CN109609648A - 与肝癌相关的lncRNA标志物及其检测引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与肝癌相关的lncRNA标志物及其检测引物和应用，所述lncRNA标志物为RP11‑284F21.10。本发明通过高通量测序首次发现了RP11‑284F21.10在肝细胞癌患者中的表达显著性上调，QPCR进一步验证了RP11‑284F21.10在肝细胞癌中表达显著上调，提示RP11‑284F21.10可作为生物标志物应用于肝细胞癌的诊断和治疗。

Description

与肝癌相关的lncRNA标志物及其检测引物和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及与肝癌相关的lncRNA标志物及其检测引物和应用，所述标志物为RP11-284F21.10。

背景技术

肝癌是一种临床常见的恶性肿瘤，其分布十分广泛，遍布全球。按照肝脏细胞癌变起因，肝癌一般被分为原发性肝癌和继发性肝癌。继发性肝癌主要是指由其他器官癌变后通过体液转移或浸润肝脏而引起肝脏产生肿瘤组织，多见于胃癌、肠癌等癌症病人。相对继发性肝癌而言，原发性肝癌是指细胞癌变现象起源于肝脏的癌症，是研究肝癌发病发展机制的主要研究对象。原发性肝癌可以依据组织学因素细分为肝细胞癌(HCC)、肝内胆管癌(iCCA)、混合型肝细胞癌(HCC-CCA)、纤维板层癌(FLC)和小儿肝母细胞瘤(Lozano R,Naghavi M,Foreman K,Lim S,Shibuya K,Aboyans V,Abraham J,Adair T,Aggarwal R,Ahn SY et al:Global and regional mortality from 235causes of death for 20agegroups in 1990and 2010:a systematic analysisfor the Global Burden of DiseaseStudy 2010.Lancet 2012,380(98_59):209_5-2128.)。肝细胞癌在所有原发性肝癌中病人占比最大，约为90％(Sartorius K,Sartorius B,Aldous C,Govender PS,Madiba TE:Global and country underestimation of hepatocellular carcinoma(HCC)in 2012andits implications.Cancer epidemiology 2015,39(3):284-290.)，是一种临床最常见的肝癌。在世界范围内，每年新发肝细胞癌患者约有八十万例。近年来，防治肝细胞癌的压力有增无减，有研究预测，至2030年，全球肝细胞癌病人年新发病例可增至一百万。

在过去的十几年中，随着分子生物学技术的不断进步，人们对肝细胞癌细胞中的分子发病机理的认识在不断加深(Zucman-Rossi J,Villanueva A,Nault J-C,Llovet JM:Genetic Landscape and Biomarkers of Hepatocellular Carcinoma.Gastroenterology2015,149(5):1226一1239.e 1224.)。随着基因组学和转录组学大量数据的涌现，可以对肝细胞癌患者进行大样本测序或深度测序，从而发掘出肝细胞癌细胞中分子活动模式细节。目前，多项研究表明，肝细胞癌是一种涉及多种分子变化的异质性恶性肿瘤。高通量测序结果揭示了一些肝细胞癌中的分子变化细节。

在以往的研究中，能够编码蛋白的基因是主要的研究热点。然而，随着测序通量的不断加大，研究人员逐渐将目光转向以往被认为是“垃圾序列”的大量序列片段。随着对于转录组调控理解的不断加深，越来越多的调控因素被逐一定义出来。其中，microRNA,lncRNA等非编码RNA的发现开启了癌症研究的新视角。近年来，长链非编码RNA(lncRNA)因在人类癌症中有着重要功能而被越来越多的研究者所关注。近期发表的许多研究结果显示，lncRNA在肿瘤细胞中有着举足轻重的调控作用，特定的lncRNA的异常表达直接影响到肿瘤细胞的发生发展。同时，已有一些研究表明单个lncRNA的表达情况能够为肿瘤诊断和预后提供帮助。在实际临床工作中，一些癌症的诊断已经开始使用分子标志物。在乳腺癌和大肠癌的诊断中，分子标志物检测已经成为标准，是治疗过程的重要步骤。然而，目前还没有统一的肝细胞癌分子标志物标准。寻找肝细胞癌发生发展相关的lncRNA对肿瘤的诊断和治疗具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与肝细胞癌发生发展相关的分子标志物，所述标志物可以作为肝细胞癌的特异性诊断标志物，应用于肝细胞癌的早期发现；同时所述标志物可以作为肝细胞癌的特异性分子靶标，应用于肝细胞癌的个性化治疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测RP11-284F21.10的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用。

进一步，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中RP11-284F21.10的表达水平的试剂。所述核酸扩增技术包括聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增和基于核酸序列的扩增。

进一步，所述试剂选自：特异性识别RP11-284F21.10的探针；或特异性扩增RP11-284F21.10的引物。

进一步，所述特异性扩增RP11-284F21.10的引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。

本发明提供了一种体外检测RP11-284F21.10表达水平的产品，所述产品包括芯片、试剂盒、核酸膜条。

进一步，所述芯片包括特异性识别RP11-284F21.10的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括特异性扩增RP11-284F21.10的引物，或特异性识别RP11-284F21.10的寡核苷酸探针；所述核酸膜条包括特异性识别RP11-284F21.10的寡核苷酸探针。

进一步，所述特异性扩增RP11-284F21.10的引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。

进一步，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明提供了体外检测RP11-284F21.10表达水平的产品在制备诊断肝细胞癌的工具中的应用。

本发明提供了RP11-284F21.10在构建预测肝细胞癌的计算模型中的应用。

本发明提供了RP11-284F21.10在制备治疗肝细胞癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括RP11-284F21.10的抑制剂，所述抑制剂可以降低RP11-284F21.10的表达水平。

附图说明

图1是利用QPCR检测RP11-284F21.10基因在肝细胞癌组织中的表达情况图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量方法，检测肝细胞癌标本中lncRNA在肿瘤组织和癌旁组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncRNA，探讨其与肝细胞癌的发生之间的关系，从而为肝细胞癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了肝细胞癌中RP11-284F21.10显著性上调，并通过QPCR进一步验证了RP11-284F21.10的上调，差异具有统计学意义。

RP11-284F21.10基因位于1号染色体上，一种代表性的人RP11-284F21.10基因的核苷酸序列具有转录本ENST00000605886.1(序列如SEQ ID NO.1所示)所示的序列。本发明中的RP11-284F21.10包括野生型、突变型或其片段。

本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。

检测技术

本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。

本发明可在检测前或同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

芯片、核酸膜条、试剂盒

本发明提供了检测中RP11-284F21.10基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片、核酸膜条或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于RP11-284F21.10所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

本发明提供了核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的针对RP11-284F21.10的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测RP11-284F21.10的表达。优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

本发明提供了RP11-284F21.10在制备预测肝细胞癌的计算模型中的应用。正如熟练技术人员可以领会的，可以使用两种或更多种标志物的测量来改进调查中的诊断问题。生化标志物可以个别测定，或者在本发明的一个实施方案中，它们可以同时测定，例如使用芯片或基于珠的阵列技术。然后独立解读生物标志物的浓度，例如使用每种标志物的个别截留，或者它们组合进行解读。

在本发明中，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合基因和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于肝细胞癌的风险或与有助于评估肝细胞癌松患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有肝细胞癌风险的个体、具有肝细胞癌的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估肝细胞癌中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与肝细胞癌相关的基因标志物

1、样品收集

分别收集27例原发性肝细胞癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织样本，从中随机选取5例进行高通量测序，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备及质量分析

使用TRIZOL法提取组织总RNA

1)用剪刀组织剪碎，加入1ml Trizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解。

2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min。

3)4℃，11000rpm离心15min。

4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min。

5)4℃，11000rpm离心15min。

6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml 75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。

7)4℃，8000rpm离心5min。

8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。

9)检测RNA浓度，鉴定RNA的产量和纯度。

3、cDNA文库的构建

1)去除rRNA

使用Epicentre的Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

2)片段化RNA

对完整的RNA序列，利用金属离子进行随机打断，将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。

3)反转录合成cDNA

利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以lncRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。

4)连接adaptor

加入End Repair Mix将双链cDNA的粘性末端补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。

5)UNG酶消化cDNA二链

用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。

4、上机测序

使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序。

5、高通量转录组测序数据分析

删除不易检测到的lncRNA，使用工具R-3.3.3中的DESeq2进行生信分析。

1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads。

2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh37。

3)cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出。

4)cuffdiff比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异，差异表达lncRNA的筛选标准：FDR<0.05，abs(log₂FC)>1。

6、结果

高通量测序结果显示，RP11-284F21.10基因在肝细胞癌组织中的表达量显著高于癌旁组织(P<0.001)，提示RP11-284F21.10可以作为可能的检测靶标应用于肝细胞癌的早期诊断。

实施例2QPCR测序验证RP11-284F21.10基因的差异表达

1、利用前面收集的27例患者癌组织样本和癌旁组织样本对RP11-284F21.10基因差异表达进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取

利用Trizol法提取组织RNA，具体步骤参见实施例1。

3、QPCR检测

1)引物设计

根据RP11-284F21.10和GADPH的基因序列设计引物，具体引物序列如下：

RP11-284F21.10基因：

正向引物为5’-GAGCCTACACAATATAAGC-3’(SEQ ID NO.2)；

反向引物为5’-TAACAGCATCATCCACAT-3’(SEQ ID NO.3)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.4)；

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.5)。

2)逆转录反应

采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行lncRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×Fast RT Bμffer 2.0μl，RT EnzymeMix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH₂O 5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

3)QPCR扩增检验

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

采用20μl反应体系：2×SuperReal PreMix Plus 10μl，正反向引物(10μM)各0.6μl，5×ROX Reference Dye^△2μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环。

4)cDNA模板浓度的筛选

将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。

根据溶解曲线，可以看出，当cDNA的进行10倍稀释时，PCR的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好。

5)样品Real Time PCR检测

将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-ΔΔCT法进行相对定量。

4、结果

QPCR结果如图1所示，与肝细胞癌癌旁组织相比，RP11-284F21.10在肝细胞癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致，其中肝细胞癌组织样本中表达上调的有26例，非差异表达的有1例；提示RP11-284F21.10可作为检测指标应用于肝细胞癌的辅助诊断。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 泰山医学院 泰山医学院附属医院

<120> 与肝癌相关的lncRNA标志物及其检测引物和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3222

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atggaatagg ccaatgatgc agcaagagaa ttgaaggtta gactacaggc aggacttcct 60

agagatcagg tttattccac tggctgtgca ctcccattcc aggcccactg tttatccccc 120

atcttccctg ccctctcagc atctgccttc atacctgtcc ctgcactttc ctaagcctga 180

gatgatggga aatttcctac ttttcccaga tcctcccacc tccctgccat cataaccccc 240

atctccccca ctgtgtctgg atatcattcc ctagggtcag agttgggaga ggagtggcac 300

aaccagatgc ttagggcctc tctctgacct ttcagaggga ggaggttctt gatggggcca 360

gattagaggt gcggagacca gctccaggca ttggggtgct tgggaggact gttctggggc 420

tggagtgggg accattgggc aggagcagcc agtgcccacc gggtgctggg aagactgttt 480

gccatgcatc tgagctgtgc cagggcctgg gcctggcccc cttctggtgc cctccctccc 540

ttctctctgg gctggagctg gagctgctca cagacctggc tcccatctct ctgacgggca 600

gcccagagac ccatatagtt ggagtcattt tggggccaac accctggacc accctttcac 660

ctctgtctga cagtgggaga gtgagggaag agggcctaag gccaatgagg acctaactgc 720

tctggaacat ggagggcaac ctacccttga ccccaaaaat gggagtcact gaccagtgag 780

gccaagaggg tagccccgtg cagttctgag agagctctgt ctctccagtc tcgggcctca 840

gcctcccaat tgcagctagg agccctgagg aaactcagac ttccccacat ccggtaccag 900

cctcagaacc caggggtcca gggttctgtg gccttctcta tcccacacac cactcatctc 960

cacttcctct tctcttcctc cagagcaggc cacacctctc caactctaac cctgagagct 1020

cagcagtcat gcggtccgtt cccttgacgc cacaacatcc ccctctctgt ttcagctcca 1080

gcgtctgtat ctctgccctt gttttgaatt tcttgagctg ttcaggaaac tttcctcttg 1140

tcacatcatt tctgtctgac ccgggatgtc catctccctc acagtcttca tagacccaac 1200

ccagagagtt aagaccaggt ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctgtgtgtgt 1260

gtgtgtgtgt gtgtgtgtag gcatgcacgt gtgtacacac atctaacaac acccaccacc 1320

tccatgctga atgcccatca gccggcagcc aaggtctgtc ccataggaac tgagctccag 1380

cactcagcag ggtcagcagg gaggcacaag aagccagagc tttggctata gcaggaggga 1440

agctctctgc taccccctta acggcttcat gaggagcaac atgagcctac acaatataag 1500

cagggcctta gggcctgtag aagtaattgc aatcatcata taaatagtcc tttttattgg 1560

aagcaaaact aataatacta ttagcaatga caccagccga gcagttgcag atccctctcg 1620

tatagaatct gaaatgtgga tgatgctgtt ataaatagca aagttagcca tagcaacata 1680

ggcactggta atactgtggg tgggtctaag ggtaacactg ttccctgatc ttactgtcat 1740

catctgcaat ctaagtaatg cagataataa tggtgcccct tggacttgac gccaatctct 1800

tggtcctatt agaaccatgt aggcagagct attccaatag gtgggggaat acctgacagg 1860

atatggaaat acctgggaga gggaattccc aggcccctgg cagtgctagg aaggaatgca 1920

atagtggtaa ccgaattcca gctaatagtt actgatgtct acctgagcca gttctcctaa 1980

atgcttcctg tggataacct caactgtgag aaaaagattg tttatgtttt gctcattaca 2040

ccgatgagga acccgaggtt cagagaagtc aactaactac cccaaggtca cagagcaagg 2100

agccgagttg ggattccagc cgaaatgggc actccgacca ccccctagag cggctctgat 2160

cggctgtcct gccggactac agtaaggtgt ccccagaagg gttgctggcc gctgctcctg 2220

gagctgcctg tgcgtggggg cacggaggca aggactgatc cggaacgcta ccgccctgcc 2280

tgggacaagg tcggaaatct cggcggccgc gctgggacag gagcgcgcag cagggaagat 2340

gcgaggaccc gaggggttgc tgatcagact gcgagcagca ggggggctgc cactggcaga 2400

gctggaagca tgtagatcag agatggcagc agcagctgca ggcgctcggg gctgtccagc 2460

agcctacccc gctgcggtgt caggagtcga cgagttgggt gccccagagc ctcgaggcaa 2520

gggctgacag gcggggggcg cagaccaggc aggcactccc ttctccctgt ccccgacccc 2580

acggcgggcg gcggggctgc ggaggcactc acctacccag ggctggggtt gggtcgcggc 2640

actgcgaagt ttgtcgcctc ctccgggggt ctcctccggg tgcacggctc agtcctgcag 2700

ctgcagctga gactgcggcg gagactgcgc gagcgtgagg agaggctggg gccgcaggac 2760

attcggaaga gggcgccggc cctcccggcg cagcacaaaa ccccctttct tccccccgcc 2820

cctgccccgc cctccccggg gccgcccccg ccccctggtc gggagcgcgg ggctctcggg 2880

acggtcacgg gacccgctgc cttctctgct tcggctccgg cagcagcggc gagagcaagg 2940

acgagcgaag taggacatcg ttcagcggat gagaagccga gggcttggag tagggaggag 3000

gggcaggagg ggcggggagg gagcgttcgc ccagcgttcg ctgagctaaa ggatgacgat 3060

gttgcagctg gaggggtgga agttggacaa ctggagagtc ttctcgttgt tcaaagaaga 3120

aggaggaggg agtcaattag actgtaagaa gtggatgaag ggagaatggg ggctttgctc 3180

ctgaaaagag acaccctttc taataaaaaa aatggaaaac tc 3222

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagcctacac aatataagc 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taacagcatc atccacat 18

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagccccagc cttctccat 19

Claims (10)

1.检测RP11-284F21.10的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中RP11-284F21.10基因的表达水平的试剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：特异性识别RP11-284F21.10的探针；或特异性扩增RP11-284F21.10的引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增RP11-284F21.10的引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。

5.一种体外检测RP11-284F21.10表达水平的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒、核酸膜条。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述芯片包括特异性识别RP11-284F21.10的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括特异性扩增RP11-284F21.10的引物，或特异性识别RP11-284F21.10的寡核苷酸探针；所述核酸膜条包括特异性识别RP11-284F21.10的寡核苷酸探针。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述特异性扩增RP11-284F21.10的引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。

8.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

9.权利要求5-8任一项所述的产品在制备诊断肝细胞癌的工具中的应用。

10.RP11-284F21.10在构建预测肝细胞癌的计算模型中的应用。