CN107177683B

CN107177683B - 一种膀胱癌筛选检测试剂盒

Info

Publication number: CN107177683B
Application number: CN201710444565.2A
Authority: CN
Inventors: 杨昭
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-06-13
Filing date: 2017-06-13
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2037-06-13
Also published as: CN107177683A

Abstract

本发明主要属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种膀胱癌筛选检测试剂盒。所述试剂盒用于检测膀胱癌相关基因的cDNA的寡核苷酸；所述试剂盒包括特异性引物对，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID No.2所示。所述试剂盒能够检测膀胱癌相关基因的cDNA的寡核苷酸，KMT1A作为膀胱癌的一个新的标志物，可用于膀胱癌的辅助诊断。

Description

一种膀胱癌筛选检测试剂盒

技术领域

本发明主要属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种膀胱癌筛选检测试剂盒。

背景技术

膀胱癌是泌尿系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤。在我国，膀胱癌的发病率为6.61/10万，在泌尿系统肿瘤中排第一位。膀胱癌发生的危险因素主要包括吸烟、芳香胺类致癌物、砒霜、膀胱的慢性感染、电离辐射和非那西汀类药物的滥用。根据病理特征，膀胱癌在临床上分为浅表型(70％)和浸润型(30％)两大类。预后较差和极易复发是膀胱癌的最大特点，有效的治疗很大程度上依赖于对膀胱癌的早期发现和治疗。

目前，膀胱癌诊断主要依赖于膀胱镜检查和尿细胞学检查。前者为诊断膀胱癌的金标准，价格比较昂贵，并为侵入性的检查，对于需要长期随访的患者是一种较大的负担，且患者依从性差，不宜作为常规检查；后者虽然特异度高且无创，但对低度表浅性的肿瘤敏感性低，容易产生假阴性的结果。因此，寻找敏感度及特异度高的膀胱癌肿瘤标志物作为膀胱癌的早期诊断、监测以及预后评估受到越来越多的关注。相对传统检查手段和影像学检查技术，肿瘤标志物最大的优点在于简单快捷，免除患者额外检查的痛苦。通过简单的采血或尿液收集即可获取标本进行检测，操作方便，且可应用于伴有重大脏器功能障碍无法行内镜检查或植入心脏起搏器不能接受强辐射影像学检查的患者。靶向诊断技术的优势在于发现早期形态学变化不明显的肿瘤细胞和组织，可应用于膀胱癌筛查或预后监测，并在一定程度上可以起到辅助对膀胱癌进行分级、分期的工作。

目前临床上正在使用的膀胱癌相关的肿瘤标志物包括核基质蛋白22(NMP22)和膀胱肿瘤相关抗原(BTA)等，但尚无单一标志物可诊断膀胱癌，且不能替代膀胱镜检查。

NMP22是一种细胞核内有丝分裂蛋白，其在细胞凋亡后被释放出来，以可溶性复合物或片段的形式存在于人的尿液中，其在膀胱癌患者尿液中浓度升高了25倍左右，可采用酶联免疫吸附试验可以检测其浓度，是NMP22作为临床诊断膀胱移行细胞癌的依据。有学者对1331例临床患者的尿液标本的NMP22进行了检测，发现其较传统尿细胞学筛查具有更高的膀胱癌检出率。用于诊断时，NMP22对膀胱癌的敏感度远高于尿脱落细胞学(56％vs.16％)，但NMP-22的特异度不及尿脱落细胞学(86％vs.99％)；用于复发监测时，NMP22对膀胱癌的敏感度和特异度分别为50％和87％。美国FDA已批准将NMP22应用于临床膀胱癌的检测。但NMP22在其他泌尿系疾病，诸如血尿、脓尿、尿路结石和膀胱炎患者尿液中也有升高，会影响到其检测膀胱癌的特异性。

BTA又称人补体因子H相关蛋白质，是在膀胱肿瘤生长过程中所释放的一种由16～165kd特异性多肽组成的高分子复合物，其结构与人补体因子H类似，可通过干扰补体途径使得膀胱肿瘤细胞逃逸宿主免疫系统的攻击，获得选择性生长优势。尿液BTA水平升高对膀胱癌有一定的早期诊断价值，Miyake等收集了126例(64例膀胱癌组、62例对照组)血尿患者的尿液标本，利用BTA检测试剂盒(BTA

和

)对尿液标本中的BTA水平进行了检测，结果显示，膀胱癌组阳性率为72％，但对照组亦有47％的患者为阳性结果，BTA对膀胱癌的敏感性和特异性分别为72％和53％，由此认为BTA检测有助于膀胱癌的早期诊断，但其易受血尿影响而出现假阳性结果。

因此，亟需开发和鉴定高特异性和高灵敏性的标志物用于膀胱癌的诊断。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种膀胱癌筛选检测试剂盒，所述试剂盒能够检测膀胱癌相关基因的cDNA的寡核苷酸，KMT1A作为膀胱癌的一个新的标志物，可用于膀胱癌的辅助诊断。

本发明是通过以下技术方案实现的：

结合膀胱癌相关基因的核酸的检测试剂在制备膀胱癌诊断试剂中的用途，所述膀胱癌相关基因为KMT1A基因。

进一步地，所述检测试剂是用于检测膀胱癌相关基因的cDNA的寡核苷酸。

一种膀胱癌筛选检测试剂盒，所述试剂盒用于检测膀胱癌相关基因的cDNA的寡核苷酸；所述试剂盒包括特异性引物对，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，所述试剂盒还包括标准DNA模板和PCR反应液，所述标准DNA模板为KMT1A基因的cDNA模板。

进一步地，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒还包括荧光染料。

进一步地，所述PCR反应液为荧光定量PCR反应液，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及缓冲液。

进一步地，所述Taq酶为热启动酶。

进一步地，所述荧光染料为SYBR Green II。

本发明的有益技术效果：

KMT1A作为膀胱癌的一个新的标志物，可用于膀胱癌的辅助诊断。基于KMT1A的免疫组织化学或荧光定量PCR的靶向诊断技术最大的优点在于发现早期形态学变化不明显的肿瘤细胞和组织，操作方便可应用于早期筛查和诊断。此外，KMT1A也可以用于膀胱癌患者术后预后的监测。KMT1A表达量的升高，提示患者的预后会变差。

附图说明

图1为利用荧光定量PCR的方法，在10对膀胱癌和癌旁组织中检测KMT1A基因表达量的结果示意图；

图2A为利用免疫组化的方法对膀胱癌患和癌旁组织中检测KMT1A蛋白表达量的结果示意图；

图2B是对KMT1A蛋白染色进行的计算和统计分析结果；

图3为通过TCGA数据分析KMT1A基因在膀胱癌和正常膀胱组织中的表达量；

图4A利用GSE13507表达谱芯片数据，分析膀胱癌患和癌旁组织中KMT1A基因的表达量信息；

图4B利用GSE37815表达谱芯片数据，分析膀胱癌患和癌旁组织中KMT1A基因的表达量信息；

图5A利用GSE13507数据，根据KMT1A基因的表达量对膀胱癌患者的总体平均生存时间的分析结果；

图5B利用GSE32894数据，根据KMT1A基因的表达量对膀胱癌患者的总体平均生存时间的分析结果；

图6为利用本发明的膀胱癌检测试剂盒，在100对膀胱癌和癌旁组织中检测KMT1A基因的表达量的结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。

实施例1

一种膀胱癌筛选检测试剂盒，所述试剂盒用于检测膀胱癌相关基因的cDNA的寡核苷酸，所述膀胱癌相关基因为KMT1A基因；所述试剂盒包括特异性引物对，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID No.2所示；其中所述为KMT1A蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。

所述试剂盒还包括标准DNA模板和PCR反应液。所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒还包括荧光染料。所述PCR反应液为荧光定量PCR反应液，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及PCR缓冲液。所述Taq酶为热启动酶。所述荧光染料为SYBR Green II。

人膀胱癌和癌旁组织中KMT1A的定量PCR分析

一、样本收集：组织样本来自于10对膀胱癌患者的住院病例手术切除样本，每对包含膀胱癌组织和配对的癌旁组织。所有标本取下后分为两份，一份放入液氮罐中，随后放入-80冰箱中保存。另一份放入多聚甲醛固定后石蜡包埋及染色。所有膀胱癌组织及癌旁组织经昆明医科大学第二附属医院病理科病理检查确认。所有标本的使用符合昆明医科大学第二附属医院伦理委员会的伦理要求。

二、RNA提取：

按照天根的培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(DP430)中的步骤提取总RNA：

①匀浆：每10-20mg组织加300μl裂解液RL(使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇)，用研磨杵将组织彻底研磨(如组织较难彻底研磨，可选用电动或玻璃匀浆器)；随后向匀浆液中加入590μlRNase-Free ddH2O和10μl Proteinase K，混匀后56℃处理10-20min。12，000rpm(～13，400×g)离心2-5min，取上清进行以下操作。

②缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中)，12，000rpm(～13，400×g)离心30-60sec，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

③向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12，000rpm(～13，400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

④DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻柔混匀。

⑤向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。

⑥向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12，000rpm(～13，400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

⑦向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12，000rpm(～13，400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。重复一次。

⑧12，000rpm(～13，400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

⑨将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12，000rpm(～13，400×g)离心2min，得到RNA溶液。利用Nanodrop 2000测定浓度。

三、反转录合成cDNA模板：取上述10对膀胱癌组织癌旁组织的总RNA，采用北京康润诚业生物科技有限公司StarScript II One-stepRT-PCR试剂盒(A215-01)对提取的总RNA反转录合成cDNA。

第一步打开RNA二级结构，反应体系及条件如下：

试剂	用量
		Oligo dT	1μl
RNA	1-2μg
		DEPC水	补齐至20μl

将上述组分混合后70℃反应5min，然后冰浴10min。

第二步反转录反应，反应体系及条件如下：

将上述组分混合均匀后42℃孵育1h，然后70℃灭活10min，即得到cDNA。

四、荧光定量PCR检测KMT1A表达量：应用实施例1所述试剂盒进行定量PCR检测KMT1A表达量，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增，KMT1A的检测引物如下：

KMT1A-F：5’-ATGCCGCCTACTATGGCAAC-3’

KMT1A-R：5’-AAAGTTGGAGTCCATGCGGG-3’

荧光定量PCR体系：

试剂	用量
		2×PCR反应液	10μl
引物	各1μl
		DNA模板	1μl
RNase free ddH<sub>2</sub>O	补齐至20μl

其中，所述标准DNA模板为扩增获得的KMT1A基因的cDNA模板。荧光定量PCR条件如下：

PCR条件如下：

因此，利用荧光定量PCR的方法，在10对膀胱癌和癌旁组织检测KMT1A基因的表达量，结果如图1所示，KMT1A基因在膀胱癌中显著高表达，结果表明KMT1A在膀胱癌中的表达量显著高于癌旁组织，..P<0.05。

人膀胱癌和癌旁组织中KMT1A蛋白的免疫组织化学(IHC)分析。

①将石蜡包埋的组织切成2μm的系列切片，在二甲苯中去除石蜡(3×5min)并通过一系列梯度乙醇再水化，然后用去离子水和PBS进行两个冲洗步骤(1×2min)。

②使玻片在含3％H2O2的PBS中温育10min，阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS溶液洗3次×2min。

③然后切片放入0.01M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)后，在97℃-100℃进行10min，PBS溶液洗3次×2min。

④室温下用含1％马血清PBS阻断免疫球蛋白的非特异性结合30min。用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入1:500稀释的KMT1A抗体，放入湿盒中4℃孵育过夜。

⑤次日PBS溶液洗3次×2min，用滤纸将组织周围的水吸去，加入1:1000稀释的小鼠二抗后，室温1h，用PBS洗3次×2min。然后使用二氨基联苯胺色原溶液显色液显色(DAB)。显微镜下观察染色情况，染色10min后终止反应，PBS洗3次×2min。

⑥苏木素染液，5～10min，PBS洗3次×2min；用稀盐酸乙醇分色5～10s，立即用PBS洗3次×2min；用淡氨水使片子返蓝，5～10min，PBS洗3次×2min；通过一系列梯度乙醇脱水，二甲苯透明(2×3min)；中性树胶封片；显微镜下观察。

将膀胱癌和癌旁组织切片进行比较。如图2A代表性地显示了来自10例膀胱癌患者和癌旁组织的切片的结果。KMT1A特异性染色在膀胱癌组织细胞，而在癌旁组织中则没有染色。图2B是对KMT1A蛋白的染色进行了计算和统计分析，KMT1A的染色得分计算方法是染色强度(无＝1，弱＝2，中＝3，强＝4)和染色细胞比例的乘积(0％–100％)。结果表明KMT1A蛋白在膀胱癌中显著高表达。

因而，KMT1A在膀胱癌中的特异性表达由IHC分析明确地证实。

图2.KMT1A蛋白在膀胱癌中显著高表达。通过免疫组化分析，KMT1A在原代膀胱癌细胞中的表达量显著高于癌旁组织，n＝10。KMT1A的染色得分计算方法是染色强度(无＝1，弱＝2，中＝3，强＝4)和染色细胞比例的乘积(0％–100％)。比例尺＝50m，***P<0.001。

TCGA数据库中分析人膀胱癌和癌旁组织中KMT1A的表达量。

在TCGA数据中分析KMT1A基因在膀胱癌中的表达量，如图3所示，通过分析TCGA数据库，相比于正常膀胱组织，KMT1A基因在膀胱癌中显著高表达，*P<0.05。

NCBI数据库中分析人膀胱癌和癌旁组织中KMT1A的表达量。

在NCBI搜索原代膀胱癌组织的表达谱芯片结果，搜索到芯片数据GSE13507和GSE37815两个数据库中含有膀胱癌组织和癌旁组织的KMT1A表达量信息。如图4所示，通过分析GSE13507和GSE37815表达谱芯片数据，相比于正常膀胱组织，KMT1A基因在膀胱癌中显著高表达。

膀胱癌患者预后分析

在NCBI搜索原代膀胱癌组织的表达谱芯片结果，搜索到芯片数据GSE13507和GSE32894两个数据库中含有被测样本的KMT1A的表达量信息和临床预后信息。首先根据KMT1A的表达量将膀胱癌样本分为高(high)和低(low)两组，然后对高、低两组绘制生存曲线(Kaplan–Meier analysis)进行比较。如图5所示，KMT1A的表达量和膀胱癌患者的总体平均生存时间呈负相关性。卡普兰-迈耶曲线分析KMT1A高表达膀胱癌患者和KMT1A低表达膀胱癌患者的总体平均生存时间(对数秩和检验)，KMT1A高表达组的膀胱癌患者的总体平均生存时间显著长于KMT1A低表达组的膀胱癌患者。

利用KMT1A的差异表达对膀胱癌组织进行筛查

选取100对人膀胱癌组织和癌旁组织(由昆明医科大学第二附属医院提供)，按天根的培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(DP430)的步骤提取总RNA，再利用Nanodrop 2000测定RNA浓度和纯度。采用北京康润诚业生物科技有限公司StarScript II One-step RT-PCR试剂盒(货号A215-01)对提取的总RNA反转录合成cDNA。采用北京康润诚业生物科技有限公司2×RealStar Power SYBR Mixture UNG荧光定量试剂盒(货号A312)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。KMT1A的检测引物如下：

KMT1A-F：5’-ATGCCGCCTACTATGGCAAC-3’

KMT1A-R：5’-AAAGTTGGAGTCCATGCGGG-3’

PCR条件如下：

荧光定量PCR检测膀胱癌组织样本中组蛋白甲基转移酶KMT1A的表达量，产物扩增曲线在反应的早期就可能被监测到，起始点表示产物聚集的对数期开始，该期产物的荧光信号呈指数增长，检测仪将此点定义为Ct值。根据Ct值可以预测靶基因产物的起始浓度，即在PCR反应条件相同的情况下，靶基因起始浓度越大，则Ct值就越低。将癌旁对照组均值的95％可信区间的上界(X±SD)作为本诊断实验的Cut-off值，其值为18.06。在此分界值条件下，本诊断实验的灵敏度为91％，特异度为80％。如图6所示，本发明的膀胱癌检测试剂盒，在100对膀胱癌和癌旁组织中检测KMT1A基因的表达量，结果表明KMT1A在膀胱癌中的表达量显著高于癌旁组织，.P<0.01。

表1.利用本发明试剂盒筛查膀胱癌

临床灵敏度可用来衡量某种试验检测出有病者的能力，灵敏度是将实际有病的人正确地判定为真阳性的比例。本实验灵敏度＝91/(91+9)×％＝91％。临床特异度是衡量试验正确地判定无病者的能力，特异度是将实际无病的人正确地判定为真阴性的比例。本实验特异度＝82/(18+82)×％＝83％。

因此，组蛋白甲基转移酶KMT1A作为全新的膀胱癌诊断的肿瘤标志物，而且有望成为膀胱癌治疗靶点，具有十分重要的科学意义和生理意义。

SEQUENCE LISTING

<110> 杨昭

<120> 一种膀胱癌筛选检测试剂盒

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgccgccta ctatggcaac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaagttggag tccatgcggg 20

<210> 3

<211> 423

<212> PRT

<213> 组蛋白甲基转移酶KMT1A蛋白的氨基酸序列

<400> 3

Met Val Gly Met Ser Arg Leu Arg Asn Asp Arg Leu Ala Asp Pro Leu

1 5 10 15

Thr Gly Cys Ser Val Cys Cys Lys Ser Ser Trp Asn Gln Leu Gln Asp

20 25 30

Leu Cys Arg Leu Ala Lys Leu Ser Cys Pro Ala Leu Gly Ile Ser Lys

35 40 45

Arg Asn Leu Tyr Asp Phe Glu Val Glu Tyr Leu Cys Asp Tyr Lys Lys

50 55 60

Ile Arg Glu Gln Glu Tyr Tyr Leu Val Lys Trp Arg Gly Tyr Pro Asp

65 70 75 80

Ser Glu Ser Thr Trp Glu Pro Arg Gln Asn Leu Lys Cys Val Arg Ile

85 90 95

Leu Lys Gln Phe His Lys Asp Leu Glu Arg Glu Leu Leu Arg Arg His

100 105 110

His Arg Ser Lys Thr Pro Arg His Leu Asp Pro Ser Leu Ala Asn Tyr

115 120 125

Leu Val Gln Lys Ala Lys Gln Arg Arg Ala Leu Arg Arg Trp Glu Gln

130 135 140

Glu Leu Asn Ala Lys Arg Ser His Leu Gly Arg Ile Thr Val Glu Asn

145 150 155 160

Glu Val Asp Leu Asp Gly Pro Pro Arg Ala Phe Val Tyr Ile Asn Glu

165 170 175

Tyr Arg Val Gly Glu Gly Ile Thr Leu Asn Gln Val Ala Val Gly Cys

180 185 190

Glu Cys Gln Asp Cys Leu Trp Ala Pro Thr Gly Gly Cys Cys Pro Gly

195 200 205

Ala Ser Leu His Lys Phe Ala Tyr Asn Asp Gln Gly Gln Val Arg Leu

210 215 220

Arg Ala Gly Leu Pro Ile Tyr Glu Cys Asn Ser Arg Cys Arg Cys Gly

225 230 235 240

Tyr Asp Cys Pro Asn Arg Val Val Gln Lys Gly Ile Arg Tyr Asp Leu

245 250 255

Cys Ile Phe Arg Thr Asp Asp Gly Arg Gly Trp Gly Val Arg Thr Leu

260 265 270

Glu Lys Ile Arg Lys Asn Ser Phe Val Met Glu Tyr Val Gly Glu Ile

275 280 285

Ile Thr Ser Glu Glu Ala Glu Arg Arg Gly Gln Ile Tyr Asp Arg Gln

290 295 300

Gly Ala Thr Tyr Leu Phe Asp Leu Asp Tyr Val Glu Asp Val Tyr Thr

305 310 315 320

Val Asp Ala Ala Tyr Tyr Gly Asn Ile Ser His Phe Val Asn His Ser

325 330 335

Cys Asp Pro Asn Leu Gln Val Tyr Asn Val Phe Ile Asp Asn Leu Asp

340 345 350

Glu Arg Leu Pro Arg Ile Ala Phe Phe Ala Thr Arg Thr Ile Arg Ala

355 360 365

Gly Glu Glu Leu Thr Phe Asp Tyr Asn Met Gln Val Asp Pro Val Asp

370 375 380

Met Glu Ser Thr Arg Met Asp Ser Asn Phe Gly Leu Ala Gly Leu Pro

385 390 395 400

Gly Ser Pro Lys Lys Arg Val Arg Ile Glu Cys Lys Cys Gly Thr Glu

405 410 415

Ser Cys Arg Lys Tyr Leu Phe

420

Claims

1.一种用于膀胱癌预后分析的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测膀胱癌相关基因KMTIA的cDNA的寡核苷酸；所述试剂盒包括特异性引物对，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为ATGCCGCCTACTATGGCAAC，所述下游引物序列为AAAGTTGGAGTCCATGCGGG。

2.根据权利要求1所述一种用于膀胱癌预后分析的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准DNA模板和PCR反应液，所述标准DNA模板为KMT1A基因的cDNA模板。

3.根据权利要求2所述一种用于膀胱癌预后分析的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒还包括荧光染料。

4.根据权利要求3所述一种用于膀胱癌预后分析的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液为荧光定量PCR反应液，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及PCR缓冲液。

5.根据权利要求4所述一种用于膀胱癌预后分析的试剂盒，其特征在于，所述Taq酶为热启动酶。

6.根据权利要求3所述一种用于膀胱癌预后分析的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为SYBR Green II。

7.根据权利要求1所述一种用于膀胱癌预后分析的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。