Taq Master PCR MIX：10μL，RND2-PCR-F（5µM）和RND2-PCR-R（5µM）各0.5 μL；基因组DNA：20 ng；补充ddH2O至总体积10μL；程序为：95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，40s，30个循环；72℃，10min。
PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测（结果如图1所示），从图中可见RND2已成功被CRISPR-Cas9打靶成功。
9、根据琼脂糖凝胶电泳结果进行片段分析：
片段分析的步骤为：
1）配制HIDI及Rox混合液（HIDI及Rox均购自ABI公司），HIDI与Rox混合时HIDI与Rox的体积比为9:1，即HIDI 9 mL、Rox 1 mL；轻吹混匀后放4℃备用。
2）根据琼脂糖凝胶电泳条带亮度用去离子甲酰胺将PCR产物（浓度约为300μg/μL）稀释15倍（稀释后PCR产物的浓度大约是20μg/μL），即取2μL PCR产物加入去离子甲酰胺28μL。
3）将HIDI及Rox混合液与稀释过的PCR产物混合，体积比为9:1（HIDI及Rox混合液与PCR产物的体积质量比为9μL:20μg）。混合后放入PCR仪中变性，PCR反应条件：95℃10min、4℃ 5min。
变性之后的样本使用ABI-3730XL测序仪分析，1小时后获得数据，之后用genomapper软件分析所得数据，最后导出峰图。细胞分选后直接进行一次荧光PCR片段分析，细胞扩增至6孔板后再次荧光PCR片段分析。两次片段分析结果见图2、图3。根据不同时期片段分析结果的峰图对比，判断RND2敲除后食管癌细胞系的增殖表型。
其中图2显示荧光阳性细胞群除了含有不同的敲除成功的克隆外，还掺杂有一部分野生型的细胞。细胞扩增后再次片段分析的结果则显示野生型细胞的峰图位置（375bp）已接近消失，而基因敲除成功的细胞则保留了下来。图3中第二次片段分析结果，可见细胞主要集中在片段为255-257bp的敲除成功的细胞群，野生型位置峰值比起第一次片段分析结果峰值消失。
假如某基因敲除后细胞增殖速度加快，细胞群经过7天的扩增后，表现为敲除基因细胞的比例远高于原始比例。而在本实验中培养后RND2敲除的细胞占比变大，两次检测的结果对比说明RND2敲除后，细胞的增殖速度加快，细胞群的比例也发生了相应的变化，变成以RND2敲除的细胞为主（如图4中所示）。
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caccgaacca gcacaacctt ggcat 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> H-RND2-IVT-4
<400> 7
aaacatgcca aggttgtgct ggttc 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> H-RND2-IVT-5
<400> 8
caccgggatg aggtcagacg tcaa 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> H-RND2-IVT-6
<400> 9
aaacttgacg tctgacctca tccc 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> RND2-PCR-F
<400> 10
tgcgtgcttg aggaagagag 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> RND2-PCR-R
<400> 11
ggcagtcaag ggatcaggtc 20

Claims (5)

1.一种细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）通过CRISPR Cas9基因编辑技术获得食管癌功能基因敲除细胞；
2）使用流式细胞分选仪将所述食管癌功能基因敲除细胞中的阳性筛选标记细胞分选到细胞培养容器中，得到阳性筛选标记细胞群；分选所述阳性筛选标记细胞时，每个细胞群中的细胞数目≥200个；
3）将所述阳性筛选标记细胞群直接提取DNA，然后针对基因敲除段设计检测引物进行PCR扩增，根据PCR扩增结果选择所述食管癌功能基因发生基因编辑并导致基因缺失的细胞群进行荧光PCR片段分析，获得第一峰图；同时将所述阳性筛选标记细胞群培养6.5-7.5d后提取DNA进行荧光PCR片段分析，获得第二峰图；所述荧光PCR片段分析的步骤为：
a）配制HIDI及Rox混合液，得HIDI及Rox混合液；
b）将所述HIDI及Rox混合液与PCR产物混合，得反应样品；
c）将所述反应样品进行变性，变性使用ABI-3730XL测序仪分析，分析数据，获得峰图；
4）通过第一峰图和第二峰图中的峰值对比判断该食管癌功能基因敲除后的增殖表型。
2.根据权利要求1所述的细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，其特征在于：所述食管癌功能基因为Rho family GTPase 2基因。
3.根据权利要求2所述的细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，其特征在于：所述Rho family GTPase 2基因的sgRNA靶序列设计为两个或者三个。
4.根据权利要求3所述的细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，其特征在于：所述Rho family GTPase 2基因的sgRNA靶序列为：
sgRNA1：5’-ACTGGACATGCGGACTGACCTGG-3’；
sgRNA2：5’-AACCAGCACAACCTTGGCATTGG-3’；
sgRNA3：5’-GGGATGAGGTCAGACGTCAAGGG-3’。
5.根据权利要求2所述的细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，其特征在于：步骤3）中所述检测引物为：
RND2-PCR-F：5’-FAM-TGCGTGCTTGAGGAAGAGAG-3’；
RND2-PCR-R：5’-GGCAGTCAAGGGATCAGGTC-3’。
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