CN109666746A - 用于检测人类ros1基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法,引物、探针,包括:在如下ROS1基因融合突变位点的上游基因外显子:SLC34A2‑exon4/13、CD74‑exon5/6/7、SDC4‑exon2/4、EZR‑exon10、LRIG3‑exon16、TPM3‑exon5/8、TFG exon5及GOPC‑exon4/8上分别设计上游引物;在ROS1exon 32/34/35/36上设计下游共用引物、分子信标探针和TaqMan‑MGB探针,5’端标记物标记;以人类HBB基因为内控基因,设计特异性引物和TaqMan检测探针,5’端标记物标记;本发明使用特异引物、TaqMan‑MGB和分子信标探针进行检测,使试剂盒灵敏度高,特异性高,有效避免假阳性。
Description
技术领域
本发明涉及体外分子诊断领域,特别是一种用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法。
背景技术
当今世界肺癌的发病率和死亡率位居恶性肿瘤第一,对人类健康和生命造成了严重的威胁,肺癌中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者约80-85%。活性氧基团基因1(reactive oxygen species 1,ROS1)融合是非小细胞肺癌常见的基因突变,在肺腺癌病例中约占2.4%。ROS1基因编码一种受体酪氨酸激酶,是继EGFR基因突变和ALK基因融合之后又一明确的非小细胞肺癌药物治疗靶标。目前已发现ROS1可与多个基因发生融合,如CD74、SLC34A2、EZR、LRIG3、SDC4、TPM3、TFG、GOPC、CCDC6、MSN、CLTC、TMEM106B和TPD52L1等,发生ROS1融合后会持续激活ROS1酪氨酸激酶区及其下游PI3K/AKT、RAS/MAPK等信号通路,从而引起肿瘤的发生。克挫替尼,一种靶向ALK和MET的酪氨酸激酶抑制剂,于2016年3月11日被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于晚期转移性ROS1重排,对ROS1易位的肺癌患者有较好的疗效。应用可靠的基因重排检测筛选方法是鉴别适合肿瘤靶向治疗的关键。
目前现有的人类ROS1融合基因突变的检测方法主要是荧光原位杂交(FISH)和逆转录荧光PCR技术(RT-qPCR)。荧光原位杂交检测探针昂贵,实验步骤繁琐,假阴性率高,准确性低。对试验人员要求高,检测结果判读主观性和专业性强,不适于推广使用。RT-qPCR具有操作简单、检测快速、灵敏度高、成本低、结果判断简单等优点,而且适用的样本范围较广,适合于临床应用推广。但是目前现有试剂盒大多采用两步法RT-PCR,易交叉污染,且覆盖的ROS1融合突变谱较窄,容易造成漏检,且假阳性、假阴性率较高,灵敏度低,因此临床实践中难以推广。
本发明试剂盒建立在一步法多重RT-PCR基础上,利用新型探针分子信标技术,建立了一种目前ROS1融合检测位点更全、检测快速准确、高灵敏、高特异性的ROS1融合基因的筛查工具和筛查方法。
分子信标通常是一个具有发卡结构的寡核苷酸序列,长度在25至40bp,包括环区域和茎区域,环区域与靶序列特异结合,茎区域自身互补形成发卡结构,探针5'端标记荧光报告基团,3'端修饰淬灭剂。室温条件下,荧光报告基团与淬灭基团接近,根据荧光共振能量转移原理,荧光基团发出的光被淬灭基团淬灭;在PCR退火阶段,根据热力学原理,信标将优先和靶序列结合,发夹结构被打开,荧光恢复,可在此阶段进行荧光检测。由于分子信标杂交前后环状区与目标分子的双链结构之间存在热力学平衡关系,使它的杂交特异性明显高于常规的线性探针。
市场的试剂盒及检测方法具有ROS1突变谱覆盖度低,检测灵敏度低,假阳性等问题,本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法,本发明的引物和探针可以涵盖多达20种ROS1融合形式,本发明建立的一步法逆转录反应体系,简化了操作、避免了污染;使用特异引物、TaqMan-MGB和分子信标探针进行检测,试剂盒可以检测出低至5-10拷贝的阳性模板,灵敏度高,特异性高,有效避免假阳性;将引物探针分组进行反应,提高检测质量。
为了实现上述目标,本发明采用如下的技术方案:
用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针,包括:
在如下ROS1基因融合突变位点的上游基因外显子:SLC34A2-exon4/13、CD74-exon5/6/7、SDC4-exon2/4、EZR-exon10、LRIG3-exon16、TPM3-exon5/8、TFG exon5及GOPC-exon4/8上分别设计上游引物;
在ROS1exon 32/34/35/36上设计下游共用引物、分子信标探针和TaqMan-MGB探针,5’端标记物标记;
以人类HBB基因为内控基因,设计特异性引物和TaqMan检测探针,5’端标记物标记。
前述的用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针,包括四组引物探针组合;
第一组引物探针的融合位点包括:SL14del;R32,SL4;R32,C6;R32,SD2;R32,SD4;R32,C7;R32;
第二组引物探针的融合位点包括:SL14del;R34,SL4;R34,C6;R34,SD4;R34,EZ10;R34,SD2;R34,C5;R34;
第三组引物探针的融合位点包括:L16;R35,T8;R35,G8;R35,C6;R35,TP5;R35,TF5;R35;
第四组引物探针的融合位点包括:G4;R36。
前述的用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针,
上游引物包括:SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.14对应于ROS1融合基因上游8种基因序列的引物及其组合。
前述的用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针,下游引物包括:SEQ IDNO.15~SEQ ID NO.18对应于ROS1的4个外显子的引物及其组合。
前述的用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针,其特征在于,探针包括:SEQID NO.19~SEQ ID NO.22对应于ROS1的4个外显子序列的探针及其组合。
前述的用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针,内控基因HBB的引物探针包括:SEQ ID NO.23~SEQ ID NO.25对应的序列及其组合。
前述的用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针,标记物包括:FAM荧光基团或HEX荧光基团。
用于检测人类ROS1基因融合突变的试剂盒,包括:
模板,以合成的20种阳性质粒和RNA样品为模板;
PCR检测体系,包括:反应液I,反应液II、反应液III、反应液IV;
反应液I包括:
反应液II包括:
反应液III包括:
反应液IV包括:
第一组引物探针的融合位点包括:SL14del;R32,SL4;R32,C6;R32,SD2;R32,SD4;R32,
C7;R32;
第二组引物探针的融合位点包括:SL14del;R34,SL4;R34,C6;R34,SD4;R34,EZ10;R34,
SD2;R34,C5;R34;
第三组引物探针的融合位点包括:L16;R35,T8;R35,G8;R35,C6;R35,TP5;R35,TF5;R35;
第四组引物探针的融合位点包括:G4;R36;
内控基因HBB;
阴性对照。
用于检测人类ROS1基因融合突变的试剂盒的检测方法,包括如下步骤:
引物探针设计,
在如下ROS1基因融合突变位点的上游基因外显子:SLC34A2-exon4/13、CD74-exon5/6/7、SDC4-exon2/4、EZR-exon10、LRIG3-exon16、TPM3-exon5/8、TFG exon5及GOPC-exon4/8上分别设计上游引物;
在ROS1exon 32/34/35/36上设计下游共用引物、分子信标探针和TaqMan-MGB探针,5’端FAM荧光基团标记;
以人类HBB基因为内控基因,设计特异性引物和TaqMan检测探针,5’端HEX荧光基团标记;
基因组RNA提取,
使用RNA提取试剂盒提取RNA,经紫外分光光度计检测提取质量,所提RNA的A260/A280在1.8~2.0之间;
一步法逆转录PCR进行检测,
PCR检测体系,包括:反应液I,反应液II、反应液III、反应液IV;
反应液I包括:
反应液II包括:
反应液III包括:
反应液IV包括:
第一组引物探针的融合位点包括:SL14del;R32,SL4;R32,C6;R32,SD2;R32,SD4;R32,C7;R32;
第二组引物探针的融合位点包括:SL14del;R34,SL4;R34,C6;R34,SD4;R34,EZ10;R34,SD2;R34,C5;R34;
第三组引物探针的融合位点包括:L16;R35,T8;R35,G8;R35,C6;R35,TP5;R35,TF5;R35;
第四组引物探针的融合位点包括:G4;R36;
内控基因HBB和阴性对照对样本提取质量和反应体系进行质控,根据标记物指示阳性结果;
质控标准:a)阳性对照:FAM通道有扩增曲线;b)阴性对照:NTC在两个通道均无扩增曲线,野生型样本HEX通道有正常曲线;
结果判读:
a)当HEX通道有扩增曲线,FAM通道有扩增曲线,则样品为ROS1融合阳性;
b)当HEX通道有扩增曲线,FAM通道无扩增曲线,则为ROS1融合阴性或低于本试剂盒的检测下限或标本质量原因或为本试剂盒未覆盖的其他融合形式。
前述的用于检测人类ROS1基因融合突变的试剂盒的检测方法,以合成的20种阳性质粒和野生型石蜡包埋组织切片提取的RNA样品为模板,验证阳性质粒标准品,同时考察检测体系的特异性、灵敏度和重复性;具体步骤如下:
模板准备:将合成的阳性质粒用Tris-HCL溶解,定量稀释到40copies/μl、20copies/μl、10copies/μl、5copies/μl、2copies/μl、1copies/μl六个浓度梯度;提取野生型人类基因组RNA样品,备用;
PCR检测体系的配制,
PCR检测体系,包括:反应液I,反应液II、反应液III、反应液IV;
反应液I包括:
反应液II包括:
反应液III包括:
反应液IV包括:
第一组引物探针的融合位点包括:SL14del;R32,SL4;R32,C6;R32,SD2;R32,SD4;R32,C7;R32;
第二组引物探针的融合位点包括:SL14del;R34,SL4;R34,C6;R34,SD4;R34,EZ10;R34,SD2;R34,C5;R34;
第三组引物探针的融合位点包括:L16;R35,T8;R35,G8;R35,C6;R35,TP5;R35,TF5;R35;
第四组引物探针的融合位点包括:G4;R36;
反应程序设置,
95℃5min,1个循环;50℃30min,1个循环;95℃5min,1个循环;95℃15s,60℃40s,10个循环(不采光);95℃15s,58℃40s(采光),45个循环;
加样,
阳性质粒验证:取40copies/μl浓度的各阳性质粒,每种质粒做多个复管,设置NTC对照;
特异性实验:取野生型人类基因组RNA样品,每管反应各做多个平行管,设置阳性对照和NTC对照;
灵敏度实验:取40copies/μl、20copies/μl、10copies/μl、5copies/μl、2copies/μl、1copies/μl六个梯度质粒进行检测,每个浓度做多个复管,设置NTC对照;
重复性实验:取40copies/μl、20copies/μl作为模板,每个浓度重复检测多次,计算多次Ct值的重复性,设置NTC对照;
上机,按照设置的反应程序运行实验。
本发明的有益之处在于:
本发明采用了特异引物、TaqMan-MGB、分子信标技术结合多重RT-PCR技术,可以特异检测人类20种ROS1基因融合突变,有效降低了阳性融合漏检率;
本发明的探针引物被分为四组,分4管反应体系,管1检测6种ROS1exon32融合,管2检测7种ROS1exon34融合,管3检测6种ROS1exon35融合,管4检测1种ROS1exon36融合,由于肿瘤组织样本经过福尔马林固定石蜡包埋之后会导致DNA严重降解,并且随着固定时间的延长,降解程度随之加重,片段长度主要分布在200bp以下。本发明通过有效地缩短扩增产物的长度,保证扩增子长度在180bp以下,以克服检材中DNA严重降解对ROS1突变检出的影响,分为四管检测可以保证每个突变位点的扩增子长度最短(97-160bp),以达到最高的扩增效率和检测灵敏度;
特异引物、TaqMan-MGB和分子信标探针通过优化和筛选,达到了较高灵敏度,可以检出低至5-10拷贝的融合突变,且特异性强,有效避免了假阳性结果;
本发明采用一步法RT-PCR,操作简单,避免cDNA污染,利于临床应用推广。
附图说明
图1为E34一管和E34、E35一管体系的7种阳性质粒扩增图;
图2为E35一管和E35、E36一管体系的6种阳性质粒扩增图;
图3为本发明检测阳性质粒SL4;R32融合检测扩增曲线图;
图4为阳性质粒灵敏度分析部分扩增曲线图;
图5为临床样本突变阳性CD6;R32融合扩增曲线图;
图6为临床样本野生型扩增曲线图;
图7为临床样本突变阳性CD6;R32融合测序图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
用于检测人类ROS1基因融合突变的试剂盒的检测方法,包括如下步骤:
一,引物探针设计,
根据COSMIC数据库和相关文献报道的20种ROS1融合形式,如表1:在SLC34A2-exon4/13、CD74-exon5/6/7、SDC4-exon2/4、EZR-exon10、LRIG3-exon16、TPM3-exon5/8、TFGexon5及GOPC-exon4/8上分别设计上游引物,在ROS1exon 32/34/35/36上设计下游共用引物、分子信标探针和TaqMan-MGB探针,5’端标记FAM荧光基团。以人类HBB基因为内控基因,设计特异性引物和TaqMan检测探针,5’端标记HEX荧光基团。按照引物探针设计基本原则设计引物探针。需要说明的是:FAM荧光基团和HEX荧光基团只是标记物的一种实施例,也可以是其他标记物运用在本发明上,不受限制。
上游引物可以是表2中的SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.14对应于ROS1融合基因上游8种基因序列的引物及其组合,下游引物可以是表2中SEQ ID NO.15~SEQ ID NO.18对应于ROS1的4个外显子的引物及其组合,探针可以是表2中SEQ ID NO.19~SEQ ID NO.22对应于ROS1的4个外显子序列的探针及其组合。内控基因HBB的引物探针可以是表2中SEQ IDNO.23~SEQ ID NO.25对应的序列及其组合。引物和探针均由专业公司合成并纯化,合成好的引物和探针使用Tris-HCl(pH 8.3)进行溶解,并用NanoReady紫外分光光度计进行浓度和纯度的测定,最后稀释至50μM,分装并保存在-20℃冰箱。
表1本发明覆盖的20种ROS1基因融合突变
表2:引物探针序列信息
注:黑色加粗的碱基为分子信标的茎结构。
二,基因组RNA提取
新鲜病理组织使用TIANGEN的RNA提取试剂盒进行提取;石蜡包埋组织或切片,建议采用Qiagen公司的FFPE组织RNA提取试剂盒(RNeasy FFPE Kit)进行提取。经紫外分光光度计检测提取质量,所提RNA的A260/A280应在1.8~2.0之间,提取后的RNA应立即进行检测,或溶于0.1%DEPC水中,若暂时不用请于-70℃以下保存。
三,PCR反应体系按表3用量配制反应液I、II、III、IV,每个反应管检测的目标融合如表4。
表3:PCR体系组成
补充DEPC水至25-50μl。
表4:20种融合位点分管检测情况
分4管反应体系,管1检测6种ROS1exon32融合,管2检测7种ROS1exon34融合,管3检测6种ROS1exon35融合,管4检测1种ROS1exon36融合
按表5、表6、表7、表8的用量配制PCR反应液I、II、III、IV,每个反应管检测的目标融合如表3。
表5 PCR体系各成分组成(反应液I)
表6 PCR体系各成分组成(反应液II)
各组分名称 | 终浓度 |
10x Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus) | 1× |
PCR增强剂 | 1.2μl |
dNTPs | 0.25mM |
SL13-F | 0.8μM |
SL4-F | 0.8μM |
C6-F | 0.8μM |
SD2-F | 0.8μM |
SD4-F | 0.8μM |
C5-F | 0.8μM |
EZ10-F | 0.8μM |
HBB-F | 0.8μM |
R34-R | 0.8μM |
HBB-R | 0.8μM |
R34-P | 0.4μM |
HBB-P | 0.4μM |
酶混合液 | 0.6μl |
模板 | 5μl |
总体积 | 25μl |
表7 PCR体系各成分组成(反应液III)
各组分名称 | 终浓度 |
10x Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus) | 1× |
PCR增强剂 | 1.2μl |
dNTPs | 0.25mM |
C6-F | 0.8μM |
L16-F | 0.8μM |
T8-F | 0.8μM |
G8-F | 0.8μM |
TP5 | 0.8μM |
TF5 | 0.8μM |
HBB-F | 0.8μM |
R35-R | 0.8μM |
HBB-R | 0.8μM |
R35-P | 0.4μM |
HBB-P | 0.4μM |
酶混合液 | 0.6μl |
模板 | 5μl |
总体积 | 25μl |
表8 PCR体系各成分组成(反应液IV)
四,反应程序设定,
表9 PCR程序
注:58℃时采集FAM、HEX通道的荧光。
五,结果判读规则
质控标准:a)阳性对照:FAM通道有扩增曲线;b)阴性对照:NTC在两个通道均无扩增曲线,野生型样本HEX通道有正常曲线。
结果判读:
a)当HEX通道有扩增曲线,FAM通道有扩增曲线,则样品为ROS1融合阳性;
b)当HEX通道有扩增曲线,FAM通道无扩增曲线,则为ROS1融合阴性或低于本试剂盒的检测下限或标本质量原因或为本试剂盒未覆盖的其他融合形式。
实验一:ROS1引物探针分管可行性分析实验:
引物探针分管可行性分析:ROS1融合的20种融合位点的分管组合方式和各位点的扩增子长度如表10。分析ROS1基因组成,发现其33号外显子(E32)长度为191bp,无法将34号断裂融合位点与32号断裂融合位点放在一管内检测,因此32号外显子断裂融合位点单独一管检测。34、35、36号外显子(E34,E35,E36)断裂融合位点可以放在一管内检测(第一种组合方式),但是大部分位点的扩增子较长,多在200-300bp范围,不采用此分管方式。第二种组合是分成三管检测,E32一管,E34、E35一管,E36一管,此时扩增子长度均在210bp以下。第三种组合同样是分成三管检测,E32一管,E34一管,E35、E36一管,此时扩增子长度均在228bp以下。第四种组合方式是对E32、E34、E35和E36四个外显子分别检测,此时各位点的扩增子最短,均在160bp及以下。以上分管方式中,后三种均可,但是仍存在部分位点扩增子较长的情况,下面用实验验证哪一种组合方式最好。
表10 ROS1引物探针分管组合方式
注:括号内为不同分管组合时各位点扩增产物长度。
实验设计:
a)准备13种E34,E35号外显子断裂融合阳性质粒,浓度均为300copies/μl;
b)按表3成分和用量分别配制第四种组合E34一管(管2)、第四种组合E35一管(管3)、第二种组合E34、E35一管(管2),第三种组合E35、E36一管(管3),共4管反应体系;
c)每种阳性质粒加入5μl,使用ABI 7500扩增和实时监测,程序按表9进行。
实验分析:
实验结果如图1、图2所示,其中,图1中的黑色曲线表示E34一管体系检测的7种阳性质粒的扩增曲线图,灰色曲线表示E34、E35一管体系检测的E34的7种阳性质粒扩增曲线图,从图1结果可以得出,E34和E35两外显子断裂融合位点使用共用下游引物时会明显增长扩增产物长度,扩增效率降低,因此需要分开检测;图2中黑色曲线表示E35一管体系检测的6种E35阳性质粒的扩增曲线图,灰色曲线表示E35、E36一管体系检测的E35的6种阳性质粒扩增曲线图,从图2结果可以得出,E35和E36两外显子断裂融合位点使用共用下游引物时同样会导致扩增产物较长,明显降低扩增效率,因此也需要分开检测。
实验二,体系性能考察,
以合成的20种阳性质粒和野生型石蜡包埋组织切片提取的RNA样品为模板,验证阳性质粒标准品,同时考察检测体系的特异性、灵敏度和重复性。
a)模板准备:将合成的阳性质粒用Tris-HCL溶解,定量稀释到40copies/μl、20copies/μl、10copies/μl、5copies/μl、2copies/μl、1copies/μl六个浓度梯度;提取野生型人类基因组RNA样品,备用。
b)PCR检测体系的配制:按表5、表6、表7、表8用量分别配制反应液I、II、III、IV,各管检测的ROS1融合形式如表3。
c)反应程序设置:95℃5min,1个循环;50℃30min,1个循环;95℃5min,1个循环;95℃15s,60℃40s,10个循环(不采光);95℃15s,58℃40s(采光:FAM、HEX通道),45个循环。
d)加样
阳性质粒验证:取40copies/μl浓度的各阳性质粒,每反应孔加5μl,每种质粒做2个复管,设置NTC对照。
特异性实验:取野生型人类基因组RNA样品,每反应孔加5μl,每管反应各做40个平行管,设置阳性对照(质粒混合液)和NTC。
灵敏度实验:取40copies/μl、20copies/μl、10copies/μl、5copies/μl、2copies/μl、1copies/μl六个梯度质粒进行检测,单个反应加入5μL模板,每个浓度做4个复管,设置NTC对照。
重复性实验:取40copies/μl、20copies/μl作为模板,每个浓度重复检测10次,计算10次Ct值的重复性,设置NTC对照。
e)上机:选择ABI 7500或SLAN96P荧光PCR仪,按c)步骤中的程序运行实验。
f)结果分析:
阳性质粒验证:20种ROS1阳性质粒均能出现良好的扩增曲线,NTC无信号,部分结果如图3。
特异性:反应管1和反应管4的40个平行管均为出现扩增曲线,而反应管2和反应管3的40个平行管中分别出现1个和2个假阳性,改用分子信标后,两反应管均未出现假阳性,说明分子信标具有良好的特异性。
灵敏度:反应管1和反应管4的灵敏度可以做到5-10拷贝,而反应管2和反应管3的灵敏度只能做到25-50拷贝,改用分子信标后,2管反应均能做到5-10拷贝,说明分子信标对体系灵敏度有显著提高,部分结果如图4。
重复性:10次Ct值的CV值小于5%,体系重复性好。
实验三,临床样本检测;
应用本试剂盒筛查临床非小细胞肺癌石蜡包埋组织样本735份,新鲜病理组织65份,临床样本来自国内几家肿瘤医院,临床样本检测步骤如下:
a)肿瘤组织RNA的提取:新鲜病理组织使用TIANGEN的RNA提取试剂盒进行提取,石蜡包埋组织样本用Qiagen公司的FFPE组织RNA提取试剂盒(RNeasy FFPE Kit),CatNO.73504,严格按照说明书步骤进行RNA提取,提取过程中注意防止RNA酶的污染,经紫外分光光度计检测提取质量,所提RNA的A260/A280应在1.8~2.0之间。
b)PCR检测体系的配制:按表5、表6、表7、表8用量用量分别配制反应液I、II、III、IV,各管检测的ROS1融合形式如表3。
c)反应程序:95℃5min,1个循环;50℃30min,1个循环;95℃5min,1个循环;95℃15s,60℃40s,10个循环(不采光);95℃15s,58℃40s(采光:FAM、HEX),45个循环。
d)加样,将不同临床RNA样本重新编号,按顺序进行加样,投入1-3μg模板,同时做阳性对照和阴性对照(阴性对照为两个,分别是无菌无核酸酶超纯水和野生型人类基因组RNA;阳性对照为质粒混合液,含有各个基因阳性对照品的序列)
e)上机:选择AB 7500或SLAN96P荧光PCR仪,按c)程序运行。
f)结果判读:
体系质控标准:阳性对照FAM通道有典型扩增曲线,阴性对照野生型RNA样本在HEX通道有扩增曲线,阴性对照NTC在两个通道均无信号。
临床样本结果判读:若临床样本FAM、HEX通道均有扩增曲线,则为ROS1融合突变阳性;若HEX通道有扩增曲线而FAM通道无扩增曲线,则为ROS1阴性或低于本试剂盒的检测下限或标本质量原因或为本试剂盒未覆盖的其他融合形式。
g)临床样本检测结果:800例非小细胞肺癌样本中有11例为ROS1融合突变阳性,其中有5份CD74-ROS1融合、3份EZR-ROS1融合、2份SLC34A2-ROS1融合,1份TPM3-ROS1融合,其他均为野生型。以Sanger测序法为对照方法,将11份阳性样本进行验证,同时随机抽取50份野生型临床样本进行测序验证,得到的测序结果与本试剂盒检测结果一致率为100%。图5和图6为临床样本检测的典型结果图,其中,图5为一份CD74exon6-ROS1exon32融合阳性临床样本扩增结果图,图6为一份临床阴性样本的扩增结果图,图7为一份CD74exon6-ROS1exon32融合阳性临床样本测序结果图,箭头所指位置为断裂点。
本发明试剂盒解决了ROS1突变谱覆盖度低的问题,可以涵盖多达20种ROS1融合形式;建立的一步法逆转录反应体系,简化了操作、避免了污染;使用特异引物、TaqMan-MGB和分子信标探针进行检测,试剂盒可以检测出低至5-10拷贝的阳性模板,灵敏度高,特异性高,有效避免假阳性;将引物探针分组进行反应,提高检测质量。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解,上述实施例不以任何形式限制本发明,凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
序列表
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<120> 用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法
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Claims (10)
1.用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针,其特征在于,包括:
在如下ROS1基因融合突变位点的上游基因外显子:SLC34A2-exon4/13、CD74-exon5/6/7、SDC4-exon2/4、EZR-exon10、LRIG3-exon16、TPM3-exon5/8、TFG exon5及GOPC-exon4/8上分别设计上游引物;
在ROS1 exon 32/34/35/36上设计下游共用引物、分子信标探针和TaqMan-MGB探针,5’端标记物标记;
以人类HBB基因为内控基因,设计特异性引物和TaqMan检测探针,5’端标记物标记。
2.根据权利要求1所述的用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针,其特征在于,包括四组引物探针组合;
第一组引物探针的融合位点包括:SL14del;R32,SL4;R32,C6;R32,SD2;R32,SD4;R32,C7;R32;
第二组引物探针的融合位点包括:SL14del;R34,SL4;R34,C6;R34,SD4;R34,EZ10;R34,SD2;R34,C5;R34;
第三组引物探针的融合位点包括:L16;R35,T8;R35,G8;R35,C6;R35,TP5;R35,TF5;R35;
第四组引物探针的融合位点包括:G4;R36。
3.根据权利要求1所述的用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针,其特征在于,上游引物包括:SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.14对应于ROS1融合基因上游8种基因序列的引物及其组合。
4.根据权利要求1所述的用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针,其特征在于,下游引物包括:SEQ ID NO.15~SEQ ID NO.18对应于ROS1的4个外显子的引物及其组合。
5.根据权利要求1所述的用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针,其特征在于,探针包括:SEQ ID NO.19~SEQ ID NO.22对应于ROS1的4个外显子序列的探针及其组合。
6.根据权利要求1所述的用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针,其特征在于,内控基因HBB的引物探针包括:SEQ ID NO.23~SEQ ID NO.25对应的序列及其组合。
7.根据权利要求1所述的用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针,其特征在于,所述标记物包括:FAM荧光基团或HEX荧光基团。
8.用于检测人类ROS1基因融合突变的试剂盒,其特征在于,包括:
模板,以合成的20种阳性质粒和RNA样品为模板;
PCR检测体系,包括:反应液I,反应液II、反应液III、反应液IV;
反应液I包括:
反应液II包括:
反应液III包括:
反应液IV包括:
第一组引物探针的融合位点包括:SL14del;R32,SL4;R32,C6;R32,SD2;R32,SD4;R32,C7;R32;
第二组引物探针的融合位点包括:SL14del;R34,SL4;R34,C6;R34,SD4;R34,EZ10;R34,SD2;R34,C5;R34;
第三组引物探针的融合位点包括:L16;R35,T8;R35,G8;R35,C6;R35,TP5;R35,TF5;R35;
第四组引物探针的融合位点包括:G4;R36;
内控基因HBB;
阴性对照。
9.用于检测人类ROS1基因融合突变的试剂盒的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
引物探针设计,
在如下ROS1基因融合突变位点的上游基因外显子:SLC34A2-exon4/13、CD74-exon5/6/7、SDC4-exon2/4、EZR-exon10、LRIG3-exon16、TPM3-exon5/8、TFG exon5及GOPC-exon4/8上分别设计上游引物;
在ROS1 exon 32/34/35/36上设计下游共用引物、分子信标探针和TaqMan-MGB探针,5’端FAM荧光基团标记;
以人类HBB基因为内控基因,设计特异性引物和TaqMan检测探针,5’端HEX荧光基团标记;
基因组RNA提取,
使用RNA提取试剂盒提取RNA,经紫外分光光度计检测提取质量,所提RNA的A260/A280在1.8~2.0之间;
一步法逆转录PCR进行检测,
PCR检测体系,包括:反应液I,反应液II、反应液III、反应液IV;
反应液I包括:
反应液II包括:
反应液III包括:
反应液IV包括:
第一组引物探针的融合位点包括:SL14del;R32,SL4;R32,C6;R32,SD2;R32,SD4;R32,C7;R32;
第二组引物探针的融合位点包括:SL14del;R34,SL4;R34,C6;R34,SD4;R34,EZ10;R34,SD2;R34,C5;R34;
第三组引物探针的融合位点包括:L16;R35,T8;R35,G8;R35,C6;R35,TP5;R35,TF5;R35;
第四组引物探针的融合位点包括:G4;R36;
内控基因HBB和阴性对照对样本提取质量和反应体系进行质控,根据标记物指示阳性结果;质控标准:a)阳性对照:FAM通道有扩增曲线;b)阴性对照:NTC在两个通道均无扩增曲线,野生型样本HEX通道有正常曲线;
结果判读:
a)当HEX通道有扩增曲线,FAM通道有扩增曲线,则样品为ROS1融合阳性;
b)当HEX通道有扩增曲线,FAM通道无扩增曲线,则为ROS1融合阴性或低于本试剂盒的检测下限或标本质量原因或为本试剂盒未覆盖的其他融合形式。
10.根据权利要求9所述的用于检测人类ROS1基因融合突变的试剂盒的检测方法,其特征在于,
以合成的20种阳性质粒和野生型石蜡包埋组织切片提取的RNA样品为模板,验证阳性质粒标准品,同时考察检测体系的特异性、灵敏度和重复性;具体步骤如下:
模板准备:将合成的阳性质粒用Tris-HCL溶解,定量稀释到40copies/μl、20copies/μl、10copies/μl、5copies/μl、2copies/μl、1copies/μl六个浓度梯度;提取野生型人类基因组RNA样品,备用;
PCR检测体系的配制,
PCR检测体系,包括:反应液I,反应液II、反应液III、反应液IV;
反应液I包括:
反应液II包括:
反应液III包括:
反应液IV包括:
第一组引物探针的融合位点包括:SL14del;R32,SL4;R32,C6;R32,SD2;R32,SD4;R32,C7;R32;
第二组引物探针的融合位点包括:SL14del;R34,SL4;R34,C6;R34,SD4;R34,EZ10;R34,SD2;R34,C5;R34;
第三组引物探针的融合位点包括:L16;R35,T8;R35,G8;R35,C6;R35,TP5;R35,TF5;R35;
第四组引物探针的融合位点包括:G4;R36;
反应程序设置,
95℃5min,1个循环;50℃30min,1个循环;95℃5min,1个循环;95℃15s,60℃40s,10个循环(不采光);95℃15s,58℃40s(采光),45个循环;
加样,
阳性质粒验证:取40copies/μl浓度的各阳性质粒,每种质粒做多个复管,设置NTC对照;
特异性实验:取野生型人类基因组RNA样品,每管反应各做多个平行管,设置阳性对照和NTC对照;
灵敏度实验:取40copies/μl、20copies/μl、10copies/μl、5copies/μl、2copies/μl、1copies/μl六个梯度质粒进行检测,每个浓度做多个复管,设置NTC对照;
重复性实验:取40copies/μl、20copies/μl作为模板,每个浓度重复检测多次,计算多次Ct值的重复性,设置NTC对照;
上机,按照设置的反应程序运行实验。
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