CN103083686B - Dkk4基因及其编码蛋白在制备药物中的应用 - Google Patents
Dkk4基因及其编码蛋白在制备药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了DKK4基因及其编码蛋白在制备药物中的应用,尤其是在制备检测或治疗胃肠道间质瘤药物中的应用,所述药物为DKK4抗体作为活性成分与药用载体组成的检测药物。或为DKK4特异性引物作为活性成分与药用载体组成的检测药物。所述药物为以DKK4抗体或其特异性引物作为活性成分与药用载体制备的检测试剂盒。本发明首次提出利用基于血清/组织中DKK基因及其产物的检测来达到早期诊断GIST或对接受手术治疗的GIST患者进行预后判断,建立在基因水平上的高通量芯片筛选+实时定量PCR验证和蛋白水平上的大样本临床样本验证,结果可靠,且根据实验结果,DKK4无论是在基因水平还是蛋白水平上都能够显著区分肿瘤与非肿瘤、高危肿瘤与低危肿瘤,结果的重复性好,且其在不同组别间的表达量的差异巨大,具有较好的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及药物,具体涉及DKK4基因及其编码蛋白在制备药物中的应用,尤其涉及DKK4基因及其编码蛋白在制备检测或治疗胃肠道间质瘤药物中的应用。
背景技术
胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)是胃肠道最常见的间叶来源肿瘤,主要发生于胃(约占70%)。近年来GIST的发病率有逐年较快增加的趋势,近年来国内外流行病学统计显示GIST发病率超过20/百万人/年。2009年中国流行病学调查显示其发病率达到约30/百万人/年,据推算,中国每年的新发病例数可达4-5万例左右。GIST俨然已成为消化道内仅次于胃癌、肠癌的最常见的恶性肿瘤。GIST大多起源于胃肠道粘膜下,向腔内外突出生长,因而早期并无特殊症状,大多数患者是在肿瘤生长到一定阶段,出现消化道出血或发现腹部肿块才来就诊,甚至有不少患者直到肿瘤破溃穿孔甚至腹腔内广泛破散才能得到诊断,导致错失最佳治疗时机。由于GIST起病部位隐匿,给早期诊断带来困难,向腔外突出为主的胃GIST在内镜检查中较易漏诊,即使内镜下发现病灶,由于病灶深度的原因,大多不能像上皮源性肿瘤一样取得明确的病理诊断;小肠或胃肠道外GIST的诊断更至今仍是困扰临床医师的一大难题,几乎没有可靠的影像学诊断手段,甚至往往需要行剖腹探查才能实现诊断。癌胚抗原(CEA)应用于大肠癌的早期诊断或甲胎蛋白应用于肝癌的筛选已经取得了成功,而相较于其他肿瘤,起病隐匿诊断困难的GIST更需要一种简单可行的生物学标志物来应用于临床诊断。GIST的生物学行为多样,跨度覆盖良性、低度恶性、中度恶性、高度恶性。绝大多数体积很小的GIST可以终生随访而无任何进展。高度恶性病例预后极差,生长极快,在靶向治疗药物伊马替尼问世之前,其中生存期仅有10-20个月,5年生存率<10%。同时GIST的生物学行为较难预测,虽然目前有普遍被接受的NIH危险度分级(主要依据肿瘤大小、核分裂相以及肿瘤原发部位),但是临床上也有不少病例的病程发展较难用上述分级标准来解释。甚至有文献报道一些看似“良性的GIST”,即肿瘤直径<2cm,核分裂相<5/50HFP的肿瘤患者,术后短期内发生复发和转移;也不乏肿瘤巨大的患者在接受手术治疗后即使不接受药物治疗也能获得长期生存。因此,临床上亟待一种能够有效判断GIST预后的生物学指标。
小分子酪氨酸激酶受体抑制剂甲磺酸伊马替尼的问世极大地改变了GIST的治疗策略,该药物以GIST发病的最根本分子异常(c-kit基因突变)为治疗靶点,发挥有效的抗肿瘤的作用。然而,在靶向药物治疗应用的临床实践中也出现了一些问题:1.约有5-10%的患者对伊马替尼原发耐药,而大多数对伊马替尼初始治疗有效的患者最终会不可避免地发展为激发耐药,耐药多发生于初始治疗开始后6个月至2年内;2.目前高复发风险GIST患者手术后接受一定时间的伊马替尼辅助治疗已经取得共识,然而辅助治疗合适的人群选择始终存在争议,放宽治疗适应症必然会带来医疗资源的浪费,增加耐药的发生;过度严苛的适应症也会导致一部分患者错过理应接受的合理治疗,如果能够有更客观合理判断GIST患者复发风险的指标,将能极大地有利于GIST的防治。
DKK基因家族由Glinka于1998年首次在两栖动物非洲蟾蜍胚胎细胞中发现。在脊椎动物中DKK家族有四个成员,分别编码DKK1、DKK2、DKK3、DKK4蛋白,它们有较高的同源性。DKK4(Dickkopf同源物4)染色体定位于8p11.2-p11.1,为一种分泌型糖蛋白,参与机体发育及Wnt信号转导途径的调控,其通过与Wnt信号转导途径相应的受体结合来调控细胞的分化、增殖、迁移或癌变等特性,在肿瘤发生方面发挥重要作用。之前对于DKK4基因与胃肠道间质瘤发生的关系没有相应的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处,研究设计DKK4基因在制药中的应用。
本发明提供了DKK4基因及其编码蛋白在制备药物中的应用。
具体地,本发明公开了DKK4基因及其编码蛋白在制备检测或治疗胃肠道间质瘤药物中的应用。
本发明所述DKK4基因名称:
中文名:DKK4(Dickkopf同源物4)
英文名:DKK4(dickkopf homolog4)
DKK4基因序列见序列表1(SEQ ID NO.1)。
本文所用术语“DKK4”指在两栖动物非洲蟾蜍胚胎细胞中发现的一个基因。本发明所指的DKK4基因包括其完整的DNA编码序列,其RNA序列,其突变体,以及其功能上活性的片段。DKK4编码蛋白为根据DKK4基因信使RNA中CDS区域序列在人体内翻译合成的蛋白质。需理解的是,当编码相同的氨基酸时,密码子中的核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是,由核苷酸取代而产生的保守的氨基酸取代时,核苷酸的变换也是可被接受的。
本发明所述检测胃肠道间质瘤药物包括用RT-PCR、PCR、免疫检测、原位杂交、基因芯片诊断胃肠道间质瘤的药物或试剂盒。
所述用RT-PCR检测胃肠道间质瘤的药物至少包括一对特异性扩增DKK4基因的引物。
所述用qPCR检测胃肠道间质瘤的药物至少包括一对特异性扩增DKK4基因的引物。
所述用免疫检测胃肠道间质瘤的药物包括与DKK4蛋白特异性结合的抗体、多克隆抗体和单克隆抗体。
所述用原位杂交检测胃肠道间质瘤的药物包括与DKK4核酸序列杂交的探针。
所述用基因芯片检测胃肠道间质瘤的药物包括与DKK4核酸序列杂交的探针。
所述用于检测胃肠道间质瘤的试剂盒包含用于RNA分离、RNA扩增、免疫组织化学染色、酶联免疫反应、蛋白定量分析的纯化的试剂、标记等。所述试剂盒由DKK4作为活性成分与药用载体组成。
所述试剂盒对DKK4的描述为:(DKK4Dickkopf同源物4,dickkopf homolog4),一种首先两栖动物非洲蟾蜍胚胎细胞中发现的基因,其蛋白编码产物为一种分泌性糖蛋白。
试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器,其中可放置一种组分,并且优选地,可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时,试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器,其中分离地放置附加的组分。然而,不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器,密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器,其中可保留所需的小瓶。
本发明的又一目的是提供了DKK4基因及其编码蛋白在制备治疗胃肠道间质瘤药物中的应用。
本发明所述治疗胃肠道间质瘤药物包括:通过RNA干扰抑制DKK4基因表达的双链核糖核酸、基于DKK4抗原蛋白的肿瘤疫苗或抑制DKK4蛋白活性的蛋白质。
本发明所述治疗胃肠道间质瘤药物可以通过口服、皮肤或肠胃外方式给药。
本发明所述治疗胃肠道间质瘤药物可以通过本领域常规技术制成口服、吸入、注射或栓剂等剂型。
本发明人通过下列试验:
a.发明人首先选取12例胃GIST的新鲜手术切除标本,按照目前使用的危险度分级标准(综合考虑肿瘤大小及核分裂相),按照肿瘤复发风险递增为标本顺序编号(低危4例、中危4例、高危4例)。利用Roche公司的NimbleGen芯片对该12例标本进行基因表达谱微阵列研究,筛选出在不同危险度分组间随肿瘤危险度升高呈显著上调或下调的基因(p<0.05,fold change>2)。之后对筛选出的基因在另外24例GIST新鲜肿瘤标本(14例高危、10例低危)中进行实时定量PCR验证。筛选出DKK4基因无论是在表达谱芯片结果中(p=0.00024,foldchange=12.63)还是定量PCR验证结果中(p=0.0029,fold change=42.16)均呈现出在高危组GIST中显著高表达。
b.发明人利用组织微阵列技术构建了包含139例GIST组织标本(分别包含肿瘤和瘤旁正常组织)的组织芯片,并利用免疫组织化学技术检测DKK4在这些标本中的表达情况,发现DKK-4在瘤旁正常组织中阳性表达率远低于在肿瘤中阳性表达率(7.2%vs86.5%),且DKK-4表达强度与肿瘤直径(p=0.043)肿瘤分级(p=0.018)呈正相关。
c.发明人扩大样本,构建了包含另外187例GIST肿瘤组织标本的组织芯片,进一步分析DKK-4表达与GIST临床病理资料及预后的关系,不仅发现DKK4的表达与肿瘤直径(p<0.001)、核分裂相(p=0.02)、和肿瘤分级(p<0001)呈正相关,还与GIST患者术后生存状态(p=0.031)及复发或转移(p=0.041)密切相关。通过Kaplan-Meier方法绘制生存/复发曲线,根据DKK4表达强弱进行分组患者的生存/复发曲线也可得以明显区分。
d.本发明人运用ELISA方法检测20例GIST患者血浆标本及25例非GIST人群(包括16例健康人群、3例胃癌、3例肠癌及3例腹腔间叶源性肿瘤患者)血清标本中DKK-4蛋白的含量,根据DKK4标准品梯度浓度绘制标准曲线计算DKK4含量。结果显示GIST患者平均血清DKK-4蛋白含量(359.5±156.4pg/ml)明显高于非GIST人群(54.92±4.705pg/ml),差异有统计学意义(P=0.0347)。
e.根据上述实验结果尤其是大样本量的临床资料分析,发明人已经发现DKK4在胃肠道间质瘤尤其是高度危险的胃肠道间质瘤中有特别高的特异性表达,证实了DKK4基因与GIST的生物学特性及GIST患者预后存在一定联系。该基因的蛋白编码产物DKK4蛋白作为一种分泌型糖蛋白,可以在血清中得到检测,且其水平在GIST患者中特异性升高,为GIST疾病的早期诊断和预后判断提供一种新的手段。
在得到了DKK4的核酸片段的情况下,可根据核苷酸序列来设计DKK4特异性引物(探针)。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明中,DKK4多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之,只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含DKK4的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属的细菌细胞;真菌细胞如酵母;植物细胞;昆虫细胞;动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在获得了核酸序列后,可根据核酸序列设计特异性核酸探针。设计探针的方法是本领域常规的,可见Sambrook等人,分子克隆实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述。检测生物样品中是否存在DKK4蛋白或核酸的示范性方法包括获得测试受试者的生物样品,使该生物样品接触能与DKK4mRNA或基因组DNA杂交的标记的核酸探针。该核酸探针可以是,例如人的核酸或及一部分,如长至少15、30、50、100个核苷酸并能在严谨条件下与DKK4mRNA或基因组DNA充分杂交的核酸探针。用于本发明诊断试验的其它探针如本文所述。
核酸探针与扩增的标记序列接触。该探针优选连接到一种发色团,但可被放射标记。在另一个实施例中,探针连接到一种结合伴侣上,如抗体或生物素,或另一种携带可检测结构域的结合伴侣上。
在传统的方法中,检测可通过Southern印迹以及与标记的探针杂交来进行。Southern印迹所涉及的技术是本领域技术人员所熟知的(参见Sambrook等,1989)。常规的检测还有生物芯片、荧光显影技术、细胞流式计数等。
另一方面,本发明还包括对DKK4DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其是单克隆抗体。这里,“特异性”是指抗体能结合于DKK4基因产物或片段。较佳地,指那些能与DKK4基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明所述DKK4抗体可以通过ELISA、Western印迹分析,或者与检测基团偶联,通过化学发光、同位素示踪等方法来检测。
DKK4(Dickkopf同源物4)染色体定位于8p11.2-p11.1,为一种分泌型糖蛋白,参与机体发育及Wnt信号转导途径的调控,其通过与Wnt信号转导途径相应的受体结合来调控细胞的分化、增殖、迁移或癌变等特性,在肿瘤发生方面发挥重要作用,本发明人通过试验证明DKK4基因可用于制备诊断或治疗胃肠道间质瘤药物。
本发明首次提出利用基于血清/组织中DKK基因及其产物的检测来达到早期诊断GIST或对接受手术治疗的GIST患者进行预后判断,建立在基因水平上的高通量芯片筛选+实时定量PCR验证和蛋白水平上的大样本临床样本验证,结果可靠,且根据实验结果,DKK4无论是在基因水平还是蛋白水平上都能够显著区分肿瘤与非肿瘤、高危肿瘤与低危肿瘤,结果的重复性好,且其在不同组别间的表达量的差异巨大,具有较好的临床应用价值。
附图说明
图1:实时定量PCR结果显示,在24例胃肠道间质瘤(14例高危、10例低危)的新鲜肿瘤标本中,低危组(以标注)中DKK4基因的表达量显著低于高危组(以▲标注)中的表达量(p=0.0029,fold change=42.16)。
图2:免疫组化染色结果(瘤旁正常组织,阴性反应)
图3:免疫组化染色结果(肿瘤组织,阴性反应)
图4:免疫组化染色结果(肿瘤组织,弱阳性反应)
图5:免疫组化染色结果(肿瘤组织,阳性反应)
图6:免疫组化染色结果(肿瘤组织,强阳性反应)
图7:通过Kaplan-Meier方法绘制的326例胃肠道间质瘤患者的总生存曲线,其中DKK4染色阴性以◆标注,弱阳性以●标注,阳性以▲标注,强阳性以■标注。
图8:通过Kaplan-Meier方法绘制的326例胃肠道间质瘤患者的无复发生存曲线,其中DKK4染色阴性以◆标注,弱阳性以●标注,阳性以▲标注,强阳性以■标注。
图9:纵坐标为DKK4血浆浓度,左侧散点为胃肠道间质瘤患者血浆标本,右侧为非胃肠道间质瘤人群血浆标本。
具体实施方式
实施例1.实时定量PCR分析:
1.1主要试剂
RNA抽提试剂RNAiso Plus购自宝生物工程有限公司,逆转录试剂盒HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kits购自Invitrogen公司,荧光定量PCR试剂盒Power SYBR Green PCR Master Mix购自Invitrogen公司,DKK4及管家基因β-肌动蛋白的引物设计采用Primer3软件,引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成,其余试剂均为分析纯。
1.2胃肠道间质瘤病人肿瘤组织样品的收集
胃肠道间质瘤患者的肿瘤组织来源于上海交通大学医学院附属仁济医院。手术后组织标本立即置液氮中冷冻,随后保存于-80℃超低温冰箱。
1.3实时荧光定量分析PCR分析
总RNA抽提:将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中,用研杵研磨组织,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状。向研钵中加入适量的RNAiso Plus,将研磨成粉末状的样品完全覆盖,然后室温静置,直至样品完全融化,再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。将匀浆液转移至离心管中,室温静置5分钟。12,000g4℃离心5分钟。小心吸取上清液,移入新的离心管中。加入RNAiso Plus的1/5体积量的氯仿,剧烈振荡15秒,待溶液充分乳化后,再室温静置5分钟,12,000g4℃离心15分钟。吸取上清液转移至另一新的离心管中。向上清中加入等体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,在15~30℃下静置10分钟。12,000g4℃离心10分钟。弃去上清,沿管壁加入75%的乙醇lml,上下颠倒洗涤离心管管壁,12,000g4℃离心5分钟后弃去乙醇。室温干燥沉淀2~5分钟,加入适量的RNase-free水溶解沉淀后用Nanodrop2000测定RNA浓度后于-80℃保存。
逆转录合成cDNA:RNA解冻后在0.2mlPCR管中配置反应溶液,反应体系如下表:
成分 | 体积/反应(ul) |
10X RT Buffer | 2.0 |
25X dNTP Mix(100nM) | 0.8 |
10X RT random primer | 2.0 |
Multiscribe Reverse Transcriptase | 1.0 |
RNase-free water | 4.2 |
总体积/反应 | 10 |
加样后将反应管置于PCR仪,热循环体系为25℃10分钟——37℃120分钟——85℃5分钟——4℃保存。
Realtime PCR检测:在96孔板中配制20ul反应体系。每反应设3个复孔,以β-肌动蛋白为内参基因进行相对定量检测DKK4基因表达量。
Realtime扩增体系如下表:
成分 | 浓度 | 体积(ul) |
Power SYBR Green Master Mix | 2X | 10 |
Forward Primer | 1uM | 4 |
Reverse Primer | 1uM | 4 |
cDNA模版 | 2 | |
总体积 | 20 |
将加好样品的96孔板放在ABI9300荧光定量PCR仪中进行反应,热循环体系如下:
Realtime PCR结果用2-△△CT法进行分析。实验结果如图1所示,在24例胃肠道间质瘤(14例高危、10例低危)的新鲜肿瘤标本中,低危组中DKK4基因的表达量显著低于高危组中的表达量(p=0.0029,fold change=42.16)。
实施例2.DKK4在胃肠道间质瘤病人组织中的表达情况
2.1主要试剂
DKK4单抗(ab38589)及二抗山羊多克隆抗兔IgG(ab6721)购自abcam公司。DAB显色剂及其底物试剂盒购自赛默飞公司。其余试剂均为国产分析纯。
2.2胃肠道间质瘤组织芯片阵列的构建
胃肠道间质瘤患者的肿瘤组织来源于上海交通大学医学院附属仁济医院。芯片阵列构建由苏州新芯生物技术有限公司完成,点阵直径1.6mm,层厚3mm。芯片一包括139例胃肠道间质瘤肿瘤组织及相应邻近正常组织,芯片二包括189例胃肠道间质瘤肿瘤组织。
2.3免疫组织化学染色
脱蜡水化:二甲苯10分钟——二甲苯1/2 10分钟——无水乙醇5分钟——95%乙醇5分钟——70%乙醇10分钟——PBS洗。
抗原修复:电炉加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95℃左右,放入组织芯片加热15分钟,PBS洗。
消除内源性酶:3%过氧化氢37℃孵育30分钟,PBS洗。
抗原封闭:10%山羊血清室温孵育1小时。
一抗孵育:滴加一抗(DKK4单抗)150ul,4℃孵育过夜,PBS洗。
二抗孵育:滴加二抗(羊抗兔多抗)150ul,室温孵育1小时,PBS洗。
发色:DAB显色5-10分钟,显微镜下控制发色程度,PBS洗。
苏木精复染1分钟,自来水冲洗15分钟。
脱水、封片、镜检。
2.4组织芯片结果判断
以胞浆着色为阳性反应部位,对每个阵列点阳性细胞的阳性强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别打0、1、2、3分,着色阳性面积按无着色、着色<1/3、1/3~2/3、>2/3分别打0、1、2、3分,然后根据两项打分之和判断其结果:0分为阴性,1-2分为弱阳性,3-4分为阳性,5-6分者为强阳性(注:每张切片选择有代表性的区域,在400倍视野下进行计数,共计5个视野,取其平均值以避免随意性)
2.5统计学分析
将组织芯片结果输入SPSS20.0中进行分析,以卡方检验分析DKK4表达与临床病理资料相关性,显著性水平定义为p<0.05。以Kaplan-Meier法进行生存分析,显著性水平定义为p<0.05。
免疫组化染色典型结果见图2-图6。分析结果显示DKK-4在瘤旁正常组织中阳性表达率远低于在肿瘤中阳性表达率(7.2%vs86.5%),且DKK4的表达与肿瘤直径(p<0.001)、核分裂相(p=0.02)、和肿瘤分级(p<0001)呈正相关,还与GIST患者术后生存状态(p=0.031)及复发或转移(p=0.041)密切相关。通过Kaplan-Meier方法绘制生存/复发曲线,根据DKK-4表达强弱进行分组患者的生存/复发曲线也可得以明显区分,见图7-图8。
Claims (2)
1.DKK4基因在制备检测胃肠道间质瘤药物中的应用,其特征在于,DKK4基因的序列为SEQ ID NO.1-2,并以DKK4基因编码的蛋白制备特异性结合的单克隆抗体,所述单克隆抗体用于检测DKK4的表达情况。
2.DKK4基因在制备检测胃肠道间质瘤药物中的应用,其特征在于,DKK4基因的序列为SEQ ID NO.1-2,并制备至少一对特异性扩增所述DKK4基因的RealtimePCR引物,所述引物用于检测DKK4的表达情况。
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