CN111471772A - 一种用于癌症诊断的分子标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于癌症诊断的分子标志物,本发明通过高通量测序技术首先发现了RP11‑576I22.2在胃腺癌中表达上调,即通过检测RP11‑576I22.2的表达水平可以判断受试者是否患有胃腺癌。本发明同时提供了分子标志物RP11‑576I22.2在治疗胃腺癌中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种用于癌症诊断的分子标志物,所述分子标志物为RP11-576I22.2。
背景技术
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,其全球发病率在所有恶性肿瘤中居第4位,病死率居第2位。每年全球范围新发胃癌近百万例,其中接近50.0%发生在中国。在我国,最近年新发胃癌病例67.9万,在所有肿瘤发病中位于第二,每年胃癌死亡病例49.8万,仅于肝癌,位于第三(W Chen,R Zheng,PD Baade,et al.Cancer statistics in China,2015.CACancer J Clin 2016.)。胃癌最有效的治疗手段为根治性手术,然而,我国早期胃癌诊治率较低,绝大多数病人往往在就诊时已经是进展期,这部分病人即使接受了根治性手术,术后仍有40.0%~70.0%会复发(J Deng,H Liang,D Wang,et al.Investigation of therecurrence patterns of gastric cancer following a curative resection.SURGTODAY 2011,41(2):210-215.)。近年来,由于放疗化疗等多种治疗方法的参与,我国胃癌患者生存略有改善,但远不理想,5年生存率仍徘徊在20%~30%左右(L Yang:Incidenceand mortality of gastric cancer in Ghina.World J Gastroentero12006,12(1):17-20.)。因此,胃癌仍旧是危及我国人民生命健康的主要问题之一,不断深入研究胃癌的发生发展机制,寻求有效分子靶标,为预防、治疗胃癌提供新思路、新方法刻不容缓。
同其它肿瘤一样,胃癌的发生是一个多基因改变、多种信号参与的复杂演变过程。癌基因或抑癌基因可能通过突变或表观遗传学改变激活相关信号传递,进而一步步引发癌变。基因改变如突变、扩增、缺失、等位基因丧失以及染色体转位等都可能使癌基因激活或抑癌基因失去功能,最终引发肿瘤。同时,胃癌的发生也有基因表观遗传学方面的改变,如异常甲基化,组蛋白的重塑以及非编码RNA的参与(J Shi,YP Qu,P Hou:Pathogeneticmechanisms in gastric cancer.World J Gastroenterol 2014,20(38):13804-13819.)。过往对肿瘤发生发展的研究主要关注在蛋白编码基因,然而在基因转录产物中编码蛋白的只占基因组2%,剩下绝大部分为非编码RNA(ncRNAs)。按照长度的不同,ncRNAs分为小分子ncRNA(<200nt),和长链ncRNA(>200nt)。近年来研究发现,原被认为是转录垃圾的非编码RNA有着各种生物学功能,并在肿瘤的发生发展中起着重要的促进或抑制作用。如miRNA通过与靶基因相互作用下调抑癌基因的表达或增强癌基因的表达,从而参与肿瘤的发生、发展(XY Fang,HF Pan,RX Leng,et al.Long noncoding RNAs:novel insights intogastric cancer.CANCER LETT 2015,356(2Pt B):357-366.)。随着1ncRNA在代谢、发育、分化等生理过程中所展现的基因表达调节作用被发现,其引起了研究者们的高度关注。众多研究表明,1ncRNA可通过促进细胞增殖、消除生长抑制、诱导血管生成及抑制调亡等调节作用在肿瘤发生、发展过程中扮演着重要的角色。
目前,lncRNA在胃癌发生、发展中的具体作用与主从关系还不清楚,更有众多胃癌相关1ncRNA作用不明。更好地利用1ncRNA这一新的调控体系解析胃癌病理机制并将其应用具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明经过广泛而深入的研究,通过高通量测序的方法,检测胃腺癌标本中lncRNA在肿瘤组织和正常组织的表达,发现其中具有明显表达差异的lncRNA,探讨其与胃腺癌的发生之间的关系,从而为胃腺癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供了检测RP11-576I22.2的试剂在制备诊断胃腺癌的产品中的应用。
进一步,所述试剂包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术检测RP11-576I22.2表达水平的试剂。
进一步,通过反转录PCR检测RP11-576I22.2表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增RP11-576I22.2的引物,通过实时定量PCR检测RP11-576I22.2表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增RP11-576I22.2的引物,通过原位杂交检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性识别RP11-576I22.2的探针,通过芯片技术检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性识别RP11-576I22.2的探针。
进一步,通过实时定量PCR检测RP11-576I22.2表达水平的特异性扩增RP11-576I22.2的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。
进一步,所述产品包括芯片、试剂盒。所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的特异性识别RP11-576I22.2的寡核苷酸探针,所述试剂盒包括特异性扩增RP11-576I22.2的引物、特异性识别RP11-576I22.2的寡核苷酸探针或芯片。
特异性识别RP11-576I22.2的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制,只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合,任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样,所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长,甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响,所述探针的长度通常至少是14个碱基对,最长一般不超过30个碱基对,与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对,以免影响杂交效率。
所述固相载体包括无机载体和有机载体,所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等;所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
许多表达检测方法使用分离的RNA。起始材料典型地是从生物样品,例如分别从肿瘤或肿瘤细胞系,以及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如果RNA的来源是原发性肿瘤,则可以从冷冻的或保存的石蜡包埋并固定的(例如福尔马林固定的)组织样品(例如病理学家指导的组织核心样品)中提取RNA(例如mRNA)。
RNA提取的一般方法是本领域熟知的。特别地,可以使用来自商业制造商,例如TIANGEN的纯化试剂盒、缓冲剂套组和蛋白酶进行RNA分离,按照制造商的说明进行。其它可商购的RNA分离试剂盒可包括MASTERPURETM Complete DNA和RNA纯化试剂盒(Epicentre,Madison,Wis.)和Paraffin Block RNA分离试剂盒(Ambion,Austin,TX)。例如,可以使用RNA Stat-60(Tel-Test,Friendswood,TX)从组织样品中分离总RNA。例如,可以使用高纯FFPE RNA Microkit,货号04823125001(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)从FFPE中分离总RNA。例如,可以通过氯化铯密度梯度离心分离从肿瘤制备的RNA。此外,可以通过使用本领域技术人员熟知的技术容易地处理大量组织样品。
分离的RNA可用于杂交或扩增测定中,包括,但不限于PCR分析和探针阵列。用于检测RNA水平的一种方法包括使分离的RNA与能与由被检测基因杂交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是,例如,全长cDNA,或其部分,例如长度为至少7,15,30,60,100,250或500个核苷酸并且在严谨条件下足以与本发明公开的内在基因,或任何衍生的DNA或RNA特异性杂交的寡核苷酸。RNA与探针的杂交表示所述的内在基因正在表达。
在一个实施方案中,RNA被固定在固体表面上并与探针接触,例如通过使分离的RNA在琼脂糖凝胶上运行,并将RNA从胶上转移至膜,例如硝酸纤维素膜。在替代的实施方案中,探针被固定在固体表面上,RNA例如在Agilent的基因芯片阵列中与探针接触。技术人员可以容易地改变已知的RNA检测方法以适用于检测本公开的内在基因的表达水平。
在本发明的实施方案中,通过定量RT-PCR评价内在基因表达。许多不同的PCR或QPCR方案是本领域已知的,并可以直接应用它们或者对其进行改变以适用于使用当前所述的组合物来检测和/或定量本发明中所列的内在基因。通常,在PCR中,用至少一种寡核苷酸引物或一对寡核苷酸引物进行反应扩增靶核苷酸序列。一个或多个引物与靶核酸的互补区域杂交,并且DNA聚合酶延伸一个或多个引物以扩增靶序列。在足以提供基于聚合酶的核酸扩增产物的条件下,单一大小的核酸片段在反应产物(靶多核苷酸序列,其是扩增产物)中占优势。重复扩增循环以增加单个靶多核苷酸序列的浓度。可以在任何通常用于PCR的热循环仪中进行反应。但是,优选的是具有实时荧光测量能力的循环仪,例如,(Cepheid,Sunnyvale,CA)、ABI PRISM(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)、ROTOR-GENETM(Corbett Research,Sydney,Australia)、(Roche Diagnostics Corp,Indianapolis,Ind.)、(BioradLaboratories,Hercules,Calif.)和(Stratagene,La Jolla,Calif.)。
本发明提供了一种诊断胃腺癌的产品,所述产品包括检测RP11-576I22.2表达水平的试剂。
进一步,所述产品包括芯片或试剂盒,芯片中检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性识别RP11-576I22.2基因的探针;试剂盒中检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性扩增RP11-576I22.2基因的引物或特异性识别RP11-576I22.2基因的探针。
作为一种实施方案,试剂盒包含一组寡核苷酸引物,所述引物足以检测和/或定量本发明所述的内在基因。寡核苷酸引物可以以冻干或重构的形式提供,或者可以作为一组核苷酸序列提供。在一个实施方案中,以微孔板(microplate)的形式提供引物,其中每一个引物组占用微孔板中的一个孔(或多个孔,如在重复的情况下)。微孔板可以进一步包含足以检测如下所述的一个或多个看家基因的引物。试剂盒可以进一步包含足以扩增本发明所述的基因的表达产物的试剂和说明。
为了便于快速访问,例如为进行比较、检查、恢复、和/或修改,分子特征/表达概况典型地记录在数据库中。最典型地,数据库是可由计算机设备访问的关系数据库,虽然可以使用其它形式,例如作为照片、模拟或数字成像读数、电子表格等的表达概况的手动访问索引文件。无论最初记录的表达模式本质上是模拟的或数字的,表达模式、表达概况(集合的表达模式)和分子特征(相关表达模式)以数字形式储存并通过数据库访问。典型地,数据库在中央设备编辑并维持,可以在本地和/或远程访问。
进一步,特异性扩增RP11-576I22.2基因的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。
本发明提供了RP11-576I22.2在构建预测胃腺癌的计算模型中的应用。
本发明提供了RP11-576I22.2在制备治疗胃腺癌的药物组合物中的应用。
进一步,所述药物组合物包括RP11-576I22.2的抑制剂。
进一步,所述抑制剂降低RP11-576I22.2的表达水平。优选的,所述抑制剂选自核酸抑制物,所述核酸抑制物以RP11-576I22.2或其转录本为靶序列、且能够抑制RP11-576I22.2基因表达或基因转录的干扰分子,包括:shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸,或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
进一步,所述抑制剂为干扰RNA或其构建物。
进一步,所述干扰RNA的序列如SEQ ID NO.5~6所示。
本发明提供了一种治疗药物组合物,所述药物组合物包括RP11-576I22.2的抑制剂。
进一步,所述抑制剂降低RP11-576I22.2的表达水平。优选的,所述抑制剂选自核酸抑制物,所述核酸抑制物以RP11-576I22.2或其转录本为靶序列、且能够抑制RP11-576I22.2基因表达或基因转录的干扰分子,包括:shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸,或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
进一步,所述抑制剂为干扰RNA或其抑制物。
进一步,所述干扰RNA的序列如SEQ ID NO.5~6所示。
本发明提供了RP11-576I22.2在筛选治疗胃腺癌的候选药物中的应用。
进一步,筛选治疗胃腺癌的候选药物的方法包括:
(1)用待筛选物质处理表达或含有RP11-576I22.2基因的体系;和
(2)检测所述体系中RP11-576I22.2基因的表达水平;
若所述待筛选物质可降低RP11-576I22.2基因的表达水平,则表明该待筛选物质为预防或治疗胃腺癌的候选药物。
在本发明中,术语“RP11-576I22.2”位于1号染色体上,基因号为ENSG00000231407,包括RP11-576I22.2基因及其的同源物,突变,和同等型。该术语涵盖全长,未加工的RP11-576I22.2,以及源自细胞中加工的任何形式的RP11-576I22.2。该术语涵盖RP11-576I22.2的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。目前RP11-576I22.2存在四个转录本,转录本ID分别为ENST00000416416.1、ENST00000446102.1、ENST00000421020.1、ENST00000456083.1。一种代表性的RP11-576I22.2的序列如ENST00000416416.1所示。
本领域技术人员知道,在对原始测序结果进行生物信息学分析时,通常会将测序结果和已知的基因进行比对,只要测序片段可以比对到相关基因上,就可以看做是该基因的表达,因此,在提及差异表达的基因时,该基因的不同的转录本同时包含在本发明中。
在本发明的一个实施方案中,通过评价一个或多个主体样品中本发明所述的内在基因的表达模式或表达概况来评估胃腺癌亚型。为了讨论的目的,术语主体,或主体样品,指个体,不管其健康和/或疾病状态。主体可以是受试者、研究参与者、对照主体、筛选主体、或任何由其获得样品的并在本发明的背景下被评估的其他类别的个体。相应地,主体可以被诊断为患有胃腺癌,可以呈现出胃腺癌的一种或几种症状,或者对于胃腺癌的诱发因素,例如家族(遗传)或医疗史(医疗)因素,可以正在接受胃腺癌的治疗或疗法,等等。或者,就任何上述因素或标准而言,主体可以是健康的。应当理解本文使用的术语“健康”是相对于胃腺癌状态而言的,因为术语“健康”不能定义为相应于任何绝对的评价或状态。因此,对于任何特定疾病或疾病标准来说,被定义为健康的个体可以实际上被诊断为患有任何其它一种或多种疾病,或者表现出任何其它一种或多种疾病标准,包括一种或多种除胃腺癌以外的癌症。但是,健康对照优选没有任何癌症。
在特定的实施方案中,预测胃腺癌内在亚型的方法包括收集包含癌细胞或组织的生物样品,例如乳腺组织样品或原发乳腺肿瘤组织样品。“生物样品”意指任何在其中可以检测内在基因表达的细胞、组织、或体液的取样。这种生物样品的实例包括,但不限于活组织检查和涂片。可用于本发明的体液包括血液、淋巴液、尿液、唾液、乳头抽吸液、妇科液体、或任何其它身体分泌液或其衍生物。血液可以包括全血、血浆、血清或任何血液衍生物。在一些实施方案中,生物样品包括乳腺细胞,特别是来自活组织检查的乳腺组织,例如乳腺肿瘤组织样品。可以通过多种技术从主体获得生物样品,包括,例如通过刮擦或擦抹一个区域、通过使用针抽吸细胞或体液、或者通过移除组织样品(即活组织检查)。收集各种生物样品的方法是本领域熟知的。在一些实施方案中,通过,例如,细针抽吸活检,穿刺活检,或切除活检获得乳腺组织样品。可以对细胞或组织应用固定剂和染色液以保存样本并便于检查。生物样品,特别是乳腺组织样品,可以转移至载玻片以进行放大观察。在一个实施方案中,生物样品是福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺组织样品,特别是原发乳腺肿瘤样品。在不同的实施方案中,从病理学家指导的组织核心样品获得组织样品。
本发明的优点和有益效果:
本发明首次发现了RP11-576I22.2基因的表达水平与胃腺癌相关,通过检测受试者样本中RP11-576I22.2的表达水平,可以判断受试者是否患有胃腺癌,以及患胃腺癌的风险,从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种与胃腺癌相关的RP11-576I22.2基因分子标记物,采用分子标记物进行诊断,相比传统诊断手段,更及时、更灵敏、更特异。
附图说明
图1是利用QPCR检测RP11-576I22.2基因在胃腺癌组织中的表达情况图。
图2是siRNA的干扰效率图。
图3是RP11-576I22.2对癌细胞增殖能力的影响图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 筛选与胃腺癌相关的基因标志物
1、样品收集
分别收集4例胃腺癌的癌组织及相对应的癌旁组织样本,进行高通量测序,所有患者术前未进行化疗、放疗以及内分泌治疗。
2、RNA样品的制备及质量分析
使用天根的动物组织总RNA提取试剂盒(目录号为DP431)进行总RNA的提取,步骤详见说明书。
1)匀浆处理
每10-20mg组织加300μl裂解液RL,用研磨杵将组织彻底研磨;随后向匀浆液中加入590μl RNase-Free ddH2O和10μl Proteinase K,混匀后56℃处理10-20min。
2)12,000rpm离心2-5min,取上清进行以下操作。
3)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇,混匀,得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中),12,000rpm离心30s,弃掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。
4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1,12,000rpm离心30s,弃废液,将吸附柱放回收集管中。
5)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液,室温放置15min。
6)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1,12,000rpm离心30s,弃废液,将吸附柱放回收集管中。
7)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW,室温静置2min,12,000rpm离心30s,弃废液,将吸附柱CR3放回收集管中。
8)重复步骤7)。
9)12,000rpm离心2min,倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-Free ddH2O,室温放置2min,12,000rpm离心2min,得到RNA溶液。
11)RNA的质量检测
用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性(电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150V,15min)检测完整性。28S rRNA是18S rRNA的两倍时,说明RNA的完整性较好。
用分光光度计检测RNA的浓度及纯度,OD260/OD280读数在1.8-2.1之间,RNA的质量较高。
3、cDNA文库的构建及测序
cDNA文库的构建及测序由华大基因完成,步骤如下:
1)总RNA DNase I消化:利用DNase I消化Total RNA样品中存在的DNA片段,磁珠纯化回收反应产物,最后溶解于DEPC水;
2)去除rRNA:取消化好的Total RNA样品,使用Epicentre的Ribo-Zero试剂盒去除rRNA,去除之后进行Agilent 2100检测,验证rRNA去除效果;
3)RNA打断:取上一步样品,加入打断Buffer,置于PCR仪中进行热打断,打断到140-160nt;
4)反转录一链的合成:向打断后的样品中加入适量引物,充分混匀后在Thermomixer适温反应一定时间,使之打开二级结构并与引物结合,再加入提前配制的一链合成反应体系Mix,在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA;
5)反转录二链的合成:配制二链合成反应体系,在Thermomixer上适温反应一定时间,合成带有dUTP的二链cDNA,反应产物用磁珠进行纯化回收;
6)末端修复:配制末端修复反应体系,在Thermomixer中适温反应一定时间,在酶的作用下,对反转录得到的cDNA双链的粘性末端进行修复,末端修复产物用磁珠进行纯化回收,最后将样品溶于EB Solution;
7)cDNA 3’末端加“A”:配制加“A”反应体系,在Thermomixer中适温反应一定时间,在酶的作用下,使末端修复的产物cDNA的3’末端加上A碱基;
8)cDNA 5’adapter的连接:配制接头连接反应体系,在Thermomixer中适温反应一定时间,在酶的作用下,使接头与A碱基连接,产物用磁珠进行纯化回收;
9)UNG消化cDNA二链:配制UNG消化反应体系,通过UNG酶消化掉双链DNA中的二链,并用磁珠对产物进行纯化回收;
10)PCR反应及产物回收:配制PCR反应体系,选择适当的PCR反应程序,对上步骤得到的产物进行扩增,对PCR产物进行磁珠纯化回收,回收产物溶于EB溶液中,贴上标签。
11)文库质量检测:使用Agilent 2100Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System对文库质量进行检测;
12)上机测序:检测合格的文库,加入NaOH变性成单链,按照预期上机数据量,稀释至一定的上机浓度。变性稀释后的文库加入到FlowCell内,与FlowCell上的接头杂交,在cBot上完成桥式PCR扩增,最后使用Illumina Hiseq x-ten平台进行测序。
4、生物信息学分析
1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim,trim掉质量<20的碱基,并且删掉N大于10%的reads;
2)tophat比对到参考基因组上,参考基因组版本为GRCh37.p13;
3)cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出;
4)cuffdiff包比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异。
5、结果
测序结果显示,RP11-576I22.2在胃腺癌患者中表达显著上调,提示RP11-576I22.2可能作为检测靶标应用于胃腺癌的早期诊断。
实施例2 QPCR测序验证RP11-576I22.2基因的差异表达
1、按照实施例1的收集方式收集的31例胃腺癌患者癌组织样本和癌旁组织样本对RP11-576I22.2基因差异表达进行大样本QPCR验证。
2、RNA提取
使用天根的动物组织总RNA提取试剂盒(目录号为DP431)进行总RNA的提取,具体步骤参见实施例1。
3、QPCR
根据RP11-576I22.2和GADPH的基因序列设计引物,引物序列如下:
RP11-576I22.2:
正向引物:5′-AGTATGAGGTAGCCAACA-3′(SEQ ID NO.1)
反向引物:5′-AACTTGACTTCTGACATCTT-3′(SEQ ID NO.2)
GAPDH:
正向引物:5′-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3′(SEQ ID NO.3)
反向引物:5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′(SEQ ID NO.4)
使用天根公司的Quant一步法反转录-荧光定量试剂盒(SYBR Green)试剂盒(目录号:NG105)进行PCR反应,反应体系和反应条件如表1所示。在Thermal Cycler RealTime System扩增仪上进行PCR扩增,反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线,2-ΔΔCT法进行相对定量:ΔCT=CT目的基因-CT内参,ΔΔCT=ΔCT处理组-ΔCT对照组,处理组的相对表达值=2-ΔΔCT,对照组的相对表达量=1。
表1 QPCR反应体系和反应条件
4、结果
QPCR结果如图1所示,与癌旁组织相比,RP11-576I22.2在胃腺癌组织中表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05),提示可通过检测RP11-576I22.2的水平判断受试者是否患有胃腺癌,当RP11-576I22.2的水平显著增加时,受试者患有胃腺癌或者存在患有胃腺癌的风险,通过RP11-576I22.2与胃腺癌之间的关系可以设计靶向RP11-576I22.2的干扰RNA从而治疗胃腺癌。
实施例3 RP11-576I22.2的沉默及对胃腺癌细胞的影响
1、瞬时转染
由上海吉码制药技术有限公司设计及合成针对RP11-576I22.2基因的siRNA干扰片段,阴性对照为通用siRNA-NC,RP11-576I22.2-siRNA组:5′-AUCAGAUUUUCAUUCAGACCC-3′(SEQ ID NO.5);5′-GUCUGAAUGAAAAUCUGAUGA-3′(SEQ ID NO.6)。转染前24h接种胃腺癌MGC-803细胞于六孔板中,在细胞密度达50%~70%汇合度时,将培基换成无血清培基。将稀释好的干扰片段与LipofectamineTM2000脂质体轻柔混匀,室温孵育20min,形成转染复合物;然后将上述混合物加到细胞培养基中,轻轻混匀,在5%CO2、37℃培养箱中培养,6~8h后更换完全培养基。48h后检测干扰效率。
2、QPCR检测干扰效率
转染48h后收集各组细胞,提取细胞RNA,检测RNA浓度和纯度后,按照实施例2所述的方法进行QPCR。
3、MTT法检测细胞增殖能力
取RP11-576I22.2-siRNA和阴性对照组细胞,转染后24h,将细胞消化下来,以每孔4×103个细胞接种于96孔板中,每孔体积200μL,每组5个复孔,同时设空白对照(仅加培养基),培养72h,每孔加入5g/L的MTT20μl,37℃继续培养4h后弃掉孔内培养基,加入DMSO150μl,室温孵育10min,微振荡器振荡10min,使结晶物充分溶解,以空白对照孔调零,酶标仪上490nm测定各孔光密度(OD)值,以相对应OD比值表示细胞增殖能力大小。各组取平均值,重复3次。
4、Transwell检测细胞迁移能力
无血清培养基调整各组细胞密度为5×105/ml,加入100μl至Transwell上室,下室加入含15%血清的培养基500μl培养24h后,弃去小室内培养基,PBS洗涤并用棉签轻轻擦拭滤膜上层。甲醇和结晶紫分别进行固定和染色,时长均为20min,显微镜下进行细胞计数。
5、统计学分析
所有的实验均独立重复3次,计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示,组间比较使用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
6、结果
6.1QPCR检测RP11-576I22.2的表达水平
将RP11-576I22.2-siRNA和siRNA-NC分别转染MGC-803细胞检测3组细胞中RP11-576I22.2的表达水平。结果如图2所示,转染RP11-576I22.2-siRNA组细胞中RP11-576I22.2的表达水平较空白对照组和阴性对照组(siRNA-NC)明显下调,差异具有统计学意义。
6.2MTT法检测细胞增殖能力
结果如图3所示,RP11-576I22.2-siRNA组细胞在72h的增殖效率明显低于阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
6.3Transwell检测细胞迁移能力
Transwell迁移结果显示,24h阴性对照组和RP11-576I22.2-siRNA组的细胞穿膜数分别为(229.3±14.64)、(124.0±7.55),差异具有统计学意义(*,P=0.01427)。这表明干扰RP11-576I22.2基因表达能够明显减弱MGC-803细胞的迁移能力。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 徐州医科大学
<120> 一种用于癌症诊断的分子标志物
<150> 201910490076.X
<151> 2019-06-06
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtatgaggt agccaaca 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacttgactt ctgacatctt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatcccatca ccatcttcca g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagccccagc cttctccat 19
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aucagauuuu cauucagacc c 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gucugaauga aaaucugaug a 21
Claims (10)
1.检测RP11-576I22.2的试剂在制备诊断胃腺癌的产品中的应用。
2.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述试剂包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术检测RP11-576I22.2表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,通过反转录PCR检测RP11-576I22.2表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增RP11-576I22.2的引物,通过实时定量PCR检测RP11-576I22.2表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增RP11-576I22.2的引物,通过原位杂交检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性识别RP11-576I22.2的探针,通过芯片技术检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性识别RP11-576I22.2的探针;优选的,通过实时定量PCR检测RP11-576I22.2表达水平的特异性扩增RP11-576I22.2的引物序列如SEQID NO.1~2所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用,其特征在于,所述产品包括芯片、试剂盒。
5.一种诊断胃腺癌的产品,其特征在于,所述产品包括检测RP11-576I22.2表达水平的试剂;优选的,述产品包括芯片或试剂盒,芯片中检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性识别RP11-576I22.2基因的探针;试剂盒中检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性扩增RP11-576I22.2基因的引物或特异性识别RP11-576I22.2基因的探针;优选的,特异性扩增RP11-576I22.2基因的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。
6.RP11-576I22.2在构建预测胃腺癌的计算模型中的应用。
7.RP11-576I22.2在制备治疗胃腺癌的药物组合物中的应用。
8.根据权利要去7所述的应用,其特征在于,所述药物组合物包括RP11-576I22.2的抑制剂;优选的,所述抑制剂降低RP11-576I22.2的表达水平;优选的,所述抑制剂为干扰RNA;优选的,所述干扰RNA的序列如SEQ ID NO.5~6所示。
9.一种治疗胃腺癌的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包括权利要求8中所述的抑制剂。
10.RP11-576I22.2在筛选治疗胃腺癌的候选药物中的应用。
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