CN101403009A - 一种用于检测骨髓增殖性疾病mplw515l突变的试剂盒及其专用引物与探针 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的试剂盒及其专用引物与探针。本发明所提供的试剂盒,包括引物和TaqMan-MGB探针;所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;所述TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。本发明所提供的用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的试剂盒可用于临床及科研中对MPLW515L突变进行检测,不仅为MPDs的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径,而且可进一步提供MPLW515L突变基因与野生MPL基因的确切比值,从而可为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的试剂盒及其专用引物与探针。
背景技术
骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disorders,MPDs)是一组造血干细胞肿瘤增生性疾病,在骨髓细胞普遍增生的基础上有一个系列细胞尤其突出,呈持续不断的过度增殖。临床上根据增生为主细胞系列的不同分为4种:①以红细胞系增生为主者,称真性红细胞增多症(polycythemia vera,PV);②以粒细胞系增生为主者,称慢性粒细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML);③以巨核细胞系增生为主者,称原发性血小板增多症(essential thrombocythemia,ET);④以原纤维细胞增生为主者,称原发性骨髓纤维化症(idiopathicmyelofibrosis,IMF)。其中,95%的CML患者存在BCR/ABL融合基因,PCR-BCR/ABL检测已成为用于CML诊断的常规项目,而其余三种MPDs分别是影响红细胞、巨核细胞、血小板及骨髓微环境的恶性肿瘤,长期以来,未发现特异的分子诊断标志。
近年来,有关MPDs发病机理研究的主要进展是发现部分PV、IMF和ET患者具有JAK2V617F突变,该突变是后天获得性的髓系细胞中JAK2激酶自氨基末端第617位氨基酸残基由缬氨酸(V)突变为苯丙氨酸(F),造成JAK2激酶活性增加,细胞生长信号系统获得活化,进而导致细胞异常增殖。这一发现,不仅使快速、可靠、准确诊断MPDs成为可能,而且可针对JAK2V617F突变开发出与格列卫类似的新的靶向疗法(格列卫目前正在被用来治疗慢性髓性白血病),将为治疗MPDs提供一种新的治疗方法。目前,已发现74-97%以上的PV、23-57%的ET以及35-95%的IMF患者中JAK2V617F突变的检测结果呈阳性。在慢性髓性单核细胞白血病(CMML)、慢性中性粒细胞白血病(CNL)和急性髓性白血病(AML,尤其是M2、M6、M7型)患者中,该突变的检测阳性率可达13-18%(其中CNL、CMML已被世界卫生组织新的分型归为MPD及MPD/MDS);而在急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病及继发性红细胞增多症等疾病患者中,该突变的检测结果为阴性,JAK2V617F突变的检测已广泛用于白血病的鉴别和诊断中。但在MPDs病人中,仍然有相当一部分病人JAK2V617F突变是阴性的,缺乏特异的分子诊断标志。
近一年来,MPDs研究出现了重要的进展,在JAK2V617F突变阴性的患者中发现存在MPL(myeloproliferative leukemia virus oncogene homology,MPL)突变(包括MPLW515L突变和MPLW515K突变)。MPL突变在JAK2V617F突变阴性的MF和ET患者中约占5-10%。MPLW515L突变是MPL激酶自氨基末端第515位氨基酸编码的密码子由TGG突变为TTG,导致MPL编码的氨基酸在该处由色氨酸(密码子TGG)突变为亮氨酸(密码子TGG)。与JAK2V617F突变检测一样,MPLW515L突变的检测也为明确MPDs诊断提供了可靠依据,还有可能作为治疗MPDs的一个药物靶标,用来治疗这一类疾病。
目前,国际上已报道的用于检测MPL突变的方法主要包括PCR直接测序和定性PCR等,这些方法普遍存在灵敏度低、特异性不高、费时费力且易污染等缺点,使应用受到一定限制。2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan-MGB探针(Minor Groove Binder Probe,TaqMan-MGB探针),TaqMan-MGB探针是带有一个小沟结合物基团的寡核苷酸探针,工作原理与TaqMan探针相同,报告荧光基团连接在探针的5′端(如FAM、HEX、VIC等),3′端标记有淬灭基团,不同的是淬灭基团为不发光的淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher,NFQ),淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光,大大降低了本底信号的干扰。此外,MGB探针的3’端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide,DPI3),DPI3可折叠进由探针末端5-6bp核苷酸形成的小沟内。DPI3呈新月行,与B型DNA螺旋的浅深小沟一样螺旋,主要通过范德华力稳定。TaqMan-MGB探针显示了更强的序列特异性。可以大大稳定探针与模板的杂交,升高探针Tm值,使较短的探针同样能达到较高的Tm值-而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近,淬灭效果更好,荧光背景更低,使得信噪比更高,一个15bp的MGB探针的信噪比大于6,优于理想状态下的25bp的普通TaqMan探针(信噪比约为1.5)。允许采用更短的探针也简化了探针的设计和成本。与传统的TaqMan探针比较,TaqMan-MGB探针有以下优势:MGB增加了探针熔点温度(Tm),这样可使探针较短,尤其适合富含A/T的序列,并且提高配对与非配对模板间的Tm值差异,可进行更多重的PCR;提高信噪比,由于在探针的3′端的淬灭基团为不发光的荧光基团,并且与报告基团在空间的位置更接近,实验的结果更精确,分辨率更高;且实验步骤简单,杂交的稳定性大大提高,重复性大大提高。
但是,目前尚没有专门用于检测基因组DNA上的MPLW515L突变的合适的引物和特异性的TaqMan-MGB荧光探针。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的试剂盒。
本发明所提供的用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的试剂盒,包括用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的引物和TaqMan-MGB探针。
所述用于对骨髓增殖性疾病MPLW515L突变进行定性、定量检测的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。其中,序列表中的SEQ ID NO.1由21个碱基组成,该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587604-43587624位碱基的反向互补序列,SEQ ID NO.2由21个碱基组成,该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587534-43587554位碱基,扩增片段长度为91bp。
所述TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示;所述探针为经过荧光标记的,5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团,3’端不仅标记有不发光的淬灭基团,还连接有二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide,DPI3)。
所述报告荧光基团可为FAM、HEX或VIC等,不发光的淬灭基团可为NFQ(Non-Fluorescent Quencher,NFQ)等。
将具有序列表中SEQID NO.3的TaqMan-MGB探针命名为W515wt-MGB-Probe,序列表中的SEQ ID NO.3由16个碱基组成,该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587586-43587601位碱基的反向互补序列,针对43587596位的碱基G。
将具有序列表中SEQ ID NO.4的TaqMan-MGB探针命名为W515L-MGB-Probe,序列表中的SEQ ID NO.4由18个碱基组成,该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587586-43587603位碱基的反向互补序列,针对43587596位的突变碱基T。
上述试剂盒中还包括阳性对照、野生型对照和阴性对照;
所述阳性对照为MPLW515L突变阳性病人细胞的DNA;所述野生型对照为正常人细胞的DNA;所述阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系。
本发明的另一个目的是提供一种检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的方法。
本发明所提供的检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的方法,包括以下步骤:
1)提取受试者的骨髓、外周血或组织的基因组DNA;
2)以受试者骨髓或外周血的基因组DNA为模板,用上述试剂盒对上述步骤1)提取到的基因组DNA进行PCR扩增;
3)对步骤2)的扩增产物进行MPL激酶基因的等位基因鉴别分析,若用于标记SEQ ID NO:3的荧光染料发出的荧光强度呈S型增长,同时用于标记SEQ ID NO:4的荧光染料发出的荧光强度无增长,表示野生型基因型;反之,表示MPLW515L纯合突变基因型;若两种荧光染料发出的荧光强度同时呈S型增长,则表示MPLW515L杂合突变基因型;
4)根据步骤3)的基因型分析结果进行判断,具有MPLW515L纯合突变基因型或MPLW515L杂合突变基因型的受试者的MPLW515L突变检测结果为阳性。
在上述检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中的MPLW515L突变的方法中,为了便于对检测结果进行分析,还可在步骤2)中添加MPLW515L突变阳性对照质粒、野生型质粒和阴性对照,其中,MPLW515L突变阳性对照质粒、野生型对照质粒分别来自以MPLW515L突变阳性病人及正常人细胞的DNA为模板,用SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6引物对进行PCR扩增后的产物,扩增产物经纯化后,分别被克隆进入pMD18-T质粒载体,经过细菌转化、筛选、测序验证及扩增后,提取DNA分别得到MPLW515L突变及野生型质粒标准品,通过测定吸光度值计算出拷贝数,分别制备十倍梯度稀释(107,106,105,104,103,102个拷贝)样品,用于制作MPLW515L突变及野生型的标准曲线;MPLW515L杂合突变基因型可为来自MPLW515L质粒和野生型质粒的不同比例的混合物,并以MPLW515L突变/MPL总与ΔCt(CtMPLW515L突变-CtMPL野生)做标准曲线。测试样本的平均ΔCt分别代入标准曲线计算MPLW515L突变基因占MPL总基因型(MPLW515L突变/MPL总)的百分比值。阴性对照可为不含DNA的PCR扩增体系。
此外,根据步骤3)的分析结果,测试样本为MPLW515L杂合突变基因型的,可根据标准曲线计算MPLW515L突变基因占MPL总基因型(JMPLW515L突变/MPL总)的百分比值。
本发明的第三个目的是提供一种用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的引物。
本发明所提供的用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的引物,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
本发明的第四个目的是提供一种用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的TaqMan-MGB探针。
本发明所提供的用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的TaqMan-MGB探针,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;
所述SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团,3’端标记有不发光的淬灭基团和二氢环化吲哚卟啉-三肽。
所述报告荧光基团为FAM或HEX,所述不发光的淬灭基团为NFQ。
通过提取待测样品的基因组DNA,再将本发明的引物和TaqMan-MGB探针结合实时荧光定量PCR检测技术,通过检测人MPL激酶自氨基末端第515位的氨基酸,可达到检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的目的。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中对MPLW515L突变进行检测,不仅为MPDs的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径,而且可进一步提供MPLW515L突变基因与野生MPL基因的确切比值,从而可为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为十倍梯度稀释MPLW515野生型质粒标准品进行扩增的标准曲线
图2为十倍梯度稀释MPLW515L突变质粒标准品进行扩增的标准曲线
图3为MPL激酶自氨基末端第515位氨基酸位点为野生型的扩增曲线
图4为MPL激酶自氨基末端第515位氨基酸位点为W515L杂合型的扩增曲线
图5为测序验证部分样品的MPLW515L突变的结果
图6为计算MPLW515L突变基因占MPL总基因型的百分比值的标准曲线
图7为本发明的MPLW515L突变检测方法的稳定性及灵敏度测定结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物、TaqMan-MGB探针的合成及序列测定工作均由上海基康生物技术有限公司完成。
实施例1、用于对骨髓增殖性疾病MPLW515L突变进行检测的引物和TaqMan-MGB探针的设计
根据MPL激酶基因(1号染色体GeneLoc map region,41,576,062-45,592,722bp,GeneLoc location for GC01P043576)及其反向互补序列用Primer ExpressSoftware 2.0软件设计一对PCR引物,同时根据野生型MPL激酶基因及MPL激酶MPLW515L突变基因的反向互补序列设计2条TaqMan-MGB探针,将2条TaqMan-MGB探针的5’端分别依次标记报告荧光基团HEX和FAM,3’端标记不发光的淬灭基团,并连接DPI3,引物、TaqMan-MGB探针序列如表1所示:
表1 检测MPLW515L突变的引物、探针序列
序列表中的SEQ ID NO.1由21个碱基组成,该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587604-43587624位碱基的反向互补序列,SEQ ID NO.2由21个碱基组成,该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587534-43587554位碱基,扩增片段长度为91bp。
将具有序列表中SEQ ID NO.3的TaqMan-MGB探针命名为W515wt-MGB-Probe,序列表中的SEQ ID NO.3由16个碱基组成,该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587586-43587601位碱基的反向互补序列,针对43587596位的碱基G。将具有序列表中SEQ ID NO.4的TaqMan-MGB探针命名为W515L-MGB-Probe,序列表中的SEQ ID NO.4由18个碱基组成,该序列为1号染色体GC01P043576自5’端第43587586-43587603位碱基的反向互补序列,针对43587596位的突变碱基T。
实施例2、骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的检测
一、用根据MPL基因组基因设计的引物和TaqMan-MGB探针进行骨髓增殖性疾病MPLW515L突变检测
用实施例1中根据MPL基因组基因设计的引物和TaqMan-MGB探针对MPDs患者,包括ET、MF、未归类的MPDs,及CML等骨髓或外周血标本(来自人民医院)进行骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的检测,同时以正常供者的离体骨髓(NDM)为对照,具体方法如下:
1)待测样品基因组DNA的提取
按DNA zol试剂盒(购自美国Gibco公司)并参照试剂盒说明书在无菌条件下提取MPDs患者及正常骨髓移植供者(见表1)的骨髓标本的基因组DNA,方法为:用EDTA抗凝,用淋巴细胞分层液(相对密度1.077g/L,上海华精高科技有限公司)分离出单个核细胞,将分离出的单个核细胞用生理盐水洗涤2次后,加入600μl DNAzol试剂,轻轻混合吹打后加入600μl无水冷乙醇,4℃、12000rpm离心1分钟,弃上清,将沉淀用80%的冷乙醇洗涤一次,室温干燥,用适量的灭菌注射用水溶解沉淀,最后用DNA/RNA紫外检测仪测定DNA含量及纯度,结果A260/A280>1.8,表明所提取的DNA纯度较高。
2)PCR扩增
以步骤1)提取的DNA为模板,在实施例1中所述引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2及由序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成的TaqMan-MGB探针的引导下,用ABI 7500实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)进行PCR扩增,PCR反应体系为:通用PCR扩增预混试剂(购自美国应用生物系统公司),引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2各400nM,荧光标记的W515wt-MGB-Probe 100nM,W515L-MGB-Probe 250nM,150-500ng DNA。PCR反应条件为:先50℃2分钟;然后95℃10分钟;最后95℃15秒,60℃1分钟,共45个循环。
为了便于对检测结果进行分析,同时设置MPLW515L突变阳性对照质粒、野生型质粒和阴性对照,其中,MPLW515L突变阳性对照质粒、野生型对照质粒分别来自以MPLW515L突变阳性病人及正常人细胞的DNA为模板,用SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6引物对进行PCR扩增后的产物,扩增产物经纯化后,分别克隆入pMD18-T质粒载体,经过细菌转化、筛选、测序验证及扩增后,提取DNA分别得到MPLW515L突变及野生型质粒标准品,通过测定吸光度值计算出拷贝数,分别制备十倍梯度稀释(107,106,105,104,103,102个拷贝)样品,用于制作MPLW515L突变及野生型的标准曲线。十倍梯度稀释的MPLW515野生型质粒标准品进行扩增的标准曲线如图1所示,十倍梯度稀释的MPLW515L突变质粒标准品进行扩增的标准曲线如图2所示。阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系。
3)PCR扩增曲线鉴别分析
对步骤2)的扩增产物进行等位基因鉴别分析,若用于标记TaqMan-MGB SEQ IDNO.3的荧光染料HEX发出的绿色荧光强度呈S型增长,同时用于标记TaqMan-MGBSEQ ID NO.4的荧光染料FAM发出的蓝色荧光强度无增长,表示野生型基因型,扩增曲线见图3(箭头指示的曲线表示荧光强度变化);反之,表示纯合突变基因型;若两种荧光染料发出的荧光强度同时呈S型增长,则表示杂合突变基因型,扩增曲线见图4(箭头指示的曲线分别表示荧光强度变化,在图4中分别表示MPLW515L突变基因型和野生型基因型)。
4)结果判断
根据步骤3)的基因型分析结果进行判断,具有杂合突变基因型或纯合突变基因型的待测样品的MPLW515L突变检测结果为阳性,受试者为骨髓增殖性疾病患者,检测结果如表1所示。对其中9例标本(阳性7例,阴性2例)用测序的方法进行了验证,其中6例标本的测序检测结果如图5所示,与以上方法的检测结果一致。表明用本发明的引物、TaqMan-MGB探针及方法可对MPLW515L突变进行检测,检测结果准确。
表1 MPLW515L突变在JAK2V617F阴性的MPDs中的检出情况
5)同时对阳性对照突变基因型MPLW515L的质粒DNA依次用野生基因型质粒DNA稀释为80%、40%、20%、10%、5%的比例,每梯度重复3-5管进行扩增,以MPLW515L 突变/MPL总与其相应的平均ΔCt(CtMPLW515L突变-CtMPL野生)做标准曲线为y=-0.0722x+0.1828,检测MPLW515L突变,相关系数r=0.99,其中Y代表不同的突变基因百分比,X代表平均ΔCt(CtMPLW515L突变-CtMPL野生),测试样本的平均ΔCt代入上述标准曲线方程可计算出测试样本的突变基因百分比(MPLW515L突变/MPL总)。对上述阳性的MPDs患者的结果根据DNA标准曲线(见图6)计算其突变基因百分比(MPLW515L突变/MPL总),结果平均值为24.63±12.71%。
二、本发明骨髓增殖性疾病MPLW515L突变检测方法的灵敏度测定
将阳性对照突变基因型MPLW515L的质粒DNA依次用野生基因型质粒DNA稀释为60%、40%、20%、10%、0.5%(突变基因型/(突变基因型+野生基因型))的比例,按上述相同方法进行检测,结果在0.5%梯度均可检出MPLW515L突变扩增曲线,表明本发明方法的检测灵敏度可达0.5%(见图7)。
序列表
<160>6
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gcggtacctg tagtgtgcag g 21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
ggtgaccgct ctgcatctag t 21
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
actgccacct cagcag 16
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
aaactgcaac ctcagcag 18
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
cacagagcga accaagaat 19
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
cgatctcgct accgtttac 19
Claims (10)
1、一种用于检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变的试剂盒,包括用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的引物和TaqMan-MGB探针;
所述用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的引物,其核苷酸序列如序列表中SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示;
所述TaqMan-MGB探针,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
2、根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述TaqMan-MGB探针的5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团,3’端标记有不发光的淬灭基团和二氢环化吲哚卟啉-三肽。
3、根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于:所述报告荧光基团为FAM或HEX,所述不发光的淬灭基团为NFQ。
4、根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中还包括阳性对照、野生型对照和阴性对照;
所述阳性对照为MPLW515L突变阳性病人细胞的DNA;
所述野生型对照为正常人细胞的DNA;
所述阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系。
5、一种用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的方法,包括以下步骤:
1)提取受试者的骨髓、外周血或组织的基因组DNA;
2)以受试者骨髓或外周血的基因组DNA为模板,以权利要求1-3中任一所述的试剂盒对上述步骤1)提取到的基因组DNA进行PCR扩增;
3)对步骤2)的扩增产物进行MPL激酶基因的等位基因鉴别分析,若用于标记SEQ ID NO:3的荧光染料发出的荧光强度呈S型增长,同时用于标记SEQ ID NO:4的荧光染料发出的荧光强度无增长,表示野生型基因型;反之,表示MPLW515L纯合突变基因型;若两种荧光染料发出的荧光强度同时呈S型增长,则表示MPLW515L杂合突变基因型;
4)根据步骤3)的基因型分析结果进行判断,具有MPLW515L纯合突变基因型或MPLW515L杂合突变基因型的受试者的MPLW515L突变检测结果为阳性。
6、根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中还包括添加阳性对照、野生型对照和阴性对照的步骤;
所述阳性对照为MPLW515L突变阳性病人细胞的DNA;
所述野生型对照为正常人细胞的DNA;
所述阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系。
7、用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的引物,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
8、用于检测骨髓增殖性疾病基因组DNA中MPLW515L突变的TaqMan-MGB探针,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;
所述SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团,3’端标记有不发光的淬灭基团和二氢环化吲哚卟啉-三肽。
9、根据权利要求8所述的TaqMan-MGB探针,其特征在于:所述报告荧光基团为FAM或HEX,所述不发光的淬灭基团为NFQ。
10、权利要求1-4中任一所述的试剂盒、权利要求7所述的引物、权利要求8或9所述的探针在检测骨髓增殖性疾病MPLW515L突变中的应用。
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