CN109517898A

CN109517898A - 一种食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，治疗食管癌的药物及rnd2基因的应用

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Publication number: CN109517898A
Application number: CN201811393456.3A
Authority: CN
Inventors: 王立东; 李秀敏; 周孝峰; 夏冬雪; 周福有; 李亚杰; 王伟隆; 卢奎; 庞丹; 张爱佳; 侯婧晗; 王素杰; 宋昕; 靳艳; 高社干
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2019-03-26
Anticipated expiration: 2038-11-21
Also published as: CN109517898B

Abstract

本发明涉及一种食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，治疗食管癌的药物及RND2基因的应用，属于肿瘤分子生物学技术领域。本发明中的食管癌检测、诊断或者预后评价制剂中包含RND2基因mRNA表达水平的检测产品，或者包含RND2蛋白表达量的检测产品；RND2蛋白属于Rho GTP酶超家族中的Rnd亚家族，本发明首次发现了RND2基因表达与食管癌相关，通过检测受试者食管组织中RND2的表达，可以判断受试者是否患有食管癌、或者判断受试者是否存在患有食管癌的风险。通过提高RND2蛋白的表达，补充内源性的RND2蛋白的缺失或不足，能够治疗或者缓解因RND2蛋白缺乏导致的食管癌。

Description

一种食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，治疗食管癌的药物及RND2基因的应用

技术领域

本发明涉及一种食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，治疗食管癌的药物及RND2基因的应用，属于肿瘤分子生物学技术领域。

背景技术

食管癌（Esophageal Carcinoma，EC）是我国常见的恶性消化道肿瘤之一，在各种癌症死亡率中居第5位。在国际症研究署发布的2008年世界癌症发病与死亡报告报道中指出，中国是世界范围内的食管癌高发区，全世界一半以上的食管癌都发生在中国。

然而与食管癌流行病学严峻形势相对应的是食管癌早期诊断的缺乏，大部分患者在就诊时已处于食管癌中晚期阶段，尽管目前有多种治疗技术上的改进，然而患者5年生存率总体仍然很低，尤其对于晚期食管癌的效果不甚理想。食管癌的早期发现和治疗，是提高患者的生存机率的有效手段。因此，寻找一种早期诊断食管癌的方法是亟待解决的事情。

公布号为CN105734159A中国发明专利申请中公开了一种食管鳞癌的分子标记物，其中指出CCKBR基因的检测引物可以作为食管鳞癌的诊断产品，但是其仅是检测到在食管鳞癌患者体内CCKBR呈低表达，说明CCKBR基因与食管鳞癌的发生发展有关，而并未使用CCKBR基因的检测引物对于食管鳞癌患者的生存期进行评价及预测，目前还没有有效的食管癌预后评价制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，可在早期对食管癌进行检测和诊断，或者对食管癌患者进行预后评价。

本发明还提供了一种治疗食管癌的药物，可以治疗或者缓解食管癌患者的症状。

本发明还提供了RND2基因的应用，可以根据RND2基因获得食管癌检测、诊断或者预后评价制剂。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，包含RND2基因mRNA表达水平的检测产品，或者包含RND2蛋白表达量的检测产品。

RND2蛋白属于Rho GTP酶超家族中的Rnd亚家族，本发明通过对我国食管癌高发区居民食管各级病变的比较基因组杂交和蛋白质组研究结果进行生物信息学分析，发现RND2基因在癌组织中的表达量显著低于癌旁组织。由此，RND2基因和RND2蛋白可以作为食管癌早期诊断的分子标志物，使用基因标志物来诊断食管癌具有及时性、特异性和灵敏性的特点，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

本发明通过大量食管癌病例分析以及实验表明RND2基因在食管癌患者和正常食管组织中存在差异表达，本发明首次发现了RND2基因表达与食管癌相关，通过检测受试者食管组织中RND2的表达，可以判断受试者是否患有食管癌、或者判断受试者是否存在患有食管癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。本发明为临床食管鳞癌（食管癌的主要类型）的精准诊断提供了潜在的分子靶点，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案，具有重要的实际应用价值。本发明的食管癌检测、诊断或者预后评价制剂所通过检测受试者食管组织中RND2基因的mRNA表达水平或者RND2蛋白表达量，判断受试者是否患有食管癌、或者判断受试者是否存在患有食管癌的风险，是从分子层面进行检测，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现食管癌的早期诊断。

所述RND2基因mRNA表达水平的检测产品为RND2基因的RT-PCR检测产品、实时定量PCR检测产品、原位杂交检测产品或者高通量测序平台检测产品，所述RND2蛋白表达量的检测产品为RND2蛋白的免疫检测产品或者高通量测序平台检测产品。

本发明选取样本进行荧光定量PCR检测、Western blot检测以及流式细胞术检测，检测结果均一致。因此可以通过这些实验检测受试者食管组织中RND2基因的mRNA表达水平或者RND2蛋白表达量，进而可以判断受试者是否患有食管癌、或者判断受试者是否存在患有食管癌的风险。

所述RND2基因的RT-PCR检测产品或实时定量PCR检测产品包括特异扩增RND2基因的引物。根据RND2基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测RND2基因mRNA表达水平的引物，采用特异扩增RND2基因的引物可以准确的检测出RND2基因的mRNA表达水平。

所述RND2基因的原位杂交检测产品包括与RND2基因核酸序列杂交的探针。原位杂交探针能够与RND2基因转录得到的mRNA结合，通过结合的探针的多少判断样品RND2基因的mRNA表达水平。

所述RND2基因的高通量测序平台检测产品包括基因芯片，其中，基因芯片包括与RND2基因的核酸序列杂交的探针。基因芯片一般包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，具体的是用于检测RND2基因转录水平的针对RND2基因的寡核苷酸探针，高通量测序平台是一种特殊的诊断食管癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的RND2基因表达量的检测将成为十分便捷的工作。

所述RND2蛋白的免疫检测产品包括与RND2蛋白特异性结合的抗体。可以通过RND2蛋白的特异性抗体检测出RND2蛋白的表达量。

所述RND2蛋白的高通量测序平台检测产品包括蛋白芯片，其中，蛋白芯片包括与RND2蛋白特异性结合的抗体。高通量测序平台是一种特殊的诊断食管癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的RND2蛋白的表达量的检测将成为十分便捷的工作。

所述特异扩增RND2基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。该对引物对于RND2基因具有很高的扩增效率，检测结果更为准确。

所述与RND2基因的核酸序列杂交的探针序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。这两个探针对于RND2基因具有很高的结合效率，检测结果更为准确。

一种治疗食管癌的药物，包括RND2基因和/或其表达产物的促进剂。

本发明发现了RND2基因及其表达产物可以作为食管癌治疗的靶标，用于指导新药的研发。本发明的治疗食管癌的药物包括RND2基因和/或其表达产物的促进剂，促进剂一方面可以通过提高RND2蛋白的表达，补充内源性的RND2蛋白的缺失或不足，从而治疗因RND2蛋白缺乏导致的食管癌；另一方面可以用于促进RND2蛋白的活性或者功能，从而治疗食管癌。

所述促进剂为促进RND2基因表达的试剂、促进RND2基因表达产物稳定性的试剂、提高RND2基因表达产物活性的试剂或者增强RND2基因表达产物功能的试剂。通过提高RND2蛋白的表达量或者提高RND2蛋白的稳定性及有效性，可以有高效的达到治疗目的。

所述促进RND2基因表达的试剂为促进RND2基因转录的试剂、促进RND2基因翻译的试剂或者促进RND2蛋白含量的试剂。通过促进RND2基因表达途径中的某一步能够有效增加RND2基因的表达量。

所述促进RND2基因表达的试剂为含有RND2基因的试剂，携带RND2基因的载体所形成的试剂，携带RND2基因的宿主细胞所形成的试剂，或者含有RND2蛋白质的试剂。通过该手段可以直接或者间接增高患者体内RND2蛋白质的水平，进而改善或治愈食管癌。

RND2基因在制备食管癌检测、诊断或者预后评价制剂中的应用，具体的，根据RND2基因设计RND2基因mRNA表达水平的检测产品，将RND2基因mRNA表达水平的检测产作为食管癌检测、诊断或者预后评价制剂；或者根据RND2蛋白设计RND2蛋白表达量的检测产品，将RND2蛋白表达量的检测产品作为食管癌检测、诊断或者预后评价制剂。

RND2基因在癌组织中的表达量显著低于癌旁组织，因此可以设计出RND2基因mRNA表达水平的检测产品或者RND2蛋白表达量的检测产品，将其用作食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，具有较高的检测效率。

附图说明

图1为本发明试验例1中QPCR检测RND2基因在食管癌组织和正常食管组织中的表达情况对比图；

图2为本发明试验例2中Western blot检测RND2蛋白在食管癌组织和正常食管组织中的表达情况对比图；

图3为本发明试验例2中Western blot检测RND2蛋白在食管癌组织和正常食管组织中的表达情况统计对比图；

图4为本发明试验例3中流式细胞术检测RND2蛋白在食管癌组织和正常食管组织中的表达情况对比图；

图5为本发明试验例4中RND2高表达和低表达状态在食管癌患者中对预后的预测作用图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在本发明的上下文中，“RND2基因”包括RND2基因以及RND2基因的任何功能等同物的多核苷酸。RND2基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中RND2基因（GeneID:8153）DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

优选地，RND2基因的编码序列包括以下任意一种DNA分子：

（1）序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

（3）与（1）或（2）限定的DNA序列具有70%同源性，优选地90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述RND2基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，RND2基因表达产物包括RND2蛋白以及RND2蛋白的部分肽。所述RND2蛋白的部分肽含有与食管癌相关的功能域。“RND2蛋白”包括RND2蛋白以及RND2蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括RND2蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与RND2的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，RND2蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

（1）由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（2）将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

（3）与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性（又称为序列同一性），更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性，常为96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述RND2蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是RND2蛋白的融合蛋白。对于与RND2蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留RND2蛋白的生物学活性即可。

本发明的RND2蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留RND2蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“食管癌检测、诊断或者预后评价”既包括判断受试者是否已经患有食管癌、也包括判断受试者是否存在患有食管癌的风险。

在本发明的上下文中，“食管癌检测、诊断或者预后评价”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈，还包括对于疾病治疗效果的评价。

食管癌检测、诊断或者预后评价制剂的实施例1

本实施例中食管癌检测、诊断或者预后评价制剂为RT-PCR试剂盒。

包括下述引物：

SEQ ID NO.3：RND2上游引物 5‘-GCTGTCCAAGCAGAGGCTTA-3’；

SEQ ID NO.4：RND2下游引物 5‘-GAGGTTGCAGCTTTTGGCTC-3’；

SEQ ID NO.5：GAPDH上游引物 5‘-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3’；

SEQ ID NO.6：GAPDH下游引物 5‘-AGTGATGGCATGGACTGTGG-3’。

食管癌检测、诊断或者预后评价制剂的实施例2

本实施例中食管癌检测、诊断或者预后评价制剂为实时定量PCR试剂盒。

包括下述引物：

SEQ ID NO.3：RND2上游引物 5‘- GCTGTCCAAGCAGAGGCTTA-3’；

SEQ ID NO.4：RND2下游引物 5‘- GAGGTTGCAGCTTTTGGCTC-3’；

SEQ ID NO.5：GAPDH上游引物 5‘- GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3’；

SEQ ID NO.6：GAPDH下游引物 5‘- AGTGATGGCATGGACTGTGG-3’。

食管癌检测、诊断或者预后评价制剂的实施例3

本实施例中食管癌检测、诊断或者预后评价制剂为原位杂交试剂盒。试剂盒中包含与RND2基因的核酸序列杂交的探针。

与RND2基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

具体的，试剂盒包括下述探针：

SEQ ID NO.7：5‘- AAGGAGAGACTCAAGAGTTCTGCCC -3’。

食管癌检测、诊断或者预后评价制剂的实施例4

本实施例中食管癌检测、诊断或者预后评价制剂为基因芯片。基因芯片中包括固相载体以及固定在固相载体的RND2寡核苷酸探针。

其中固相载体为玻片，购自于VWR International公司。

其中寡核苷酸探针序列为：

SEQ ID NO.8：5‘- TGTAAACTGGACATGCGGACTGACCT -3’。

食管癌检测、诊断或者预后评价制剂的实施例5

本实施例中食管癌检测、诊断或者预后评价制剂为RND2蛋白的免疫检测试剂盒。试剂盒中包含与RND2蛋白特异性结合的抗体，该抗体可以是：SIGMA货号WH0008153M1；Invitrogen货号PA5-68319；或者proteintech货号13844-1-AP。

抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体。蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等，只要所述片段能够保留与RND2蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

食管癌检测、诊断或者预后评价制剂的实施例6

本实施例中食管癌检测、诊断或者预后评价制剂为蛋白芯片。其中，蛋白芯片包括固相载体以及固定在固相载体的RND2蛋白抗体。其中固相载体为玻片，购自于VWRInternational公司。RND2蛋白抗体可以是：SIGMA货号WH0008153M1；Invitrogen货号PA5-68319；或者proteintech货号13844-1-AP。

治疗食管癌的药物的实施例1

本实施例中治疗食管癌的药物中包含促进RND2基因表达的试剂。

这种试剂可以是：含有RND2基因的试剂，携带RND2基因的载体所形成的试剂，携带RND2基因的宿主细胞所形成的试剂，或者含有RND2蛋白质的试剂。

治疗食管癌的药物的实施例2

本实施例中治疗食管癌的药物中包含促进RND2基因表达产物稳定性的试剂。具体的为RND2蛋白稳定剂。

治疗食管癌的药物的实施例3

本实施例中治疗食管癌的药物中包含提高RND2基因表达产物活性的试剂。

治疗食管癌的药物的实施例4

本实施例中治疗食管癌的药物中包含增强RND2基因表达产物功能的试剂。

上述的治疗食管癌的药物中还可以包括药学上可接受的载体，这类载体包括（但并不限于）：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。

上述的治疗食管癌的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有RND2基因的药物或者含有RND2蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有RND2基因的药物或者含有RND2蛋白质的药物注入体内组织中。本发明的药物还可与其他治疗食管癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。

RND2基因在制备食管癌检测、诊断或者预后评价制剂中的应用的实施例1

具体的，根据RND2基因设计RND2基因mRNA表达水平的检测产品，将RND2基因mRNA表达水平的检测产作为食管癌检测、诊断或者预后评价制剂；或者根据RND2蛋白设计RND2蛋白表达量的检测产品，将RND2蛋白表达量的检测产品作为食管癌检测、诊断或者预后评价制剂。

本发明中试验例所用食管癌组织均为郑州大学第一附属医院提供，胸外科手术切除治疗，术前未经过化疗或者放疗，106块食管癌原发癌组织以及其中84块配对的正常食管上皮组织切除后一部分组织放置于福尔马林中固定后石蜡包埋并切片，余下部分于手术半小时内放入液氮罐内保存。

试验例1 在转录水平上检测RND2基因的差异表达

1.1食管癌原发癌组织以及正常食管上皮组织RNA的提取

使用QIAGEN RNA提取试剂盒cat.74136进行提取，包括如下步骤：

1）在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研钵称取离体组织样本约20mg，用杵棒研磨至粉末状；

2）取350μL RLT Plus加入研碎的组织中，1300rpm高速离心3分钟；取上清并转至gDNAEliminator MiNi Spin Colum，离心，13000rpm，30秒；

3）丢掉吸附柱，留下液并向下液加入350μL 70%乙醇，轻吹混匀，然后转至RNeasy SpinColum，离心，13000rpm，30秒，弃下液；

4）向柱中加700μL RW1，离心，13000rpm，30秒，弃下液；

5）向柱中加500μL RPE，离心，13000rpm，30秒，弃下液；

6）再向柱中加500μL RPE，离心，13000rpm，30秒，弃下液；

7）将柱子放入新的2mL管套中，空离，14000rpm，2分钟，然后将柱子放入新的1.5mL EP管中，静置2分钟；

8）向柱中央加40μL RNase-free的水，离心，14000rpm，2min；

9）将抽提的RNA产物置于冰上测浓度，每管分装1μg。

1.2逆转录

使用Invitrogen的逆转录试剂盒cat.18090050进行转录。

配置体系为：RNA 1μg，Oligo(dT) 1μL，H₂O to 12μL。配好后置于0.65mL EP管中，放到PCR仪中，于65℃保持5min，然后冰上孵育大于1min。

在上述体系中加入：5*reaction buffer 4μL，RiboLock RNase Inhibitor (20U/µL) 1μL，10 mM dNTP Mix 2μL，RevertAid M-MuLV RT (200 U/µL) 1μL。配好后总体积会为20μL。

逆转录反应程序：42℃ 60min；25℃ 5min；70℃ 5min，反应后得到cDNA。

1.3 QPCR

1）引物设计

根据Ensembal数据库中RND2基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海百力格生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

RND2基因：

正向引物为5‘-GCTGTCCAAGCAGAGGCTTA-3’ （SEQ ID NO.3）；

反向引物为5‘-GAGGTTGCAGCTTTTGGCTC-3’ （SEQ ID NO.4）；

GAPDH基因：

正向引物为5‘-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3’ （SEQ ID NO.5）；

反向引物为5‘-AGTGATGGCATGGACTGTGG-3’ （SEQ ID NO.6）。

2）配制PCR反应体系

QPCR试剂盒为SYBR Green聚合酶链式反应体系，购自Invitrogen公司。

PCR反应体系：qPCR Mix 10μL，5uM引物 2.5μL，cDNA模板 2.5μL，H₂O 5μL。

PCR反应条件：95℃ 10min，（95℃ 15s，60℃ 40s）*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过溶解曲线分析，ΔΔCT法进行相对定量。

1.4统计学方法

本实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用GraphPad Prism 5软件来进行统计分析，不同组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

1.5实验结果

结果如图1所示，与正常食管组织相比，食管癌组织中RND2基因的mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。

试验例2 在蛋白水平上检测RND2基因的差异表达

2.1提取组织总蛋白

按照碧云天组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。

2.2 Western blot检测

将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育（SIGMA货号WH0008153M1，以1:1000倍稀释使用）、二抗孵育（Santa Cruz货号sc-516102，以1:1000倍稀释使用）、显色。

2.3统计学处理

将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以GAPDH为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用GraphPadPrism 5软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

2.4结果

结果如图2和图3所示，与正常食管组织相比，食管癌组织中RND2蛋白含量降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。

试验例3 流式细胞术检测食管癌组织及癌旁组织中RND2蛋白表达水平

3.1单细胞悬液的制备

1）切除合适的新鲜肿瘤组织以及癌旁组织，尽可能多的去除周围的脂肪组织和结缔组织，木瓜蛋白酶消化30分钟；

2）300目尼龙网过滤，除去残余组织块和细胞团块，轻轻吹打细胞悬液使细胞散开，离心，并用生理盐水洗涤两次后重悬；

3.2细胞固定、打孔

将细胞计数分组后4%多聚甲醛固定30分钟，FACS Buffer洗涤后，90%甲醇打孔30分钟后FACS Buffer洗三遍；

3.3免疫反应

将配好的一抗（Invitrogen货号PA5-68319，以1:100倍稀释使用）与细胞共同孵育1小时后，FACS Buffer洗涤三遍，之后与配好的二抗（Invitrogen货号A-10931，以1:200倍稀释使用）共同避光条件下孵育1小时，FACS Buffer洗涤三遍。

3.4上机并数据分析

免疫反应后的细胞用200μL FACS Buffer重悬，上流式细胞仪，定量分析RND2表达量，RND2基因蛋白的相对含量用荧光指数（fluorescence index，FI）表示。FI=样品的平均荧光强度－对照样品的的平均荧光强度。其中，对照样品是指免疫反应时的一抗用于RND2抗体同源的IgG孵育。

本实验都是按照每组样品设置6个复孔来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用GraphPad Prism 5软件来进行统计分析，不同组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

3.5结果

结果如图4所示，与正常食管组织相比，食管癌组织中RND2蛋白含量降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。

试验例4 RND2高表达和低表达状态在食管癌患者中对预后的预测作用

本发明对233例食管癌患者随访资料进行整理分析，首先对相应病理的组织蜡块进行免疫组化，对RND2蛋白进行半定量分析，根据着色程度区分出RND2高表达组135例和低表达组98例，然后以患者生存期作为横坐标，以患者总生存率为纵坐标进行作图，结果如图5所示，根据图5可看出RND2表达量高的患者生存期长，预后好；RND2表达量低的患者生存期短，预后差。

<110> 新乡医学院

<120> 一种食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，治疗食管癌的药物及RND2基因的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 684

<212> DNA

<213> 人

<221> RND2基因

<400> 1

atggaggggc agagcggccg ctgcaagatc gtggtggtgg gagacgcaga gtgcggcaag 60

acggcgctgc tgcaggtgtt cgccaaggac gcctatcccg ggagttatgt ccccaccgtg 120

tttgagaact acactgcgag ctttgagatc gacaagcgcc gcattgagct caacatgtgg 180

gacacttcag gttcctctta ctatgataat gtccggcctc tggcctatcc tgattctgat 240

gctgtgctca tctgcttcga cattagccga ccagaaacac tggacagtgt tctcaagaag 300

tggcaaggag agactcaaga gttctgcccc aatgccaagg ttgtgctggt tggctgtaaa 360

ctggacatgc ggactgacct ggccacactg agggagctgt ccaagcagag gcttatccct 420

gttacacatg agcagggcac tgtgctggcc aagcaggtgg gggctgtgtc ctatgttgag 480

tgctcctccc ggtcctctga gcgcagcgtc agggatgtct tccatgtggc tacagtggcc 540

tcccttggcc gtggccatag gcagctgcgc cgaactgact cacgccgggg aatgcagcga 600

tccgctcagc tgtcaggacg gccagaccgg gggaatgagg gcgagataca caaggatcga 660

gccaaaagct gcaacctcat gtga 684

<211> 226

<212> PRT

<213> 人

<221> RND2蛋白

<400> 2

Met Glu Gly Gln Ser Gly Arg Cys Lys Ile Val Val Val Gly Asp

1 5 10 15

Ala Glu Cys Gly Lys Thr Ala Leu Leu Gln Val Phe Ala Lys Asp

20 25 30

Ala Tyr Pro Gly Ser Tyr Val Pro Thr Val Phe Glu Asn Tyr Thr

35 40 45

Ala Ser Phe Glu Ile Asp Lys Arg Arg Ile Glu Leu Asn Met Trp

50 55 60

Asp Thr Ser Gly Ser Ser Tyr Tyr Asp Asn Val Arg Pro Leu Ala

65 70 75

Tyr Pro Asp Ser Asp Ala Val Leu Ile Cys Phe Asp Ile Ser Arg

80 85 90

Pro Glu Thr Leu Asp Ser Val Leu Lys Lys Trp Gln Gly Glu Thr

95 100 105

Gln Glu Phe Cys Pro Asn Ala Lys Val Val Leu Val Gly Cys Lys

110 115 120

Leu Asp Met Arg Thr Asp Leu Ala Thr Leu Arg Glu Leu Ser Lys

125 130 135

Gln Arg Leu Ile Pro Val Thr His Glu Gln Gly Thr Val Leu Ala

140 145 150

Lys Gln Val Gly Ala Val Ser Tyr Val Glu Cys Ser Ser Arg Ser

155 160 165

Ser Glu Arg Ser Val Arg Asp Val Phe His Val Ala Thr Val Ala

170 175 180

Ser Leu Gly Arg Gly His Arg Gln Leu Arg Arg Thr Asp Ser Arg

185 190 195

Arg Gly Met Gln Arg Ser Ala Gln Leu Ser Gly Arg Pro Asp Arg

200 205 210

Gly Asn Glu Gly Glu Ile His Lys Asp Arg Ala Lys Ser Cys Asn

215 220 225

Leu

226

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RND2检测上游引物

<400> 3

gctgtccaag cagaggctta 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RND2检测下游引物

<400> 4

gaggttgcag cttttggctc 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> GAPDH检测上游引物

<400> 5

gagaaggctg gggctcattt 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> GAPDH检测下游引物

<400> 6

agtgatggca tggactgtgg 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RND2基因的原位杂交探针

<400> 7

aaggagagac tcaagagttc tgccc 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RND2基因的基因芯片探针

<400> 8

tgtaaactgg acatgcggac tgacct 26

Claims

1.一种食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，其特征在于：包含RND2基因mRNA表达水平的检测产品，或者包含RND2蛋白表达量的检测产品。

2.根据权利要求1所述的食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，其特征在于：所述RND2基因mRNA表达水平的检测产品为RND2基因的RT-PCR检测产品、实时定量PCR检测产品、原位杂交检测产品或者高通量测序平台检测产品，所述RND2蛋白表达量的检测产品为RND2蛋白的免疫检测产品或者高通量测序平台检测产品。

3.根据权利要求2所述的食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，其特征在于：所述RND2基因的RT-PCR检测产品或实时定量PCR检测产品包括特异扩增RND2基因的引物；所述RND2基因的原位杂交检测产品包括与RND2基因核酸序列杂交的探针；所述RND2基因的高通量测序平台检测产品包括基因芯片，其中，基因芯片包括与RND2基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求2所述的食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，其特征在于：所述RND2蛋白的免疫检测产品包括与RND2蛋白特异性结合的抗体；所述RND2蛋白的高通量测序平台检测产品包括蛋白芯片，其中，蛋白芯片包括与RND2蛋白特异性结合的抗体。

5.根据权利要求3所述的食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，其特征在于：所述特异扩增RND2基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述与RND2基因的核酸序列杂交的探针序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。

6.一种治疗食管癌的药物，其特征在于：包括RND2基因和/或其表达产物的促进剂。

7.根据权利要求6所述的治疗食管癌的药物，其特征在于：所述促进剂为促进RND2基因表达的试剂、促进RND2基因表达产物稳定性的试剂、提高RND2基因表达产物活性的试剂或者增强RND2基因表达产物功能的试剂。

8.根据权利要求7所述的治疗食管癌的药物，其特征在于：所述促进RND2基因表达的试剂为促进RND2基因转录的试剂、促进RND2基因翻译的试剂或者促进RND2蛋白含量的试剂。

9.根据权利要求8所述的治疗食管癌的药物，其特征在于：所述促进RND2基因表达的试剂为含有RND2基因的试剂，携带RND2基因的载体所形成的试剂，携带RND2基因的宿主细胞所形成的试剂，或者含有RND2蛋白质的试剂。

10.RND2基因在制备食管癌检测、诊断或者预后评价制剂中的应用，其特征在于：根据RND2基因设计RND2基因mRNA表达水平的检测产品，将RND2基因mRNA表达水平的检测产作为食管癌检测、诊断或者预后评价制剂；或者根据RND2蛋白设计RND2蛋白表达量的检测产品，将RND2蛋白表达量的检测产品作为食管癌检测、诊断或者预后评价制剂。