CN105154545A

CN105154545A - 一种检测mpl基因突变的引物与方法

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Publication number: CN105154545A
Application number: CN201510568599.3A
Authority: CN
Inventors: 燕启江; 赵薇薇; 于世辉; 梁耀铭; 胡昌明
Original assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2015-09-09
Publication date: 2015-12-16

Abstract

本发明提供一种检测MPL基因突变的引物，包括针对MPL基因外显子10的上游引物和下游引物。本发明属于生物检测技术领域，本发明提供的引物可以实现MPL基因外显子10突变的特异性检测，引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。

Description

一种检测 MPL 基因突变的引物与方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种检测MPL基因突变的引物与方法。

背景技术

骨髓增值性肿瘤（MPN）是由造血前体细胞生长激活基因改变导致的多细胞系过度增殖而引起的，包括真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）和原发性骨髓纤维化（PMF）。骨髓增值性肿瘤若不及时治疗，最终可能发展呈急性粒细胞性白血病。MPL基因编码人血小板生成素受体(TPOR)，促进细胞的生长、增殖及分化。人血小板生成素受体参与调控巨核细胞的增殖与血小板的生成，对造血干细胞的维护起着重要的作用。MPL基因跨膜区域的体细胞突变首先由Pikman等在JAK2 V617F突变阴性的PMF患者中发现，被认为与JAK2 V617F突变阴性的MPN患者中JAK-STAT信号转导通路发生持续性激活有关。

现有研究表明，MPL基因突变主要发生在外显子10第515位密码子上(W515L, W515K , W515R和W515A)，约8.5%的JAK2 V617F突变阴性的ET和约15%的JAK2 V617F突变阴性的PMF患者可检测到MPL基因突变，但在PV患者中未发现MPL基因突变。MPL W515突变是JAK2 V617F阴性的MPN患者的致病因素之一。

中国专利申请201210374903.7公开了一种检测MPL基因W515位点突变的试剂盒，该试剂盒包括位点突变特异性引物、内参基因ABL引物和荧光探针等，用于MPL基因W515位点突变的检测存在存在反应体系复杂，需要多种引物和荧光定量PCR仪的缺点。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测MPL基因突变的引物与方法，该引物具有特异性好、灵敏度高等优点，实现了检测MPL基因外显子10突变的准确检测。

本发明提供一种检测MPL基因突变的引物，包括针对MPL基因外显子10的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTGACCTTGCGGGCCGAC（SEQ ID NO.1）和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCGATCTGGGGTCACAGAGCGA（SEQ ID NO.2）。

优选地，所述引物中，外显子10的上游引物和外显子10的下游引物浓度比为1：1。

相应地，本发明还提供一种检测MPL基因突变的方法，包括如下步骤：A）提取DNA样品；B）采用权利要求1或2中所述的引物进行PCR扩增；C）对扩增产物进行凝胶电泳分析后，采用Sanger测序法检测，对检测结果进行分析。

优选地，所述步骤A）中的DNA样品为EDTA抗凝外周血或骨髓血的DNA样品。

优选地，所述步骤B）中的PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：63℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，34个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。

优选地，所述步骤C）中，采用Sequencher 4.1.4软件对检测结果进行分析。

此外，本发明还提供检测MPL基因突变的引物在制备检测MPL基因突变试剂中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种检测MPL基因外显子10突变的引物，该引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。此外，本发明还提供了一种检测MPL基因外显子10突变的方法，通过使用特异性的引物，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可作为JAK2 V617F阴性的ET和PMF患者的辅助检测方法，进而为其临床用药提供指导。

附图说明

图1 本发明提供的MPL基因外显子10引物的扩增片段。

图2 PCR扩增产物的凝胶电泳图。

图3 MPL基因外显子10野生型的部分测序图。

图4 MPL基因外显子10突变型的部分测序图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例一 引物

发明人针对MPL基因外显子10，设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好的引物。

实施例二 引物的特异性

将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting，MPL基因外显子10引物扩增片段位于chr1: 43814796-43815124间，长度为329 bp。无其它同源基因，结果如图1所示，与MPL基因参考序列相符。

使用表1中的引物、表2中的PCR扩增体系和表3的PCR扩增条件对检测样品进行扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图2所示。结果显示，扩增产物的特异性高，无非特异性扩增条带产生。

实施例三 MPL 基因外显子 10 突变的检测

提取EDTA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit（购自Tiagen，货号：DP318）的说明书，将DNA样品稀释至100ng/μL，备用。

PCR扩增采用Q5^™热启动超保真2X Master Mix（购自NEB公司，货号：M0494L），PCR扩增体系如表2所示，PCR扩增条件如表3所示。外显子10的上游引物和外显子10的下游引物浓度比为1：1，外显子10的上游引物浓度和外显子10的下游引物浓度都为10p/mol。

对PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图2所示。结果显示，扩增产物的特异性高，无非特异性扩增条带产生。采用BigDye® Terminator v3.1（购自Life司，货号4336919）对检测样品的PCR扩增产物进行Sanger测序，Sanger测序的操作步骤如下：

A) DNA测序模板处理，加入ExoSAP-IT酶，在ABI 9700PCR仪中，按以下程序进行处理：37 ℃，15 min；80 ℃，15 min；4℃，infinite。

B) 参考BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit操作说明制备测序PCR体系。

C) 在ABI 9700PCR仪中，按以下程序进行处理：

96℃，1 min→(96℃，10 s→50℃，5 s→60℃，4 min)，25个循环→4℃保温。

D) 用酒精/EDTA/NaAc法对测序PCR的产物进行纯化。

E) 室温挥发净酒精，加入10μL Hi-Di Formamide溶解DNA，溶解后的样品需要在95℃变性4 min，迅速置冰中冷却4 min后，上样电泳。

测序结果（仅显示部分）如图3至图4所示，扩增产物的序列与参考序列相符。

实施例四 检测 MPL 基因外显子 10 突变的方法的准确性

本检测准确性定义为不同引物检测结果的一致性。

本检测方法使用表1中的检测引物对22例血液样品DNA进行检测，此外，使用表4中的验证引物对22例血液样品DNA进行检测，结果如表5所示。22例样品经两套不同引物检测，检测结果一致，表明本检测方法的准确性为100%。

注：NMD即未检测到突变。

实施例五 检测 MPL 基因外显子 10 突变的方法的特异性和灵敏度

本检测的检测特异性定义为阴性符合率，检测灵敏度定义为阳性符合率。

本检测方法使用表1中的检测引物对22例血液样品DNA进行检测，此外，使用表4中的验证引物对22例血液样品DNA进行检测，结果如表5所示。检测引物和验证引物检测结果为阴性(未检测到突变)的样品完全一致，本检测方法的检测特异性为100%。

检测引物和验证引物检测结果为阳性(检测到突变)的样品完全一致，突变位点及类型也完全一致，结果如表6所示，本检测方法的检测灵敏度为100%。

实施例六 检测 MPL 基因外显子 10 突变的方法的检测下限

本检测方法采用Sanger测序法进行检测，本检测方法的最低检测下限(LOD)为20%，当突变细胞与正常细胞的比值低于40%时，不排除假阴性的可能。

DNA输入量的检测结果如表8所示，在DNA量输入范围12.5~200ng/reaction间，可保证突变样品检测结果一致。

实施例七 检测 MPL 基因外显子 10 突变的方法的精密度

本检测方法的精密度定义为对样品进行重复检测得到同一结果的能力。

本检测方法对7例样品进行了MPL基因外显子10的三次重复检测。同一样品不同批次的扩增均成功，Sanger测序结果如表7所示。结果显示，同一样品不同批次的检测结果一致，本检测方法批间精密度为100%。

注：NMD即未检测到突变。

本检测方法对1例阳性样品和1例阴性样品进行了MPL基因外显子10的3复孔检测。同一样品不同孔间的扩增均成功，Sanger测序结果如表8所示。结果显示，同一样品不同孔间的检测结果一致，本检测方法的批内精密度为100%。

注：NMD即未检测到突变。

因此，本发明所提供的引物和检测方法可作为一种独立的、应用广泛的检测方法，解决了MPL基因外显子10突变的检测问题，可作为JAK2 V617F阴性的ET和PMF患者的辅助检测方法，进而为其临床用药提供指导，减少不良反应，在帮助指导用药和个性化治疗方面具有重要意义。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州金域医学检验中心有限公司

<120> 一种检测MPL基因突变的引物与方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> MPL-Exon10-F

tgtaaaacga cggccagttg accttgcggg ccgac 35

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> MPL-Exon10-R

caggaaacag ctatgaccga tctggggtca cagagcga 38

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> MPL-Exon10-F-Validation

tgtaaaacga cggccagttc gtggtcggac ccaact 36

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> MPL-Exon10-R-Validation

caggaaacag ctatgaccga cggagatctg gggtcaca 38

Claims

1.一种检测MPL基因突变的引物，其特征在于：包括针对MPL基因外显子10的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTGACCTTGCGGGCCGAC和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCGATCTGGGGTCACAGAGCGA。

2.根据权利要求1所述的检测MPL基因突变的引物，其特征在于：所述引物中，外显子10的上游引物和外显子10的下游引物浓度比为1：1。

3.一种检测MPL基因突变的方法，其特征在于：包括如下步骤：A）提取DNA样品；B）采用权利要求1或2中所述的引物进行PCR扩增；C）对扩增产物进行凝胶电泳分析后，采用Sanger测序法检测，对检测结果进行分析。

4.根据权利要求3所述的检测MPL基因突变的方法，其特征在于：所述步骤A）中的DNA样品为EDTA抗凝外周血或骨髓血的DNA样品。

5.根据权利要求3所述的检测MPL基因突变的方法，其特征在于：所述步骤B）中的PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：63℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，34个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。

6.根据权利要求3所述的检测MPL基因突变的方法，其特征在于：所述步骤C）中，采用Sequencher 4.1.4软件对检测结果进行分析。

7.根据权利要求1或2所述的检测MPL基因突变的引物在制备检测MPL基因突变试剂中的用途。