CN108676872A - 一种与哮喘相关的生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与哮喘相关的生物标志物及其应用，所述生物标志物为RP11‑461A8.4。本发明通过高通量测序首次发现了RP11‑461A8.4在哮喘患者中呈现差异表达，并通过QPCR进一步证实RP11‑461A8.4可以有效的区分难治性哮喘、普通哮喘与正常人，提示其作为生物标志物应用于哮喘临床诊断。

Description

一种与哮喘相关的生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种与哮喘相关的生物标志物及其应用，具体地涉及生物标志物RP11-461A8.4在哮喘早期诊断中的应用。

背景技术

支气管哮喘(简称哮喘)目前在全球范围内有较高的发病率，并呈逐渐上升的趋势，是当今世界威胁公共健康最常见的慢性肺部疾病。根据世界卫生组织(WHO)发布的报告指出，目前全球约有3亿哮喘患者，预计到2025年，将新增1亿哮喘患者。目前我国哮喘的平均发病率为2.1％，约为2000万人，且呈逐渐上升趋势，其所造成的社会负担超过了结核病和艾滋病的总和。因此，支气管哮喘已经成为全球范围内亟待解决的公共卫生难题。

难治性哮喘(refractory asthma,RA)为支气管哮喘中的一个亚型，其发病率约占支气管哮喘的5％～10％，但却消耗了哮喘治疗中绝大部分医疗资源，且死亡风险也显著增加。RA含义较广，涵盖了“重症哮喘”、“未控制哮喘’、“难控性哮喘”等表述，且在RA的发展过程中存在嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞等炎症细胞持续浸润，气道平滑肌数量明显增生、肥大，气道口径逐渐缩小，甚至出现狭窄或阻塞，以致出现不可逆性气流受限，最后导致肺功能改变，因而使用常规药物可控制大部分哮喘患者的症状，但对RA患者治疗效果差。

随着人类基因组学与分子生物学技术的发展，哮喘的遗传学研究已成为国际热点。通常认为，哮喘是由免疫、遗传、环境以及其他因素共同作用而引起的多基因遗传病，具有明显的遗传倾向，遗传度大约70％-80％，其发生涉及多个基因的紊乱。研究与哮喘和难治性哮喘相关的生物指标，有可能在将来为哮喘的风险提前预估提供一个新的生物指标，从而为哮喘的诊断和检测以及筛选出易感个体实现早期预防治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与哮喘相关的生物标志物及其应用，使用该生物标志物可以区分普通哮喘与非哮喘、难治性哮喘和非哮喘、难治性哮喘和普通哮喘，通过检测标志物的水平，可以在哮喘的早期进行预警，进行疾病的早期干预以及治疗，提高患者的生活质量，加强防护。

本发明提供了检测RP11-461A8.4的试剂在制备诊断哮喘的产品中的应用。

进一步，所述哮喘为普通哮喘或难治性哮喘。

进一步，所述试剂包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测样本中RP11-461A8.4基因表达水平的试剂。其中样本包括(但不限于)血液、血清、血浆、痰、组织活检物(例如肺样品)。

进一步，所述用实时定量PCR检测RP11-461A8.4基因表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增RP11-461A8.4基因的引物。

优选的，所述引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。

进一步，所述样本为人外周血。

本发明提供了一种体外检测RP11-461A8.4表达水平的产品，所述产品包括检测RP11-461A8.4表达水平的试剂，其中，所述产品包括但不限于芯片、试剂盒、核酸膜条。

进一步，所述试包括针对RP11-461A8.4的特异性引物或探针。

进一步，所述特异性引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。

本发明提供了一种诊断哮喘的试剂盒，所述试剂盒包括检测RP11-461A8.4的特异性引物，所述RP11-461A8.4的特异性引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；扩增管家基因GAPDH的引物对如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。其中，所述哮喘包括普通哮喘和难治性哮喘，当患者RP11-461A8.4的表达水平低于参照水平(非哮喘中的表达水平)时，说明患者患有哮喘或者存在患哮喘的风险，患者RP11-461A8.4的表达水平更为显著的低于参照水平(非哮喘中的表达水平或普通哮喘中的表达水平)时，提示患者患有难治性哮喘或存在患有难治性哮喘的风险。

进一步，所述试剂盒还包括包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。

进一步，所述检测试剂盒还包括使用说明书或标签。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了RP11-461A8.4的表达水平与普通哮喘和难治性哮喘的相关，对于揭示哮喘的发病机理具有重要的意义。

本发明提供了一种诊断产品，通过检测血液中RP11-461A8.4的表达水平，实现普通哮喘和难治性哮喘的早期诊断，从而提高哮喘患者的生活质量。

附图说明

图1是利用QPCR检测RP11-461A8.4在哮喘患者中的表达情况图。

具体实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序方法，检测普通哮喘患者、难治性哮喘患者正常人血液中基因的表达水平，发现其中具有明显具有差异表达的基因，探讨其与哮喘的发生之间的关系，从而为哮喘的早期检测寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了RP11-461A8.4在普通哮喘患者、难治性哮喘患者、以及正常人均呈现显著性差异表达，为哮喘的诊断以及揭示难治性哮喘的发病机理提供了新途径。

本发明中术语“生物标志物”指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。

在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。

RP11-461A8.4

RP11-461A8.4是一种长链非编码RNA，位于16号染色体上，由于它是非蛋白编码的，故不存在蛋白质产物。本发明中的RP11-461A8.4包括野生型、突变型或其片段。在本发明的具体实施例中，一种代表性的转录该RNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明的RP11-461A8.4使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

本发明所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。

试剂盒

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测RP11-461A8.4的表达水平。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种生物标志物的RNA特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、RNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。

这样一种试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。所述生物样品可以是例如细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、细胞器、生物液体、血液样品、尿液样品或皮肤抑制剂和药物(组合物)。在本发明的具体实施例中，所述生物样品为血液样品。

在本发明中，参照样本是自表观健康个体或普通哮喘个体的参照群提供的、用于体外评估目的的生物样本。如本发明所使用的，“参照水平”指在表观健康个体或普通哮喘的参照群中建立的值。

本领域技术人员知道，在进行测量结果与参照浓度比较时，参照浓度可以使用阴性参照样本、阳性参照样本、或包括一种或超过一种这些类型对照的混合参照样本来测定。阴性参照样本优选会包括来自非哮喘的患者或其他。阳性参照样本优选会包括来自有诊断哮喘的受试者的样本。

表述“将测定得到的浓度与参照浓度比较”仅仅用于进一步例示对熟练技术人员显而易见的内容。在对照样本中建立参照浓度。对照样本可以是内部或外部对照样本。在一个实施方案中，使用内部对照样本，即在测试样本中以及在自同一受试者采集的一份或多份其它样本中评估标志物水平以确定所述标志物的水平是否存在任何变化。在另一个实施方案中，使用外部对照样本。对于外部对照样本，将自个体衍生的样本中标志物的存在或量与其在已知患有给定状况或已知有给定状况风险的个体或已知没有给定状况的个体(即“正常个体”)中的存在或量比较。例如，可以将患者样本中的标志物水平与已知与特定哮喘过程相关的水平比较。通常，直接或间接地将样本的标志物水平与诊断关联起来，而且例如使用标志物水平来确定个体是否有哮喘风险。或者，例如，可以将样本的标志物水平同已知与哮喘患者中对治疗的响应、哮喘的诊断、选择针对哮喘的适宜药物的指导、判断疾病进展风险、或跟踪哮喘患者相关的标志物水平比较。根据目的诊断用途，选择适宜的对照样本并在它们中为标志物建立对照或参照值。本领域技术人员知道，在一个实施方案中，自年龄匹配的且没有混淆疾病的参照群体获得此类对照样本。正如本领域技术人员清楚，在对照样本中建立的绝对标志物值会依赖于所使用的测定法。优选使用来自名表征较好的个体(来自适宜参照群体)的样本来建立对照(参照)值。健康个体代表用于建立对照值的一种优选参照群体。

在本发明中，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选的，在数学上组合RP11-461A8.4和一种或多种其他标志物的测定水平，并将组合值与实际的诊断问题关联起来，可以通过任何适宜的现有技术生物信息学方法将标志物值与RP11-461A8.4的测定组合。

优选的，在标志物组合中应用的方法是一种对数函数。优选的，应用此方法的结果是单一值。根据实际的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于哮喘的风险或有助于评估哮喘患者(包括难治性哮喘患者)的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有哮喘风险的个体、哮喘患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易的确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。

术语“引物”表示寡核苷酸，不管是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下，即在存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶并在合适温度和pH下时它能作为合成起点。引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素，其中包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。

在本发明中，术语“包括”用于指短语“包括但不限于”，并与短语“包括但不限于”可以互换使用。

统计学方法

在本发明中，实验至少采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

实施例

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与哮喘相关的基因标志物

1、样品收集

收集3例正常人血液、3例普通成人哮喘患者、3例难治性成人哮喘患者血液外周静脉血3ml，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。

患者纳入标准：

普通哮喘患者符合2008年支气管哮喘防治指南中支气管哮喘诊断标准；难治性哮喘符合《难治性哮喘的诊断与处理专家共识》；三组样本采集时短期内均为服用任何药物；(4)年龄>18岁。

患者排除标准：

合并感染、肺栓塞、慢性支气管炎、肺结核及血液系统疾病的患者；肝脏功能异常的患者。

2、RNA样品的制备及质量分析

使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA，具体步骤详见说明书。利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。

3、构建cDNA文库

利用利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建。

使用试剂盒去除核糖体rRNA，向反应体系中加入fragmentation buffer将RNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加碱基A，连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，加UNG酶消化cDNA二链，最后进行PCR扩增，最后用琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，使用建好的文库上机测序。

4、上机测序

使用Illumina Hiseq X-ten/Miseq测序平台，进行2*100bp/300bp测序，具体操作按说明书进行。

5、高通量转录组测序数据分析

使用TopHat将质控后得到的高质量测序序列与指定的参考基因组比对，参考基因组来自于Ensembl V84，将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，使用R包limma package分析基因的差异表达，筛选标准是p<0.01。

6、结果

RNA-seq结果显示，RP11-461A8.4基因在普通哮喘患者和难治性哮喘患者血液中的表达量显著低于正常人的表达量，且与普通哮喘患者相比，难治性哮喘患者中的表达量显著下调。

实施例2QPCR测序验证RP11-461A8.4基因的差异表达

1、根据高通量测序的检测结果选择RP11-461A8.4基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的方法收集选择普通哮喘患者45例，难治性哮喘患者38例，正常人40例的血液样本。

2、RNA提取

使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA，具体步骤详见说明书。

3、逆转录

采用TIANGEN的FastQμant cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，具体操作详见说明书。

4、QPCR检测

4.1引物设计

根据编码RP11-461A8.4的基因和GAPDH基因的序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

RP11-461A8.4：

正向引物为5’-ACTGAACAAGCAATTACTG-3’(SEQ ID NO.2)；

反向引物为5’-TGGAATCTGGTAGAACAC-3’(SEQ ID NO.3)。

GAPDH：

正向引物为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.4)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.5)。

4.2QPCR扩增检验

采用TIANGEN公司的SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)进行扩增，在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-ΔΔCT法进行相对定量；实验操作按详见说明书。

5、结果

结果如图1所示，与正常人血液相比，RP11-461A8.4在哮喘患者血液中的表达下调，差异具有统计学意义P<0.001，其中，与普通哮喘患者相比，难治性哮喘患者中RP11-461A8.4的表达下调，差异具有统计学意义，其中各组的RP11-461A8.4的表达情况如表1所示，说明使用RP11-461A8.4作为检测靶标具有较高的准确性，其中“+”表示表达下调；“-”表示无明显差异。

表1不同组的RP11-461A8.4的表达情况

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 常州市第二人民医院

<120> 一种与哮喘相关的生物标志物及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1068

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ctgcagctcc ctgggcaccc tcttcccaca gtgtggaagg tggaggctcc cagggcacaa 60

gcagaacacg tgccgcccta aggccaaggc ggagctggct gctgtcgctt ctgcccacat 120

tccatgggtg ctgtcgagct gtaggtccaa gccccacatc aggggagtga gtggggtaca 180

atcctcccat gctgggcccc actctggaga taggcctggg gaatgcccaa gaaggaagcc 240

cagcccttct gggattttca catccacaga gaatgggtgc tggcagccaa cggcaacgag 300

gagaaaagct gaccgccttc tcagatcagg atgaggtgtt tttacaccaa ccccgaggat 360

ctgcagcctt ctcaggttaa attaaacctg tcacagacac aggaagggaa aagagcacat 420

aacaacaatt atattgacat ctaagccagg tcacatgctc tgatttggct gaaattacag 480

gataaaggaa aaatcctata ggcaccatgg ctggaaacaa atggcctcaa aggaacgctg 540

gtggccgtgg ctttgtgcaa cgacagccag tgttgtgtga cccagcgacg tgcaggccag 600

ggagggtacc cttctactga tcaagaggga aagcgggaag gacgcacagc tgtggtttcc 660

aacctgcacg gaggcacccc catgaactca cagagcacca tcagatcctt ctgaattttg 720

aaggaagcaa tgatactctg ctctgctcaa ggccattcat ggtctcaaca ttaacgttac 780

cttgctttat agggtatctt ccctctctct gccaggctgg gttgtggcag tcactgaaca 840

agcaattact gtgaaggtcg acgtggaaaa atgaggcaat gagggtggcg gtgttctacc 900

agattccaag ttgaagaggt gctcgacagg cacacacatc ccatgactaa acaaataaca 960

tgaacatttc tctttatgta ttacttttct agacatccac tataagttgc caggacacaa 1020

atgcttatta ttggggttta cttatttaat aaatggaact gtggggga 1068

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actgaacaag caattactg 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggaatctgg tagaacac 18

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims (10)

1.检测RP11-461A8.4的试剂在制备诊断哮喘的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述哮喘为普通哮喘或难治性哮喘。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测样本中RP11-461A8.4基因表达水平的试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR检测RP11-461A8.4基因表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增RP11-461A8.4基因的引物。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述样本选自人外周血。

6.一种体外检测RP11-461A8.4表达水平的产品，其特征在于，所述产品包括检测RP11-461A8.4表达水平的试剂。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试包括针对RP11-461A8.4的特异性引物或探针。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述特异性引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。

9.一种诊断哮喘的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测RP11-461A8.4的特异性引物，所述RP11-461A8.4的特异性引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。