CN102220422A

CN102220422A - 一种检测braf基因突变的方法

Info

Publication number: CN102220422A
Application number: CN2011101184973A
Authority: CN
Inventors: 张莉; 俞惠新; 宋菲; 谭成; 林秀峰
Original assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Current assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Priority date: 2011-05-09
Filing date: 2011-05-09
Publication date: 2011-10-19

Abstract

本发明涉及一种检测BRAF基因突变的方法，该方法包括以下步骤：a）提取肿瘤组织DNA；b）以步骤a）中提取的DNA为模板，用由序列表中序列1）和序列2）组成的引物对及序列表中序列3）和序列4）的Taqman-MGB探针进行PCR扩增；c）对步骤b）的扩增产物进行BRAF等位基因鉴别分析。本发明可辅助临床医生筛选出病患BRAF基因突变情况，为临床医生用药提供指导和依据，降低医生治疗风险以及患者经济负担；本发明可实现高通量检测，一次可同时检测多至96个样本；检测方法步骤简单，因而大大提高了检测准确率；检测时间短；能够同时检测等位基因的野生型及突变型；灵敏度高，特异性好。

Description

一种检测BRAF基因突变的方法

技术领域

本发明涉及用分子生物学方法对突变碱基进行检测。

背景技术

人类全基因组中有约30亿个碱基，4万个基因，分布在24对染色体上。每个基因编码特异的蛋白质，调控生物体内的生化反应，发挥生物学功能。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。DNA序列的变化影响很多生物功能，比如个体对疾病的感染机率，及其对药物治疗的反应。在研究受多个基因控制的复杂疾病的过程中，SNP分析有助于判断各个基因的具体功能。

BRAF基因全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌（v-raf）致癌同源体B1，定位于人染色体7q34,编码B-Raf蛋白，是一种MAPK通路中的丝氨酸/苏氨酸激酶，该酶将信号从RAS转导至MEK1/2，从而参与调节细胞的生长、增殖和凋亡。BRAF的激活突变在包括黑色素瘤、甲状腺癌及结肠癌等多种恶性肿瘤中均有报道。突变位点基本都位于第15外显子的1799位点，胸腺嘧啶被腺嘧啶所替代，从而使编码的氨基酸由缬氨酸变为谷氨酸（V600E突变），进而模拟T599和S602两个位点的磷酸化过程持续激活BRAF激酶，造成MAPK通路持续活化，细胞无限制分裂增殖。因此，该突变可作为一个诊断和预后的分子生物学标记及开发治疗多重恶性肿瘤的基因靶。

目前普遍应用的BRAF基因突变检测方法为DNA直接测序法和限制小片段长度多态性分析法（RFLP）。DNA直接测序法，该方法周期较长，花费昂贵，通量不高，可能存在交叉污染，且灵敏度只有20％～25％；而RFLP实验造作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，易于污染，均难以满足临床检测的要求。

发明内容

目前高通量的TaqMan-MGB探针基因分型方法已被用来检测单核苷酸多态性。相比与传统的taqman探针，MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬基团（NFQ, non-fluorescent quencher），本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的干扰。同时探针上还连接有MGB（minor groove binder）修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此MGB探针比普通Taqman探针更短，一般为10到15bp（Taqman探针一般为25-35bp），探针特异性更高，可区分模板一个碱基的差异，模板只有一个碱基的差别，探针就不能与之杂交。

针对上述现有技术中的缺陷，本发明提供了一种检测BRAF基因突变的方法，包括以下步骤：

a）提取肿瘤组织DNA；

b）以步骤a）中提取的DNA为模板，用由序列表中序列1）和序列2）组成的引物对及序列表中序列3）和序列4）的Taqman-MGB探针进行PCR扩增；

c）对步骤b）的扩增产物进行BRAF等位基因鉴别分析。

所述步骤a）的肿瘤组织DNA由外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、新鲜组织、冰冻切片、石蜡切片样本中提取。

所述步骤b）中，PCR的反应条件为92-97℃预变性30s-5min；92-97℃变性10-30s，55-60℃退火30-45s，30-40个循环。

所述步骤b）中，PCR反应液的组成为Premix Ex Taq (2×)10μl，序列1）的引物0.2-0.4μl，序列2）的引物0.2-0.4μl，序列3）的探针0.4-0.8μl，序列4）的探针0.4-0.8μl，ROXⅡ参比染料0.4μl，DNA模板2μl，补蒸馏水至20μl。

本发明的有益效果为：一般MGB探针多用于SNP分型以及已知点突变野生型、突变型和杂合子的检测，是一种能快速、高度特异性、高度自动化检测SNP的方法,可用于大规模的基因分型。本检测方法可辅助临床医生筛选出病患BRAF基因突变情况，为临床医生用药提供指导和依据，降低医生治疗风险以及患者经济负担。

本发明的主要优点还在于：

（1）本发明可实现高通量检测，一次可同时检测多至96个样本。

（2）本发明的检测方法步骤简单，因而避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，可用于分析多种来源及取样方式组织样本中的DNA。

（3）本发明所提高的检测方法所需要的检测时间远远低于常用的DNA测序等检测技术。从样本处理至结果判定只需90分钟即可完成。

（4）本检测方法能够同时检测等位基因的野生型及突变型，不但大大提高了基因突变检测的准确率和检测效率，还简化了操作程序，并节约了时间和成本。

（5）本检测方法灵敏度高，特异性好。只需纳克级的DNA样本就可检测，PCR产物实现实时检测，无需后续处理，特异性高达100％。

附图说明

图1为本发明实施例3中样本提取DNA琼脂糖电泳图。

图2为BRAF野生型阳性对照质粒PCR扩增曲线。

图3为BRAF突变型阳性对照质粒PCR扩增曲线。

图4为BRAF杂合子对照质粒PCR扩增曲线。

图5为一例甲状腺乳头状癌样本PCR扩增曲线。

图6为一例甲状腺乳头状癌癌旁正常甲状腺组织样本PCR扩增曲线。

图7为一例甲状腺乳头状癌对侧正常甲状腺组织样本PCR扩增曲线。

图8为等位基因鉴别图谱报告。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法和所用的试剂，如无特别说明，均为常规方法和常规试剂。

实施例1：

一、BRAF基因特异性扩增引物及taqman-MGB探针的设计及合成：

根据突变位点的位置和基因型设计一对基因特异性的上下游扩增引物（扩增产物长度为136bp）和针对野生型及突变型BRAF基因的带有不同荧光素标记的taqman-MGB探针各一条。引物及探针由上海基康生物技术有限公司合成。具体序列如下。

BRAF 扩增引物：

BRAF-F1(forward)：5' CTTACCTAAACTCTTCATAATGCTTGC 3'

BRAF-R1 (reverse)：5' TAGCCTCAATTCTTACCATCCACA 3'

BRAF基因野生型探针：5’-E-AGCTACAGTGAAATC-P-3’

BRAF基因突变型探针：5’-F-AGCTACAGAGAAATC-P-3’

其中：E＝HEX报告染料，F＝FAM报告染料，P＝Taqman-MGB基团

二、肿瘤组织DNA的提取：

（1）样本采集：取2例－80℃冻存的新鲜组织块和3例常温乙醇固定的组织块50～100 mg，将其迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨呈粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响DNA的收率和质量）。加入1 mL DNA提取试剂（宝生物工程有限公司，大连，中国；货号D305A），将研磨成粉末状的样品完全覆盖，用研杵继续研磨至裂解液呈透明状，并恢复至室温。组织裂解液经 10,000rpm/min，4℃离心5分钟以除去大部分组织碎片等杂质，并将上清转移至新的离心管中。所用研钵及研杵用后及时放入0.5 M NaOH 中浸泡过夜，次日用蒸馏水洗净，高压灭菌后备用。

（2）DNA提取及纯化：向上述裂解液中加入500 uL无水乙醇。反复颠倒混匀1～3分钟，出现云雾状的DNA沉淀，使用枪头将DNA缠绕出来转移至新的离心管中。若没有出现DNA沉淀或沉淀量较少且分散时，可以4,000rpm/min室温离心2分钟沉淀DNA。加入1mL 75%的乙醇洗涤DNA沉淀，12,000rpm/min4℃离心5分钟后弃上清。倒置5～10分钟（倒置时间视DNA块状沉淀大小以及DNA干燥的速度决定，注意DNA不可太干燥，否则DNA将难以被溶解，但离心管管壁的乙醇一定要除去）。加入50 uL 消毒三蒸水，用枪头吹打使DNA充分溶解。

（3）DNA浓度及纯度测定：使用PerkinElmer紫外分光光度计，测定DNA浓度。合格指标，符合①OD值A260/A230：2.0-2.2；②A260/A280：1.8－2.0要求之间。

（4）DNA电泳鉴定：提取的DNA 5 uL加 1 uL 6×上样缓冲液，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳160V电泳15分钟，电泳条带比较单一，比较纯。

表1为5例样本DNA的纯度检测结果。

表1

样本号	保存方式	OD₂₆₀	OD₂₆₀	OD_260/280
					1	－80℃冻存	0.2606	0.1263	2.06
2	－80℃冻存	0.1559	0.0844	1.85
					3	常温乙醇固定	0.2435	0.1262	1.93
4	常温乙醇固定	0.2078	0.1218	1.71
					5	常温乙醇固定	0.2339	0.1350	1.73

三、BRAF野生型及突变型阳性对照质粒的制备及鉴定：

选取4例乳头状甲状腺癌病例样本，提取DNA。以所提DNA为模板扩增包含T1799A突变位点的DNA片段，引物序列为BRAF-F2：5'-ATGTTTTAAAGAATATTATA-3'；BRAF-R2：5' -ACTCAGCAGCATCTCAGGGC-3'。PCR反应的条件为94℃预变性5 min; 94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环。使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（宝生物工程有限公司，大连，中国。货号DV805A），按照试剂盒操作说明，割胶纯化DNA产物，并经琼脂糖凝胶电泳鉴定纯度。取4例肿瘤样本的DNA回收产物与T载体16℃连接过夜。次日转化至新鲜感受态JM109菌中，在含有X-gal、IPTG、Amp的琼脂糖平板培养基上培养。挑选白色菌落，扩大培养，提取质粒，进行DNA测序验证。经DNA测序验证后，挑取到BRAF野生型及突变型克隆各一个，甘油菌冻存，并抽取DNA质粒备用。

四、配制PCR反应液：

在冰上进行PCR反应液的配制，各组分的用量和终浓度如表2所示。

表2

试剂	使用量 (uL)	终浓度
			Premix Ex Taq (2×)	10	1×
BRAF-F1 引物 (10 μM)	0.4	0.2 μM
			BRAF-R1 引物 (10 μM)	0.4	0.2 μM
BRAF基因野生型探针 (5 μM)	0.8	0.2 μM
			BRAF基因突变型探针 (5 μM)	0.8	0.2 μM
ROXⅡ 参比染料 (50×)	0.4	1×
			DNA模板	2	约100 ng
灭菌蒸馏水	6
			总计	20

配制PCR反应液时，除DNA模板外，均先做预混和mix，并应包含额外的体积（足够用于一次额外PCR反应）以弥补移液过程中造成的损失。样本分以下几种类型。

① 无模板阴性对照：在预混合mix液中补足1 uL灭菌蒸馏水。

② BRAF野生型阳性对照：在预混合mix液中补足1 uL已按1：10稀释过的BRAF野生型质粒。

③ BRAF突变型阳性对照：在预混合mix液中补足1 uL已按1：10稀释过的BRAF突变型质粒。

④ BRAF杂合子对照：在预混合mix液中补足各1 uL已按1：10稀释过的BRAF野生型和突变型质粒。

⑤ 未知样本：在预混合mix液中补足1 uL待测样品DNA。

五、PCR扩增及结果判读：

（1）使用 ABI 7500 PCR 仪，通过执行以下步骤生成BRAF等位基因鉴别实验的数据和结果：

读取扩增前荧光信号：使用一个等位基因鉴别反应板文件，测定扩增前与引物和探针相关的基线荧光水平；

扩增过程：使用一个绝对定量反应板文件生成实时 PCR 数据，用来分析并在必要时调试 PCR 数据以完成等位基因鉴别实验。PCR反应的条件为95℃预变性30s；95℃变性5 s，60℃退火34s，40个循环；

读取扩增后荧光信号使用原始等位基因鉴别反应板文件，自动减去扩增前读取信号中测得的基线荧光水平，然后使用扩增后的数据进行等位基因分型（自动或手动）。

样本BRAF基因突变类型分析结果如表3所示。

表3

样本号	保存方式	病理类型	分析结果
				1	－80℃冻存	癌旁正常甲状腺	野生型
2	－80℃冻存	对侧正常甲状腺	野生型
				3	－80℃冻存	乳头状癌	V600E突变杂合子
4	－80℃冻存	乳头状癌	野生型
				3	常温乙醇固定	乳头状癌	V600E突变杂合子
4	常温乙醇固定	乳头状癌	野生型
				5	常温乙醇固定	乳头状癌	野生型

<110> 江苏省原子医学研究所

<120> 一种检测BRAF基因突变的方法

<160> 4

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cttacctaaa ctcttcataa tgcttgc 27

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tagcctcaat tcttaccatc caca 24

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agctacagtg aaatc 15

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agctacagag aaatc 15

Claims

1.一种检测BRAF基因突变的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a）提取肿瘤组织DNA；

c）对步骤b）的扩增产物进行BRAF等位基因鉴别分析。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤a）的肿瘤组织DNA由外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、新鲜组织、冰冻切片、石蜡切片样本中提取。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤b）中，PCR的反应条件为92-97℃预变性30s-5min；92-97℃变性10-30s，55-60℃退火30-45s，30-40个循环。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤b）中，PCR反应液的组成为Premix Ex Taq (2×)10μl，序列1）的引物0.2-0.4μl，序列2）的引物0.2-0.4μl，序列3）的探针0.4-0.8μl，序列4）的探针0.4-0.8μl，ROXⅡ参比染料0.4μl，DNA模板2μl，补蒸馏水至20μl。