CN110055326B

CN110055326B - 预测肾透明细胞癌复发转移的分子标记物及其应用

Info

Publication number: CN110055326B
Application number: CN201910176747.5A
Authority: CN
Inventors: 王萍; 任雨; 王雪; 孙树本; 陈一勇
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: CN110055326A

Abstract

本发明公开了一种预测肾透明细胞癌复发转移的分子标记物及其应用。一种能够用于ccRCC转移早期诊断的生物标记物，该标记物为CREB基因的甲基化产物。本发明上述的用于ccRCC转移早期诊断的生物标记物，具体通过提取ccRCC病人手术后口服sunitinib药物血清中DNA，经亚硫酸盐修饰后进行甲基化特异性PCR；将得到的CREB基因甲基化；结果和病人在治疗过程中的复发转移情况相结合，进而预测CREB基因甲基化与ccRCC复发转移和生存之间的关系。具有能够发现临床上早期肾癌患者的微转移，进而调整治疗策略和正确评估预后的优点。

Description

预测肾透明细胞癌复发转移的分子标记物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学检测技术领域，具体涉及分子标记在对局限性肾透明细胞癌复发转移早期预测技术领域，即一种预测肾透明细胞癌复发转移的分子标记物及其应用。

背景技术

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)起源于肾实质泌尿小管上皮，是最常见、最致命的肾脏恶性肿瘤，发病率占全部肾脏肿瘤的90％。RCC是一种异质性疾病，包含一系列有明显遗传和/或表观遗传差异和临床特征差异的恶性肿瘤，主要包括肾透明细胞癌(clear cell RCC，ccRCC)、乳头状细胞癌和嫌色细胞细胞癌。ccRCC的发病率占肾细胞癌的90％。

目前手术切除术仍然是治疗ccRCC的最主要手段，但是治疗效果不佳。同时，因为不同肾细胞癌亚型有明显遗传学和表观遗传学等差异，致使不同RCC亚型患者的预后差异较大。ccRCC具有极高的转移率，研究发现30％的患者在诊断时已经发生转移，另有30-50％的患者发生术后转移或复发。因此，寻找新的被广泛认可的特异性标志物对ccRCC的转移做早期预测，将对提高病人的生存意义重大。

肿瘤的发生和发展伴随着整个基因组基因表达的失调，其中DNA甲基化与肿瘤发生关系最为密切。一般认为，基因的甲基化程度与基因表达成反平行关系。研究表明，原癌基因c-myc、EGF和AFP在胚胎发育过程中的表达受甲基化的调节，即随着这些基因甲基化程度降低，它们的表达逐渐升高。但在出生后，这些基因被重新甲基化，在特定的组织中表达受到限制。Ohtsuki等在对人骨髓瘤细胞的c-myc进行了CCGG序列的甲基化状况和基因表达的研究，在排除了因其他基因结构异常而致该有表达的情况下，发现c-myc第三外显子CCGG序列与正常人扁桃体B淋巴细胞相比显著低甲基化，二者这种低甲基化与c-myc在骨髓瘤细胞中高表达有关。Sharrard等用c-myc基因亚片段作为探针，分别对该基因各段的CCGG位点甲基化程度进行了检测，发现c-myc 5’端和第一、二外显子的甲基化水平在正常结肠粘膜、腺瘤和腺癌都一致，而第三外显子在腺瘤和腺癌中明显低甲基化。深入研究发现，第三外显子的低甲基化可能影响c-myc蛋白的结合并改变基因的表达。由此可见，在肿瘤组织中，癌基因的高表达伴随其低甲基化。Maria等从人膀胱癌中分理出具有转化活性的c-Ha-ras基因，用原核生物甲基化酶分别将该基因CCGG和CGCG位点完全甲基化后，在转染细胞发现其转化率下降80％。若再用5-杂氮胞苷处理已经转染、但未转化的细胞，c-Ha-ras基因又重新获得转化能力。因此，他们认为这种能力的获得是由于癌基因的一些重要甲基化位点的去甲基化原因。

此外，癌基因的低甲基化参与肿瘤的发生发展。致癌物使基因组DNA接受甲基化的能力大大下降，是因为致癌物与CG序列中的鸟嘌呤形成聚合物阻止甲基化酶靠近胞嘧啶，最终导致DNA低甲基化。用药物诱导大鼠肝癌发生的过程中，发现肝癌细胞发生病变前就已出现正常细胞基因组的c-myc、c-Ha-ras、c-fos等癌基因低甲基化；低甲基化程度随着肿瘤的进展而加强。此外，在结肠癌、前列腺癌等癌症，甚至慢性肝炎和肝硬化病人的癌前阶段上述基因也出现了低甲基化。在研究膀胱癌c-myc癌基因3’端甲基化变化时发现，尽管而大多数肿瘤c-myc基因为低甲基化，但这种低甲基化程度在不同的分期和分级中存在明显的差异，c-myc甲基化程度更低的肿瘤表现为更低的恶性侵袭能力。结肠良性增生、结肠腺瘤、腺癌以及转移癌组织中c-myc基因第三外显子序列的甲基化程度逐渐降低，其下降比例分别为24.8，50.5，,6.1和83.1％。反之，给实验室肝癌大鼠喂养能提高甲基化程度的食物可以有效阻断或预防肝癌的发生。新近报道，吞噬和细胞运动(engulfment and cellmotility)家族中ELMO3基因在转移性肺癌组织的原发灶中的表达显著性高于正常的肺组织和无转移的肺组织；在分析同一病人的组织发现，该基因启动子区域的甲基化水平和表达成负相关。因此他们认为，ELMO3具有肿瘤细胞特有的高表达和低甲基化现象，和肺癌转移密切相关。

文献报道，肾癌的发生与吸烟、高血压和肥胖等呈正比，而与饮食中高比例的蔬菜和水果成反比；此外，红肉和牛奶的比例增加也增加了肾癌发生的风险。环境因素可以通过表观遗传学机制影响人体基因的表达和肿瘤的发生。由于DNA甲基化是细胞癌变过程中的一个早期和频发事件，其可以作为肿瘤发生的敏感生物标记物。因此，检测外周血血清、血浆、肿瘤累及器官相关的体液(如唾液、痰和尿液等)中相应基因的异常甲基化指标，将是一种非常有前途的生物标记物，并将给肿瘤分子检测带来极大的便利。

虽然外周血基因组DNA的低甲基化研究在头颈部肿瘤、胃癌、肝癌、膀胱癌、大肠癌和乳腺癌等多有报道，然而在肾癌中报道相对较少。Cho等利用高通量DNA甲基化分析技术对46对肾癌和配对的癌旁组织进行分析，结果发现，在807个候选基因中IL-8基因的去甲基化位居第一；然而，该基因的去甲基化和肾癌的恶性程度，病人的生存情况之间无显著性差异。然而，Yoo等在比较肾癌组织和癌旁组织的甲基化基因时发现了10个左右的基因低甲基化，但是只有CCR5基因的蛋白表达有显著性差异；并且，CCR5的这种高表达、低甲基化状态与肾癌的恶性程度密切相关。因此他们认为，检测病人体内的CCR5基因甲基化状态具有非常重要的临床意义。Cho等在分析13例肾癌及其配对组织时发现，MN/CA9基因有6个CpG位点；然而，9例(69％)肾癌组织的-74bp CpG位点部分去甲基化，此外的4例显著该位点完全甲基化。在分析该基因的甲基化和表达的关系时发现，MN/CA9基因的-74bp CpG位点低甲基化与基因表达完全正相关；荧光素酶实验显示，MN/CA9基因启动子的活性被-74bp CpG位点的甲基化状态所抑制。由此可见，MN/CA9基因启动子区域的-74bp CpG位点低甲基化在促进肾癌组织中该基因的活化过程中扮演重要的角色。肾癌相关抗原G250在80％多的原发性和转移性肾癌中都高表达。由于G250的mRNA水平和蛋白表达密切相关，提示该基因的表达发生在转录水平。虽然在G250的启动子区域不含有CpG岛，但是在细胞系中的结果仍然提示，该基因的表达受CpG二核苷酸的甲基化状态调节。为了揭示这一异常现象，Grabmeier等研究了肾癌及其配对组织的G250低甲基化状态。结果发现，在肾癌细胞系中，G250的表达和低甲基化呈正相关。然而和正常的肾癌组织相比，原癌性肾癌中没有发现低甲基化现象。在肾癌和正常肾组织中，CpG二核苷酸全部被甲基化。此外，原代培养肾癌组织显示，随着传递次数的增加，G250的低甲基化状态也随之升高。这一结果提示，该基因在体内的表达不是通过甲基化途径，而是存在其他的调控机制。由此可见，肾癌发生发展过程中癌基因的低甲基化研究近乎空白。

随着现代影像学技术的应用，早期肾癌在入院诊治的RCC患者中的比例越来越高，根治术或部分肾切除术是这类患者的最主要治疗方法。然而，数据统计发现，部分临床分期较低的RCC患者发生复发和转移的几率达65％；究其原因在于传统的病理分期和Fuhrman核分级方法缺乏足够的特异性和敏感性。随着近年来微转移相关的临床证据逐渐积累，如何发现临床上早期肾癌患者的微转移，进而调整治疗策略和正确评估预后，已成为当前的研究热点。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种能够发现临床上早期肾癌患者的微转移，进而调整治疗策略和正确评估预后的用于ccRCC转移早期诊断的生物标记物。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种能够用于ccRCC转移早期诊断的生物标记物，该标记物为CREB基因的甲基化产物。

本发明上述的用于ccRCC转移早期诊断的生物标记物，具体通过提取ccRCC病人手术后口服sunitinib药物血清中DNA，经亚硫酸盐修饰后进行甲基化特异性PCR；将得到的CREB基因(环磷腺苷效应元件结合蛋白基因)甲基化；结果和病人在治疗过程中的复发转移情况相结合，进而预测CREB基因甲基化与ccRCC复发转移和生存之间的关系。

本发明还提供血清基因组DNA提取、测定DNA浓度、亚硫酸盐修饰、甲基化特异性PCR、电泳和测序具体的操作过程，操作步骤包括：

(1)病人纳入标准：行肾根治性或部分切除术，术后病理证实为T1a-T2b的ccRCC患者；排除患有急慢性泌尿系统感染性疾病、结石和其他免疫缺陷的患者；

(2)病人新鲜血抗凝，用红细胞裂解液除去红细胞，破碎白细胞，除去杂蛋白，得基因组DNA，Nano drop测定DNA浓度；

(3)重亚硫酸盐修饰基因组DNA；

(4)将步骤(3)中修饰后基因组DNA进行甲基化特异性PCR扩增、电泳和甲基化测序；

(5)在甲基化和非甲基化引物的参与下，进行PCR反应；如果甲基化产物阳性，非甲基化产物阴性，则说明此标本中只有甲基化DNA存在；如果甲基化产物阴性，非甲基化产物阳性，则说明此标本DNA中只有非甲基化存在；如果甲基化和非甲基化均阳性，则说明此标本DNA不完全甲基化。

(6)根据步骤(5)的标准，结合病人有无复发和转移发生，个体化预测病人的预后。

本发明上述步骤(2)所述的得基因组DNA所用的每例受试者的血清为10μl。

本发明还提供一种CREB基因甲基化在用于局限性ccRCC病人复发转移风险评估试剂盒中的应用。

本发明的优点和有益效果：

1.本发明中每次实验所用样本血清体积少(10μl)，操作简单易行、低廉。本发明的检测方法可以实现在相同的检测条件下，其他基因的甲基化情况检测，且可以推广至其他肿瘤疾病的病情进展检测。

2.本发明利用甲基化特异性PCR，检测ccRCC确诊患者口服sunitinib治疗过程中血清中CREB基因的(环磷腺苷效应元件结合蛋白基因)甲基化水平；结合患者随访过程中复查CT和体格检查，确定该基因的甲基化水平与ccRCC转移之间的关系。

3.本发明所提供的以血清中与疾病相关的CREB甲基化作为确定或者辅助检测疾病进展的模型具有个体化特征，并且能够在临床影像学确定疾病发生发展之前预测疾病进展。其消除了现有技术的缺点，即发现了一组可快速实施的、非侵入性的个体化标志物，比传统方法更具有灵敏性的检测肾癌进展。

附图说明

图1是生物信息学软件预测出CREB启动子区域的甲基化位点。

图2是琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统分析检测肾癌组织中CREB基因高甲基化。

图3是肾癌组织中CREB基因甲基化测序图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好的理解本发明，但不限定本发明。若无特殊说明，均按常规方法操作。

实施例1

步骤一、纳入受试者

共纳入40例，其中男21例(53％)，女19例(47％)，年龄38-79岁，中位年龄63岁。

随访病人的无病生存时间8-72个月。

步骤二、采集受试者DNA样本

采集每例受试者血样标本10μl，用酚/氯仿抽取基因组DNA。

步骤三、甲基化特异性PCR

实验试剂盒中的PCR反应组件；其中，含有下列针对CREB基因的甲基化(M)和非甲基化(U)引物对(上游和下游)，具体见下表1：

表1 CREB基因的甲基化(M)和非甲基化(U)引物对

即所述的甲基化引物为：上游5’-CGGCGGTTAAGAGAGTAGGTTA-3’，下游5’-GCGTCACTCACCAACACT-3’(具体氨基酸序列见序列表1和2)；

所述的非甲基化引物为：上游5’-TGGTGGTTAAGAGTGAGTTA-3’，下游5’-TCACTCACCAACACTCCAC-3’(具体氨基酸序列见序列表3和4)。

每个反应体系总体积是20μl，具体的反应体系构成如下表2所示：

表2 反应体系构成

PCR仪上进行MSP变性、退火和延伸反应。4℃保存。反应条件如下表3所示：

表3 MSP变性、退火和延伸反应条件

步骤	温度	时间
			预变性	95℃	10min
变性	95℃	30s
			退火	55℃	45s
延伸	72℃	1min
			末端延伸	72℃	10min

步骤四、PCR产物纯化

在PCR反应结束后，实验本试剂盒中的PCR纯化组件对产物进行纯化。每个PCR产物纯化反应体系为7μl。包括步骤三中终产物5μl，SAP 0.3μl，缓冲液0.2μl，去离子水1.5μl。反应条件为37℃40min，85℃5min和4℃保持。

步骤五、甲基化测序

从ccRCC标本的甲基化特异性PCR扩增产物中随机抽取3份，再取10μl上游引物，进行DNA甲基化测序。

结果发现，生物信息学软件先预测出在CREB基因的启动子区域有甲基化位点(图1)。在甲基化引物和非甲基化引物的参与下，局限性ccRCC病人标本中，CREB基因启动子的甲基化率在肿瘤组织和正常组织中分别为82.5(33/40)和25％(9/40)，二者之间有统计学意义(p＜005)(图2)。经亚硫酸盐修饰处理的ccRCC组织中CREB的甲基化特异性PCR扩增产物胞嘧啶保持不变，未转换成胸腺嘧啶，说明癌组织中CREB基因启动子区域高度甲基化(图3)。

实施例2 CREB基因甲基化用于局限性ccRCC病人复发转移风险评估试剂盒的使用

1. 40例ccRCC患者来自2009年11-2012年8月经手术治疗的ccRCC患者，均为初诊患者且未经放化疗，肿瘤的病理分期按2010AJCC版TNM分期进行分类(具体见表4)。实验组和对照组的临床特征均衡性良好(具体见表5)。

表4临床病人资料

2、将40例ccRCC随访患者和对照组的血清样本按照实施例1中的方法进行DNA提取和CREB甲基化检测，每个样本分别取10μl血清。

3、收集RCC患者的临床特征数据，包括性别、年龄、分期和转移等特征，将CREB基因的甲基化水平和各期临床特征进行统计分析，确定其是否具有相关性。结果如表5所示，在RCC组织中，CREB基因启动子甲基化率为85％和55％，有统计学意义。

表5 RCC患者和对照组中CREB基因甲基化水平

4、将RCC发生淋巴结转移和未转移的病人的CREB基因甲基化进行统计分析，结果如表6所示，CREB在转移性病人中的甲基化率为100％，而在未发生转移病人中的甲基化率仅为65％；二者之间有显著性差异。

表6淋巴转移和未转移病人中CREB基因甲基化水平

5、进一步分析RCC患者的临床特征数据，包括性别、年龄、分期和肿块大小等特征等之间的关系。结果发现，CREB的甲基化与上述特征之间没有显著性关联(表7)。

表7 CREB基因甲基化与RCC病人临床特征之间的关系

上述结果显示，CREB的甲基化阳性与病人的复发和转移密切相关，而与其他临床病理参数，如年龄、性别、病理分型和肿块大小等级别均无关(p>0.05)。这一结果也表明与疾病相关的基因甲基化是一种预警肿瘤患者疾病进展的有效方法，这对随访肿瘤患者的用药方案制订具有重要的临床指导意义。因此，利用本发明来检测血清中CREB的甲基化水平，可以预测肾癌术后的复发和转移发生。

综上所述，本发明所提供的以血清中与疾病相关的CREB甲基化作为确定或者辅助检测疾病进展的模型具有个体化特征，并且能够在临床影像学确定疾病发生发展之前预测疾病进展。其消除了现有技术的缺点，即发现了一组可快速实施的、非侵入性的个体化标志物，比传统方法更具有灵敏性的检测肾癌进展。

虽然本发明以较优的实施例公开如上，但并非用于限定本发明的实施范围。任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的范围内，可做少许改动，即凡是依照本发明所做的同等改进，均为本发明的范围所覆盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁波大学

<120> 预测肾透明细胞癌复发转移的分子标记物及其应用

<130> 2019

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cggcggttaa gagagtaggt ta 22

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgtcactca ccaacact 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggtggttaa gagtgagtta 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcactcacca acactccac 19

Claims

1.一种检测CREB基因甲基化的引物在制备用于局限性肾透明细胞癌病人复发转移风险评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测CREB基因甲基化的引物中，甲基化引物为：上游5’-CGGCGGTTAAGAGAGTAGGTTA-3’，下游5’-GCGTCACTCACCAACACT -3’;非甲基化引物为：上游 5’- T G G T G G T T A A G A G T G A G T T A - 3’，下游 5’-TCACTCACCAACACTCCAC -3’。