CN109266741B - 一种膀胱癌干细胞鉴定的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定膀胱癌干细胞的试剂盒，其包括检测KMT1A基因表达的试剂。本发明还公开了筛选或鉴定膀胱癌干细胞的方法以及检测KMT1A基因表达试剂的应用。与正常膀胱干细胞、正常膀胱非干细胞和膀胱癌非干细胞相比，KMT1A基因仅在膀胱癌干细胞中高表达，因此上述试剂盒灵敏度高，特异性好，具有良好的应用前景。

Description

一种膀胱癌干细胞鉴定的试剂盒及其应用
技术领域
本发明总地涉及肿瘤分子生物学领域，具体涉及筛选或鉴定肿瘤干细胞的试剂盒与方法以及检测KMT1A基因表达试剂的应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤。在我国，膀胱癌的发病率为6.61/10万，在泌尿系统肿瘤中排第一位。膀胱癌发生的危险因素主要包括吸烟、芳香胺类致癌物、砒霜、膀胱的慢性感染、电离辐射和非那西汀类药物的滥用。根据病理特征，膀胱癌在临床上分为浅表型(70％)和浸润型(30％)两大类。极易复发是膀胱癌最大的临床问题。
近年来，肿瘤干细胞学说受到肿瘤研究者的高度关注和认同。肿瘤干细胞假说认为肿瘤中存在着一小部分具有类似干细胞功能的细胞，其具有自我更新和可塑性潜能，在肿瘤形成和生长中起着决定性作用。最新的研究已证明，肿瘤干细胞存在于乳腺癌、肝癌和白血病等多种癌症中，其具有极强的致瘤、耐药和转移能力。现有的治疗措施尚无法针对肿瘤干细胞发挥作用，这可能是导致肿瘤耐药和复发的主要原因。
目前已经报道的膀胱癌干细胞的标志物包括基底层细胞标志物CK5、CK14、CK17、67kD层黏连蛋白受体(67LR)、CD44、CD47和CD90。上述膀胱癌干细胞的标志物，在正常膀胱干细胞中也高表达，不是膀胱癌治疗的理想靶点。相比较于膀胱癌非干细胞、正常膀胱干细胞和正常膀胱非干细胞，尚无膀胱癌干细胞特异的标志物。因此，亟需开发和鉴定高特异性的标志物用于膀胱癌干细胞的鉴定。
发明内容
为了解决上述问题，发明人利用表达谱芯片技术，通过分析膀胱癌干细胞和非干细胞表达差异的基因，筛选出在人膀胱癌干细胞和人膀胱癌干细胞球中显著高表达的基因——组蛋白甲基转移酶KMT1A。
KMT1A的转录区域位于X染色体，其mRNA全长1272bp。与膀胱癌非干细胞、正常膀胱干细胞和正常膀胱非干细胞相比，KMT1A的mRNA和蛋白表达水平仅在膀胱癌干细胞中显著高表达。KMT1A基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
据此，本发明提供了鉴定膀胱癌干细胞的试剂盒及检测KMT1A基因表达试剂的应用。
本发明的第一方面提供一种鉴定膀胱癌干细胞的试剂盒，其包括检测KMT1A基因表达试剂。
优选地，根据上述的试剂盒，其中，所述检测KMT1A基因表达试剂为检测KMT1AmRNA或KMT1A蛋白的试剂。
更优选地，根据上述的试剂盒，其中，所述检测KMT1A mRNA的试剂为Northern-blot检测方法用试剂、原位杂交检测方法用试剂、表达谱芯片检测方法用试剂或荧光定量PCR检测方法用试剂。优选地，所述检测KMT1A mRNA的试剂包括扩增KMT1A mRNA或其反转录的cDNA的特异性引物对。更优选地，所述扩增KMT1A mRNA反转录的cDNA的特异性引物对如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
再优选地，根据上述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括如SEQ ID NO.1所示的引物、SEQ ID NO.2所示的引物、PCR反应液和标记物，所述标记物为荧光染料SYBR或探针。优选地，所述PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶和PCR缓冲液，所述荧光染料SYBR为SYBR GreenII，所述探针为TaqMan探针、分子信标、双杂交探针或复合探针。其中，所述试剂盒还可以包括作为阳性对照的KMT1A DNA模板。
或更优选地，根据上述的试剂盒，其中，所述检测KMT1A蛋白的试剂为Western-Blot检测方法用试剂、免疫染色检测方法用试剂或ELISA检测方法用试剂。优选地，所述检测KMT1A蛋白的试剂包括KMT1A抗体。
本发明的第二方面提供一种筛选或鉴定膀胱癌干细胞的方法，所述方法包括：
ⅰ)检测测试样品中KMT1A基因的表达，
ⅱ)步骤ⅰ)的检测结果与对照样品中KMT1A基因的表达或与预定的参照标准进行比较，
ⅲ)通过步骤ⅱ)的比较结果筛选或鉴定膀胱癌干细胞。
本发明的第三方面提供检测KMT1A基因表达的试剂在制备筛选或鉴定膀胱癌干细胞的产品中的应用。
优选地，根据上述的应用，其中，KMT1A基因的表达量与膀胱癌细胞的存在相关，所述膀胱癌细胞优选为膀胱癌干细胞。
更优选地，根据上述的应用，其中，筛选或鉴定膀胱癌干细胞包括：检测测试样品中KMT1A基因的表达；检测结果与对照样品中KMT1A基因的表达或与预定的参照标准进行比较；通过比较结果筛选或鉴定膀胱癌干细胞。
其中，测试样品和对照样品可以为通过活组织检查获得的组织块，优选为组织切片或细胞。
其中，所述对照样品可以是膀胱癌非干细胞、正常膀胱干细胞、正常膀胱非干细胞的样品，或来自经诊断为未患有膀胱癌的患者的样品。所述参照标准可以是参照值，也可以是参照范围，其可以基于经检测为膀胱癌非干细胞、正常膀胱干细胞、正常膀胱非干细胞的KMT1A基因的表达量进行确定，可以基于经诊断未患有膀胱癌的患者的KMT1A基因的表达量进行确定，可以基于经检测为膀胱癌干细胞的KMT1A基因的表达量进行确定，也可以基于经诊断患有膀胱癌的患者的KMT1A基因的表达量进行确定。
在一个实施方案中，上述筛选或鉴定膀胱癌干细胞包括：
ⅰ)检测测试样品中KMT1A基因表达；
ⅱ)检测对照样品中KMT1A基因表达；
ⅲ)比较步骤ⅰ)和步骤ⅱ)的检测结果以判断所述测试样品是否为膀胱癌干细胞。
在一个实施方案中，上述筛选或鉴定膀胱癌干细胞采用荧光定量PCR检测方法测试样品和对照样品的KMT1A基因表达，具体包括以下步骤：
ⅰ)提取测试样品和对照样品的总RNA；
ⅱ)将步骤ⅰ)提取的总RNA分别反转录合成cDNA；
ⅲ)以ⅱ)合成的cDNA为模板分别进行荧光定量PCR扩增以获得Ct值；
ⅳ)通过对照样品的Ct值确定参照标准，所述参照标准可以为对照样品的Ct值平均数或Ct值平均数的置信区间的上下限，所述置信区间优选为95％的置信区间；
ⅴ)通过比较测试样品的Ct值和参照标准以判断测试样品是否为膀胱癌干细胞。
再优选地，根据上述的应用，其中，所述检测KMT1A基因表达的试剂为定量和/或定性检测KMT1A基因表达的试剂。
或再优选地，根据上述的应用，其中，所述检测KMT1A基因表达的试剂为检测KMT1AmRNA或KMT1A蛋白的试剂。优选地，所述检测KMT1A mRNA的试剂为Northern-Blot检测方法用试剂、原位杂交检测方法用试剂、表达谱芯片检测方法用试剂或荧光定量PCR检测方法用试剂，所述检测KMT1A蛋白的试剂为Western-Blot检测方法用试剂、免疫染色检测方法用试剂或ELISA检测方法用试剂。本发明利用KMT1A鉴定膀胱癌干细胞的方法特异性强，因为与正常膀胱干细胞、正常膀胱非干细胞和膀胱癌非干细胞相比，KMT1A仅在膀胱癌干细胞中高表达。本发明为膀胱癌干细胞的鉴定提供新的方法，并为膀胱癌的靶向治疗提供新的治疗靶点。
本发明提供的鉴定膀胱癌干细胞的试剂盒灵敏度高，特异性好，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中利用荧光定量PCR的方法，在膀胱癌干细胞、膀胱癌非干细胞、正常膀胱干细胞和正常膀胱非干细胞中检测KMT1A基因的表达量，*为P<0.05，**为P<0.01；
图2为实施例2中利用荧光定量PCR的方法，膀胱癌干细胞与膀胱癌非干细胞中检测KMT1A基因的表达量，其中小球为膀胱癌干细胞，非小球为膀胱癌非干细胞，*为P<0.05；
图3为实施例3中利用免疫印迹的方法，在4对膀胱癌干细胞与膀胱癌非干细胞中检测KMT1A基因的表达量；
图4为实施例4中采用实施例1提供的膀胱癌干细胞鉴定试剂盒，在50对膀胱癌干细胞与膀胱癌非干细胞中检测KMT1A基因的表达量，**为P<0.01。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1:人膀胱癌干细胞和非干细胞中KMT1A基因的荧光定量PCR分析
一、一种膀胱癌干细胞鉴定试剂盒
所述试剂盒用于检测KMT1A基因的cDNA，为荧光定量PCR检测试剂盒。
所述试剂盒包括特异性引物对，所述特异性引物对为如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No.2所示的下游引物。所述试剂盒还包括作为阳性对照的KMT1A DNA模板、荧光定量PCR反应液和荧光染料。所述PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及PCR缓冲液。所述Taq酶为热启动酶。所述荧光染料为SYBR Green II。
二、分选膀胱癌干细胞和非干细胞
收集4例膀胱癌标本。原代正常膀胱组织和膀胱癌组织临床切除后，置于含双抗的1640培养基中保存，4℃运输。到达实验室之后，用无菌剪刀剪碎原代组织，留取少部分固定在4％多聚甲醛(病理用)。然后用0.2％胶原酶Ⅱ重悬减碎的原代组织，在37℃消化2-4h。然后细胞悬液过滤筛网获得单细胞悬液。
正常细胞用1ml 1640培养基重悬，加入5μl pan-CK抗体和10μl CD44抗体。膀胱癌细胞用2ml 1640培养基重悬，加入20μl CD44抗体和10ulBCMab1抗体。4℃染色1h，PBS洗涤2次，1ml 1640培养基重悬细胞，用流式细胞仪分选正常膀胱干细胞(pan-CK+CD44+)和正常膀胱非干细胞(pan-CK+CD44-)以及膀胱癌干细胞(BCMab1+CD44+)和膀胱癌非干细胞(BCMab1-CD44-)。
按照天根的培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(DP430)中的步骤提取上述细胞的总RNA。
三、反转录合成cDNA模板
取上述4例正常膀胱干细胞、正常膀胱非干细胞、膀胱癌干细胞和膀胱癌非干细胞共16个样品的总RNA，第一步打开RNA二级结构，反应体系及条件如下：
试剂 用量
Oligo dT 1μl
RNA 1-2μg
DEPC水 补齐至20μl
将上述组分混合后70℃反应5min，然后冰浴10min。
第二步反转录反应，反应体系及条件如下：
试剂 用量
2.5mM dNTP 2.5μl
5*RT buffer 6.0μl
HPR(RNase抑制剂) 0.6μl
MLV(逆转录酶) 0.4μl
将上述组分混合均匀后42℃孵育1h，然后70℃灭活10min，即得到cDNA。
四、荧光定量PCR检测KMT1A基因的表达量
采用上述膀胱癌干细胞鉴定试剂盒，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。
荧光定量PCR的体系和条件如下：
荧光定量PCR体系
试剂 用量
2×PCR反应液 10μl
引物 各1μl
DNA模板 1μl
RNase free ddH<sub>2</sub>O 补齐至20μl
荧光定量PCR条件如下：
94℃10分钟；然后进行以下循环：94℃30秒钟，60℃30秒钟，72℃30秒钟，共进行40个循环；72℃10分钟；22℃保存。
五、荧光定量PCR结果
设定一个荧光强度阈值以获得各样品的Ct值，数据分析方法使用2-△△Ct法。荧光定量PCR结果如图1所示，正常膀胱干细胞中KMT1A基因的表达是正常膀胱非干细胞的1.15倍，两者之间没有显著差异；膀胱癌干细胞和膀胱癌非干细胞中KMT1A基因的表达量均显著高于与正常膀胱干细胞和正常膀胱非干细胞；而膀胱癌干细胞中KMT1A基因的表达量是膀胱癌非干细胞的2.67倍，显著高于膀胱癌非干细胞。因此，KMT1A基因在膀胱癌细胞中高表达，并在膀胱癌干细胞中显著富集。
实施例2:人膀胱癌干细胞和非干细胞中KMT1A基因的荧光定量PCR分析
一、获得膀胱癌细胞：
收集4例膀胱癌标本，利用实施例1中的方法，处理膀胱癌组织，获得单细胞。
二、干细胞成球培养：
准确计数膀胱癌细胞的数量，并用PBS洗涤一次。然后将104细胞接种于干细胞成球培养基(DMEM/F12培养基中，添加20ng/ml人重组表皮生长因子、20ng/ml人重组生长因子、2％B27和1％N2)中培养。每隔2-3天补加一次新鲜培养基，直至球体形成。其中，形成细胞球的为膀胱癌干细胞，未形成细胞球的为膀胱癌非干细胞。
三、RNA提取：
收集4对形成干细胞球的细胞和未形成干细胞球的细胞，分别命名为#3、#5、#6和#7，利用实施例1中的方法提取RNA。
四、荧光定量PCR检测KMT1A基因的表达量：
利用实施例1中的方法，将步骤三的RNA反转录合成cDNA，并利用荧光定量PCR检测干细胞球和干细胞球中KMT1A基因的表达量。
五、荧光定量PCR结果：
设定一个荧光强度阈值以获得各样品的Ct值，数据分析方法使用2-△△Ct法。荧光定量PCR结果如图2所示，KMT1A基因在膀胱癌干细胞中显著高表达，其表达量是非干细胞的3.64倍。
实施例3:人膀胱癌干细胞和非干细胞中KMT1A蛋白的免疫印迹(Western Blot，WB)分析
一、细胞收集和前处理：
按照实施例1中的方法，收集4例样品中膀胱癌干细胞和膀胱癌非干细胞，并准确计数。将2×105细胞溶解于16μl ddH2O，并加入4μl 5×loading，混匀，沸水浴10min。该4例样品分别命名为#17、#20、#3和#6。
二、蛋白电泳：
配制10％的分离胶(1.90ml H2O，1.70ml 30％Acrylamide，1.30ml1.50M Tris-HCl(PH＝8.8)，0.05ml 10％SDS，0.05ml 10％过硫酸铵，2.00μl TEMED)和4％的浓缩胶(2.70ml H2O，0.67ml 30％Acrylamide，0.50ml 1.0M Tris-HCl(PH＝6.8)，0.04ml 10％SDS，0.04ml 10％过硫酸铵，4.00μl TEMED)，将煮好的细胞样品进行电泳跑胶，80V，30min，然后120V，90min。以β-actin蛋白作为内参。
三、蛋白转膜：
剪下同样大小的0.45μM的PVDF膜，以甲醇浸泡3分钟。后水洗2分钟。剪下6张同样大小的滤纸，与PVDF膜、胶同时以转移缓冲液平衡15分钟。并按照转膜装置的说明放置纸、膜、胶、纸(由下往上)，转膜电流为300mA，2小时。
四、抗体孵育：
将KMT1A抗体，用7％的脱脂奶粉，稀释200倍。4℃孵育含有目的蛋白的膜，过夜，第二天，用TBST(Tris Buffered saline Tween，10mM Tris-Hcl；150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤三次，每次5min。然后孵育1:5000稀释的小鼠二抗，室温反应1h，TBST洗涤三次。
五、曝光：
将含有目的蛋白的膜用滤纸沥干，使用ECL发光液，暗处反应1min。然后将膜置于曝光夹中，暗室中曝光，采集数据。
六、检测结果：
将采集的WB曝光结果，利用EPSON EXPRESSION11000XL扫描仪扫描并保存为TIFF图片格式，扫描结果如图3所示。在此基础上，利用Image J软件，计算膀胱癌干细胞和非干细胞中KMT1A蛋白的灰度值。相对于膀胱癌非干细胞(KMT1A平均灰度值：4445)，KMT1A蛋白在膀胱癌干细胞中(KMT1A平均灰度值：22728)显著高表达。
实施例4:利用KMT1A的差异表达对膀胱癌干细胞进行鉴定。
选取50例人膀胱癌组织(由昆明医科大学第二附属医院提供)，分选膀胱癌干细胞和非干细胞，并按天根的培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(DP430)的步骤提取总RNA，再利用Nanodrop 2000测定RNA浓度和纯度。对提取的总RNA进行反转录，合成cDNA。采用本发明实施例1提供的膀胱癌干细胞鉴定试剂盒，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。
荧光定量PCR扩增的体系和条件与实施例1所用体系和条件相同。
检测结果如图4和表1所示。
如图4所示，荧光定量PCR检测膀胱癌干细胞和非干细胞中组蛋白甲基转移酶KMT1A的表达量，产物扩增曲线在反应的早期就可能被监测到，起始点表示产物聚集的对数期开始，该期产物的荧光信号呈指数增长，检测仪将此点定义为Ct值。根据Ct值可以预测靶基因产物的起始浓度，即在PCR反应条件相同的情况下，靶基因起始浓度越大，则Ct值就越低。我们将膀胱癌非干细胞的均值的95％可信区间的上界(X±SD)作为本诊断实验的临界值(Cut-off值)，其值为18.22。检测结果如表1所示，在此分界值条件下，本诊断实验的灵敏度为92％，特异度为86％。
表1.利用试剂盒鉴定膀胱癌干细胞
Figure BDA0001370735600000091
临床灵敏度可用来衡量某种试验检测出有病者的能力，灵敏度是将实际有病的人正确地判定为真阳性的比例。本实验灵敏度＝46/(46+4)×％＝92％。临床特异度是衡量试验正确地判定无病者的能力，特异度是将实际无病的人正确地判定为真阴性的比例。本实验特异度＝43/(43+7)×％＝86％。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种膀胱癌干细胞鉴定的试剂盒及其应用
<130> 170382CI
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctgccctcg gtatctctaa g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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gaccccgtgg acatggagag cacccgcatg gactccaact ttggcctggc tgggctccct 1200
ggctccccta agaagcgggt ccgtattgaa tgcaagtgtg ggactgagtc ctgccgcaaa 1260
tacctcttct ag 1272

Claims (10)

1.检测KMT1A基因表达的试剂盒在制备筛选或鉴定膀胱癌干细胞的产品中的应用，其特征在于，试剂盒包括检测KMT1A基因表达的试剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测KMT1A基因表达的试剂为检测KMT1A mRNA或KMT1A蛋白的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，
所述检测KMT1A mRNA的试剂为Northern-blot检测方法用试剂、原位杂交检测方法用试剂、表达谱芯片检测方法用试剂或荧光定量PCR检测方法用试剂；
所述检测KMT1A蛋白的试剂为Western-Blot检测方法用试剂、免疫染色检测方法用试剂或ELISA检测方法用试剂。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，
所述检测KMT1A mRNA的试剂包括扩增KMT1A mRNA或其反转录的cDNA的特异性引物对。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述扩增KMT1A mRNA反转录的cDNA的特异性引物对如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测KMT1A蛋白的试剂包括KMT1A抗体。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括如SEQ ID NO.1所示的引物、SEQ ID NO.2所示的引物、PCR反应液和标记物，所述标记物为荧光染料SYBR或探针；
所述PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶和PCR缓冲液，所述荧光染料SYBR为SYBR GreenII，所述探针为TaqMan探针、分子信标、双杂交探针或复合探针。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，KMT1A基因的表达量与膀胱癌细胞的存在相关，所述膀胱癌细胞为膀胱癌干细胞。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述筛选或鉴定包括如下步骤：
ⅰ）检测测试样品中KMT1A基因的表达；
ⅱ）步骤ⅰ）的检测结果与对照样品中KMT1A基因的表达或与预定的参照标准进行比较；
ⅲ）通过步骤ⅱ）的比较结果筛选或鉴定膀胱癌干细胞。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述检测KMT1A基因表达的试剂为定量和/或定性检测KMT1A基因表达的试剂。
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