CN102140518A - 肺癌相关表皮生长因子受体egfr外显子突变定量检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒，它包括：扩增EGFR基因18，19，20，21外显子的引物、测序引物和亲和素标记的磁珠。本发明还公开了上述试剂盒的制备方法和使用方法。本发明检测方法不仅灵敏度高，可检测低至1％的突变，而且结果直观，判读更加简单、准确、快速，大大降低检测结果的假阴性率，避免临床上患者无效的靶向药物选择，为患者节省宝贵的治疗时间，提高患者生活质量。
Description
技术领域
本发明属分子病理诊断领域，具体涉及一种用于准确定量检测与肺癌相关的表皮生长因子受体EGFR突变的方法。
背景技术
肺癌危害性大且致死率高，目前是全世界癌症死因的第一名，1995年全世界有60万人死于肺癌，而且每年人数都在上升，2003年世界卫生组织(WHO)公布的死亡率是110万/年，发病率是120万/年，肺癌中75％～80％为非小细胞肺癌。晚期肺癌病人采用放、化疗等治疗手段不仅降低了生存质量，且疗效不佳。易瑞沙(Iressa，即吉非替尼Gefitinib)是目前临床使用最为成功的晚期肺癌靶向治疗药物，为EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase inhibitors，TKI)，临床试验证实对东方人(亚洲人为主)、女性、非吸烟者、肺泡细胞癌或腺癌患者的疗效较好。进一步的研究表明，非小细胞肺癌患者EGFR基因(NG-007726)上18，19，20，21外显子上的突变状态与易瑞沙治疗效果显著相关，其中携带18，19，21外显子的突变型的非小细胞肺癌患者对易瑞沙治疗效果明显好于非突变型患者，而携带20外显子上的突变型则对易瑞沙耐受。
目前，测序方法仍然是检测核酸序列突变的金标准，但是该方法对于所取样本中的肿瘤细胞的比例要求较高，一般大于50％，并且突变率低于20％的核苷酸突变，不能有效检测和判读，因此会造成假阴性。相比于测序技术，其它分子生物学检测方法，如荧光定量PCR，高效液相色谱技术等，存在结果不能准确定量等问题，因此会导致假阳性或假阴性。
Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术是新一代DNA序列分析技术，被广泛用于基因型分析领域。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须特殊的荧光标记，操作极为简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。相比传统测序技术和荧光定量PCR检测方法，降低了样本取材的要求(只需较少的肿瘤组织，低肿瘤细胞含量仍可检测)，具有更高的灵敏度，可定量检测低至1％的突变，准确性高，更适合于高通量分析，结果直观，判读更加简单、准确、快速，具有无可比拟的优势。
本发明通过对EGFR基因型序列分析，设计了特异的生物素标记引物，利用PCR和焦磷酸测序技术，准确定量检测与肺癌相关的表皮生长因子受体EGFR外显子突变频率。该方法可快速准确的定量基因型频率，其重要意义在于：(1)指导肺癌患者有针对性用药，避免无效用药；(2)改善预后；(3)避免获得耐药；(4)降低对样本组织的取材要求；(5)减少医疗费用。对以EGFR为靶点的靶向药物，如易瑞沙，仅对EGFR突变基因型(18，19，21外显子)有效，EGFR20外显子突变基因型会导致耐药，因此，启动靶向治疗前应进行突变检测。未经靶点检测或检测结果假阴性或假阳性而盲目用药不仅可能导致高额的经济损失，还可能会贻误宝贵的治疗时机，甚至导致病情恶化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种准确定量检测与肺癌相关的表皮生长因子受体EGFR外显子突变检测试剂盒。
本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒，它包括：
(1)扩增EGFR基因18，19，20，21外显子的引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8所示引物对；
(2)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：9SEQ ID NO：10SEQ ID NO：11SEQ ID NO：12所示；
(3)亲和素标记的磁珠；
其中，SEQ ID NO：4SEQ ID NO：5SEQ ID NO：6SEQ ID NO：7在其5’端标记生物素；
在一次检验中共同使用。
上述肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒，具体包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂：购自QIAGEN公司；
(2)反应液：PCR Buffer，引物SEQ ID NO：1～12，2mM MgCl2，0.2mM dNTPs，2U/μLTaq DNA聚合酶；
其中，PCR Buffer具体为：0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明胶，0.06％(w/v)g/mL BSA，0.1％(v/v)Tween-20，0.06M pH8.9 Tricine。
(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2MNaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
其中，结合缓冲液具体为：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％(v/v)Tween-20；退火缓冲液具体为：20mM pH 7.6Tris-Acetate，2mM醋酸镁。
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。
上述肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
(1)提取石蜡标本组织中的基因组DNA；
(2)以步骤(1)中所得DNA为模板，扩增EGFR基因18，19，20，21外显子序列片段；
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)测序得到SNP突变频率。
步骤(2)中所述的扩增EGFR基因18外显子序列片段的方法如下：
PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：10.3μL，SEQ ID NO：50.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。
步骤(2)中所述的扩增EGFR基因19外显子序列片段的方法如下：
PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：20.3μL，SEQ ID NO：60.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。
步骤(2)中所述的扩增EGFR基因20外显子序列片段的方法如下：
PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：30.3μL，SEQ ID NO：70.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。
步骤(2)中所述的扩增EGFR基因21外显子序列片段的方法如下：
PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：40.3μL，SEQ ID NO：80.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。
有益效果：本发明的一种用于准确定量检测与肺癌相关的表皮生长因子受体EGFR外显子突变的试剂盒，应用焦磷酸测序技术可以准确定量突变位点的突变频率，可用于临床启动EGFR-TKI用于治疗非小细胞肺癌前的靶标位点EGFR突变检测。本发明方法操作简单，敏感性高，降低了样本取材要求，结果易于判读，大大降低了检测结果的假阳性或者假阴性率，为患者避免无效有害的治疗，节省宝贵的治疗时间。
附图说明
图1为1例病人石蜡活检组织标本18外显子G719S检测结果图，GGC，未发生突变。
图2为1例病人石蜡活检组织标本19外显子2235_2249del15检测结果图，未发生缺失。
图3为1例病人石蜡活检组织标本20外显子T790M检测结果图，ACG，未发生突变。
图4为1例病人石蜡活检组织标本21外显子L858R检测结果图，CTG，突变率为2.1％。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：试剂。
(1)DNA提取试剂：
购自QIAGEN公司。
(2)反应液：
PCR Buffer：购自美国Fermentas公司；
引物SEQ ID NO：1～12，由上海英俊生物科技有限公司合成；
MgCl2：购自美国Fermentas公司；
0.2mM dNTPs：购自美国Fermentas公司；
2U/μL Taq DNA聚合酶：购自美国Fermentas公司。
(3)单链纯化试剂：
75％(v/v)乙醇溶液：购于杭州长征化学试剂有限公司；
0.2M NaOH：购于上海试四赫维化工有限公司；
10mM Tris-Acetate(pH 7.6)：Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司；
结合缓冲液：由10mM Tris-HCl(Tris-base购于美国Sigma公司，盐酸购于杭州化学试剂有限公司)，2M NaCl(购于上海试四赫维化工有限公司)，1mM EDTA(购于杭州化学试剂有限公司)，0.1％(v/v)Tween 20(购于美国Sigma公司)组成；
退火缓冲液：由20mM Tris-Acetate(pH 7.6)(Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司)，2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组成；
亲和素标记的磁珠(购于GE healthcare Bioscience AB)。
(4)测序试剂：
DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶：购于QIAGEN公司；
底物APS和荧光素：购于QIAGEN公司；
四种dNTP(dATP S，dTTP，dCTP，dGTP)：购于QIAGEN公司。
实施例2：检测方法。
仪器：Bio-Rad S1000 PCR仪，Beckman Microfuge 22R台式微量冷冻离心机，北京六一琼脂糖凝胶电泳仪、上海培清凝胶成像系统，QIAGEN PyroMark Q96ID测序仪。(1)提取石蜡标本组织DNA，具体步骤如下：将石蜡标本置于二甲苯中，去除石蜡；加入裂解缓冲液和蛋白酶K，在变性条件下消化组织，裂解细胞；置于90℃孵育，逆转福尔马林交联；将裂解液通过硅胶膜使DNA吸附到硅胶膜上，加入漂洗液洗涤杂质，最后将高纯、浓缩的DNA从硅胶膜上洗脱，得到基因组DNA收集液。
(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用EGFR特异性引物进行PCR扩增；
扩增EGFR基因18外显子序列片段的方法如下：
PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：10.3μL，SEQ ID NO：50.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。
扩增EGFR基因19外显子序列片段的方法如下：
PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：20.3μL，SEQ ID NO：60.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。
扩增EGFR基因20外显子序列片段的方法如下：
PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：30.3μL，SEQ ID NO：70.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。
扩增EGFR基因21外显子序列片段的方法如下：
PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：40.3μL，SEQ ID NO：80.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化：
●在使用前，保证所有溶液都达到室温；
●在PSQ 96板中加入45μl annealing buffer，然后每孔加入SEQ ID NO：3测序引物(10uM)1uL；
●使用Vertex混匀Sepharose beads，将需要使用的sepharoe beads总量(每样本3μL)转移到一个Eppendorf管中，在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每个样品约有50μL的体积，将混合物混匀；
●将以上混合物加入PCR产物(50μL反应体积)中，每样本50μL，将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合；
●在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180mL高纯水、70％乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer；
●打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30秒，然后将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads，将vacuum prep tool放入70％乙醇中5秒，然后移到denatureation buffer中5秒，再移到washing buffer中清洗10秒，把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵，将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharose beads；
●使用高纯水清洗vacuum prep tool。
将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80℃2分钟，再冷却到室温后放入测序仪中。
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)测序结果读取突变频率。
将本发明方法用于1例临床活检石蜡组织标本的鉴定，测序图如图1～4所示。结果经Saner测序验证正确。
Claims (7)
1.一种肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒，其特征在于它包括：
(1)扩增EGFR基因18，19，20，21外显子的引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8所示引物对；
(2)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：9～12所示；
(3)亲和素标记的磁珠；
其中，SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7在其5’端标记生物素；
在一次检验中共同使用。
2.根据权利要求1所述的肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒，其特征在于它包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂：购自QIAGEN公司；
(2)反应液：PCR Buffer，引物SEQ ID NO：1～12，2mM MgCl2，0.2mM dNTPs，2U/μLTaqDNA聚合酶；
(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2MNaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。
3.肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于它包括如下步骤：
(1)提取石蜡活检标本组织中的基因组DNA；
(2)以步骤(1)中所得DNA为模板，扩增EGFR基因18，19，20，21外显子序列片段；
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)测序得到SNP突变频率。
4.根据权利要求3所述的肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的扩增EGFR基因18外显子序列片段的方法如下：
PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：10.3μL，SEQ ID NO：50.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。
5.根据权利要求3所述的肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的扩增EGFR基因19外显子序列片段的方法如下：
PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：20.3μL，SEQ ID NO：60.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。
6.根据权利要求3所述的肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的扩增EGFR基因20外显子序列片段的方法如下：
PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：30.3μL，SEQ ID NO：70.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。
7.根据权利要求3所述的肺癌相关表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的扩增EGFR基因21外显子序列片段的方法如下：
PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：40.3μL，SEQ ID NO：80.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；40个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。
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| 王玉丽: "《非小细胞肺癌中EGFR基因状态的检测》", 《中国肺癌杂志》 * |
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