CN106011263B - 用于检测与胃癌相关的ndrg4基因甲基化程度的试剂盒及其应用 - Google Patents

用于检测与胃癌相关的ndrg4基因甲基化程度的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是一对NDRG4基因甲基化特异性扩增引物对及甲基化特异性测序引物，具体核苷酸序列如下：上游引物：5'‑AGGGTTGGGGGTTTTAGA‑3'；下游引物：5'‑Biotin‑CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT‑3'；测序引物：5'‑GGGGTTTTAGAGTGTAT‑3'，优点是检测简单方便、针对性强、检测准确率和效率高，用于制备胃癌早期诊断的试剂或试剂盒。

Description

用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及一种辅助胃癌早期诊断的方法，尤其是涉及一种用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒及其应用。
背景技术
胃癌是起源于胃上皮的恶性肿瘤，为世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。其发病率和病死率高居全球第4位和第3位，是一种严重威胁人类生命健康的疾病。在中国，胃癌的发病率达29.9/10万，死亡率达22.3/10万。与世界各国相比，中国胃癌人群中男、女性世界癌症死亡率高居于首位。随着医疗手段的发展及健康观念的普及，尽管胃癌的发病率和死亡率呈下降趋势，但总体预后仍然较差。因胃癌患者的起病症状不典型和胃的解剖位置的特点等原因，使得胃癌的早期诊断和及时治疗受到较大的限制，临床发现的胃癌多处于晚期，从而使患者失去最佳治疗时期。同时临床亦有大量事实证明，恶性肿瘤若在病变初期就给予及时治疗，其治愈率可迅速提高。从疾病筛查和预防角度来看，胃癌发病机制的研究，尤其是应用于早期诊断方面的生物标记物相关研究迫在眉睫。
胃癌的发生发展是一个多因素、多阶段、多基因异常表达累积的病变过程。近年来研究发现，除了遗传学改变，表观遗传学改变亦参与了胃癌的发生发展过程。表观遗传学修饰是指不涉及基因组的碱基序列改变，却能导致可遗传性的表型变异，主要包括DNA甲基化修饰、组蛋白修饰、RNA编辑等。DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰，异常的DNA甲基化水平将导致基因表达异常。肿瘤基因组CpG岛甲基化的改变以高甲基化为主。近年来，随着表观遗传学研究的逐渐开展和深入，基因体区的甲基化变化在调控基因表达过程中也发挥了关键作用，研究人员发现，3’端CpG位点的甲基化与基因表达的关系最为密切，揭示其为胃癌发生的另一重要机制。因此，抑癌基因基因体区CpG岛高甲基化的发生也可作为胃癌早期诊断的生物标志物。另外，与遗传学改变不同，甲基化过程不改变DNA的一级结构，通过逆转甲基化过程，沉默的抑癌基因可能重新表达，这也为胃癌的治疗提供了一条新途径。
N-myc下游调控基因4（N-Myc downstream regulated gene 4，NDRG4）属于NDRG家族成员之一，能通过调节靶基因的转录发挥生物学作用。目前，NDRG4与肿瘤相关性的研究备受重视。有研究表明，NDRG4的表达水平随着胶质瘤恶性程度的升高而降低，提示NDRG4基因的抑癌效应具有肿瘤细胞来源特异性。另外，NDRG4基因在结肠癌组织中的表达较正常结肠组织明显降低，且其表达量增加可减少肿瘤细胞的增殖及侵袭，提示该基因甲基化可作为临床对肿瘤早期诊断的候选指标。
本项目采用焦磷酸测序方法检测胃癌患者癌组织与癌旁组织DNA中NDRG4基因3’端CpG岛的甲基化水平，提供操作简便、特异性好、周期短、检测结果稳定可靠的甲基化定量检测方法，同时为患者的治疗随访和预后评估提供科学依据。目前，国内外还没有公开任何关于在胃癌中运用焦磷酸测序法检测NDRG4基因3’端CpG岛甲基化程度的检测试剂盒的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测简单方便、针对性强、检测准确率和效率高的用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒，包括一对NDRG4基因甲基化特异性扩增引物对及甲基化特异性测序引物，具体核苷酸序列如下：
上游引物：5'- AGGGTTGGGGGTTTTAGA-3' ；
下游引物：5'-Biotin-CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT-3' ；
测序引物：5'-GGGGTTTTAGAGTGTAT-3' 。
还包括甲基化特异性PCR反应体系，其组成为：ZymoTaqPreMix 10.0 μl；浓度为5μM的上、下游引物各1.0 μl；H2O 6.5 μl，甲基化修饰的DNA样本模板1.5 μl；PCR反应条件如下： 95℃预变性10min； 95℃变性30s，55.4℃退火40s，72℃延伸1min，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃ 7min。
上述用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒的用途，其特征在于：用于制备胃癌早期诊断的试剂或试剂盒。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒及其用途，所述的检测试剂盒包含用于检测NDRG4基因3’端CpG岛甲基化的一对特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物。该试剂盒通过焦磷酸测序技术检测人体组织中是否存在胃癌早期NDRG4基因甲基化修饰变化。此技术的基本原理：采用生物素标记的引物进行PCR扩增，将PCR产物纯化并变性为单链后，向其中加入四种酶的混合物：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶及三磷酸腺苷双磷酸酶。在测序过程中，每次加入一种类型的dNTP，若该dNTP能与模板链互补配对，则在四种酶的作用下发生一系列的反应，最终将荧光信号转换成电信号体现出来，显示为一个个高度不一的峰，峰的高度与碱基的个数成正比。反之，当dNTP不能与模板链结合时，将直接被三磷酸腺苷双磷酸酶降解，相应的将不会显示峰值。原始数据会被软件自动转化为序列信息，通过软件直接显示的NDRG4基因甲基化率判断受试者患胃癌的风险。该试剂盒可解决样本中DNA含量少、丢失率高、带有致癌污染物等缺陷，相对传统胃癌检测技术具有发现早，灵敏度高，周期短、简单、方便，检测效率高，针对性强，检测结果准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于胃癌的早期发现和及时治疗。
附图说明
图1为根据TCGA数据中450K甲基化芯片和mRNA测序数据的相关性确定了NDRG4基因3’端CpG岛被检测序列所在全基因组的位置，以及所检测的5个CpG点之间的关联性分析结果（例如CpG1与CpG2的相关系数为0.88，CpG2与CpG3的相关系数为0.66）；
图2为癌组织甲基化水平检测结果示例，如图示CpG1到CpG5的甲基化程度分别为38%，29%，38%，36%，44%；图中阴影部分显示的是对应CpG位点的信号强度，结合该位点附近碱基种类可分析得到其甲基化水平（即阴影框对应的上方数字）；
图3为癌旁组织甲基化水平检测结果示例，如图示CpG1到CpG5的甲基化程度分别为13%，9%，17%，12%，19%；
图4为NDRG4基因甲基化水平在癌组织与癌旁组织的比较；
图5为NDRG4基因甲基化在诊断胃癌时的ROC曲线。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
1、研究对象和样本的收集
收集浙江省杭州市某医院2007年12月至2010年2月普外科手术切除的胃癌组织以及相应配对的癌旁正常组织各110例，其中癌组织取自肿瘤组织的中心位置，癌旁组织距离癌组织5cm以上且为非癌组织，所有病例手术前均未行放疗和化疗并经病理组织学检查证实。患者年龄21~83岁，其中男性76例，女性34例；有吸烟史30例，无吸烟史80例；有饮酒史28例，无饮酒史82例；肿瘤大小：≥6cm 43例，<6cm 67例。根据美国癌症联合委员会(AJCC)胃癌TNM分期：I和II期17例，III和IV期93期；无淋巴结转移16例，有淋巴结转移94例；组织分化程度：高分化或中分化47例，低分化或无分化63例。所取标本离体后立即于液氮罐转运，然后存在于-80℃冰箱。
纳入标准：①初治的胃癌患者；②胃部病变均经病理证实；③胃部病灶要求为原发病灶，而非转移病灶；④术前未行放化疗；⑤无其他恶性肿瘤病史。
排除标准：①无法得到病理证实的胃部病变；②有严重的未控制的内科疾病或急性感染者；③妊娠或哺乳期妇女。
预设最长随访时间5年，以胃癌患者死亡为终点事件，生存时间从术日算起。
所有入组对象均告知并签署知情同意书。
2、全基因组DNA的提取
采用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen, Hilden, 德国）DNA提取试剂盒提取组织全基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific, 美国）检测所得DNA的浓度，以供NDRG4基因甲基化水平的检测。
3、甲基化修饰
采用EZ DNA Methylation GoldTM Kit甲基化转化试剂盒（Zymo research, 美国），严格按照试剂盒说明步骤进行操作。经此步后，DNA序列中未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)。
4、TCGA数据库450K甲基化和mRNA测序数据的相关性分析
下载TCGA数据库中胃癌患者癌组织Illumina Human Methylation 450K甲基化芯片数据和IlluminaHiSeq_RNA-SeqV2基因表达数据。提取NDRG4基因基因体区所有CpG位点的甲基化数据和基因表达数据做相关性分析，可见图1中与基因表达高度负相关的CpG位点富集于靠近3’端的CpG岛（CpG：41），因此，发明人用焦磷酸测序法检测NDRG4基因3’端CpG岛的甲基化水平。
5、焦磷酸测序法
本实验采用焦磷酸测序技术对NDRG4基因3’端CpG岛的5个CpG位点（图2）进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：采用生物素标记的引物进行PCR扩增，将PCR产物纯化并变性为单链后，向其中加入四种酶的混合物：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶及三磷酸腺苷双磷酸酶。在测序过程中，每次加入一种类型的dNTP，若该dNTP能与模板链互补配对，则在四种酶的作用下发生一系列的反应，最终将荧光信号转换成电信号体现出来，显示为一个个高度不一的峰，峰的高度与碱基的个数成正比。反之，当dNTP不能与模板链结合时，将直接被三磷酸腺苷双磷酸酶降解，相应的将不会显示峰值。本次研究采用PyroMarkAssay Design2.0 软件进行引物设计，NDRG4基因3’端CpG岛甲基化水平的甲基化特异性引物对及测序引物序列如下：
上游引物：5'- AGGGTTGGGGGTTTTAGA-3' ；
下游引物：5'-Biotin-CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT-3' ；
测序引物：5'-GGGGTTTTAGAGTGTAT-3' 。
20 μl的甲基化特异性PCR反应体系的组成为：ZymoTaqPreMix 10.0 μl；上、下游引物各1.0 μl（5 μM）；H2O 6.5 μl，甲基化修饰的DNA样本模板1.5 μl。PCR反应条件如下：（1）95℃预变性10min；（2）95℃变性30s，55.4℃退火40s，72℃延伸1min，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃ 7min。
焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液（PyroMark Annealing Buffer; Qiagen）；将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量（每样本3μl）转移到一个微量离心管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液（PyroMark Binding Buffer; Qiagen），使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物（50μl反应体积）中，每样本50μl；将PCR产物在常温下混匀10min，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液（PyroMark Wash Buffer; Qiagen）和120ml的变性缓冲液（PyroMark Denaturation Solution; Qiagen）；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30s；然后将真空准备工具（PyroMark Vacuum Prep Filter Probes;Qiagen）移到PCR板中，抓取琼脂糖珠（在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作）；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5s；然后移到变性缓冲液中5s；再移到洗涤缓冲液中清洗5－10s；关掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠（测序引物也可最后加入）；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃ 2min，再冷却到室温，随后放在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上。
焦磷酸测序：在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒（Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen; #978802）对PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析（甲基化水平检测结果示例见图2和图3）。
6、焦磷酸测序结果计算
应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析。图2和图3中所示百分数为对应NDRG4基因CpG位点的甲基化程度，图2所示癌组织中CpG1到CpG5的甲基化程度分别为38%，29%，38%，36%和44%；图3所示癌旁组织中CpG1到CpG5的甲基化程度为13%，9%，17%，12%和19%。由于5个CpG位点之间的甲基化率相关系数较高（相关系数均大于0.6，P值小于0.001），发明人取其均值代表整体甲基化水平进行后续分析。
7、结果分析
本次实验采用SPSS 18.0对数据进行整理分析。发明人对3’端CpG岛甲基化水平进行配对t检验，发现：癌组织中NDRG4基因甲基化水平高于癌旁组织，且差异有统计学意义(P值小于0.001，见图4)。为了定量地反映NDRG4基因甲基化诊断胃癌风险的准确性大小，发明人进一步分析了其受试者工作特征曲线（ROC曲线）。图5显示，焦磷酸测序检测NDRG4基因甲基化诊断胃癌风险的ROC曲线下面积（AUC）为0.635，与0.5相比差异有统计学意义（P =0.001），提示用焦磷酸测序该基因甲基化用于胃癌早期诊断的准确性较高。因此，可以找出最佳诊断分界点用于实际诊断。一般可以将正确诊断指数最大的分界点确定为最佳诊断分界点，即图5中最靠近坐标图左上方的点为敏感性和特异性均较高的临界值，该点对应的纵坐标为敏感性，横坐标为（1-特异性）。因此，焦磷酸测序检测NDRG4基因甲基化用于诊断胃癌的敏感性为39.1%，特异性为90.0%。
发明人以癌组织甲基化率均数20%为临界值（此临界值与最佳诊断分界点相近），将甲基化水平分为高甲基化和低甲基化，发现：携带高甲基化NDRG4基因的人群患胃癌的危险性为不携带高甲基化NDRG4基因的6.413倍（P = 5.08E-7，见表1）。
表1 NDRG4基因3’端CpG岛甲基化水平在癌组织与癌旁组织间的比较
例数 高甲基化 低甲基化 优势比（95%可信区间） P值
NDRG4基因
癌组织 110 40 70 6.413（2.926-14.055） 5.08E-7
癌旁组织 110 9 101
注： P值小于0.05，具有统计学意义。
表2中只对癌组织进行比较，发现NDRG4基因3’端CpG岛甲基化差异与不同的危险因素（性别、肿瘤部位、肿瘤大小、淋巴结转移情况、TNM分期、吸烟饮酒史）无关（P值均大于0.05），但年龄小于50岁的胃癌患者NDRG4基因甲基化率（63.64%）要高于年龄大于50岁的胃癌患者（24.68%），且差异有统计学意义（P < 0.001）；肿瘤分化程度低的患者NDRG4基因甲基化率（47.62%）要高于分化程度高的患者（21.28%），且差异有统计学意义（P = 0.004）。因此，NDRG4基因3’端CpG岛高甲基化是胃癌发生的危险因素。
表2 NDRG4基因甲基化水平与胃癌患者临床特征的关系
临床特征 例数 NDRG4低甲基化 NDRG4 高甲基化 P值
性别 0.258
男 76 51 25
女 34 19 15
年龄 < 0.001
< 50岁 33 12 21
≥ 50岁 77 58 19
肿瘤部位 0.210
上段 25 19 6
中段 25 13 12
下段 60 38 22
肿瘤大小 0.337
< 6cm 67 45 22
≥ 6cm 43 25 18
分化 0.004
中高分化 47 37 10
低分化 63 33 30
淋巴结转移 0.307
阳性 94 58 36
阴性 16 12 4
TNM分期 0.517
I +II期 17 12 5
III+ IV期 93 58 35
饮酒史 0.591
是 28 19 9
否 82 51 31
吸烟史 0.195
是 30 22 8
否 80 48 32
疾病复发 0.093
是 20 16 4
否 90 54 36
注： P值小于0.05，具有统计学意义。
本发明试剂盒利用焦磷酸测序法检测胃癌患者组织样本中NDRG4基因甲基化程度，具有以下显著特点：（1）操作简便，周期短。该试剂盒可同时测定96个样本，大大缩短检测时间，适合医院或研究所大规模推广应用。（2）稳定性。该试剂盒在-20℃温度下可保存12个月，其灵敏度和特异度都没有下降。本项目开发计划采用分析胃癌患者术后癌组织与癌旁组织DNA中的NDRG4基因甲基化程度，结合现代的生物信息技术和统计学原理，提供操作简便、灵敏度高、周期短、检测结果稳定可靠的甲基化定量检测方法，同时为患者的治疗随访和预后评估提供科学依据。
在本发明中，所述DNA样本可以来源于任何生物样品；更优选地，所述待测DNA选自组织(包括石蜡包埋组织)、细胞、血液、血清、血浆、唾液、精液、尿液，粪便及其他分泌物。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
Figure IDA0001032302980000021

Claims (2)

1.一种检测NDRG4基因甲基化试剂在制备检测胃癌焦磷酸测序试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂包括上游引物：5'-AGGGTTGGGGGTTTTAGA-3'；下游引物：5'-Biotin-CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT-3'；
测序引物：5'-GGGGTTTTAGAGTGTAT-3'。
2.根据权利要求1所述的检测NDRG4基因甲基化试剂在制备检测胃癌焦磷酸测序试剂盒中的应用，其特征在于试剂盒中还包括甲基化特异性PCR反应体系，其组成为：ZymoTaqPreMix10.0μl；浓度为5μM的上、下游引物各1.0μl；H2O6.5μl，甲基化修饰的DNA样本模板1.5μl；PCR反应条件如下：95℃预变性10min；95℃变性30s，55.4℃退火40s，72℃延伸1min，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃7min。
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