TW202102689A

TW202102689A - 多基因聯合檢測試劑

Info

Publication number: TW202102689A
Application number: TW108143399A
Authority: TW
Inventors: 吳孝林; 劉相林; 羅茵; 鄒鴻志
Original assignee: 大陸商廣州市康立明生物科技有限責任公司
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2021-01-16
Also published as: WO2021004215A1; TWI741418B; CN110331142A; CN110331142B

Abstract

本申請屬於生物醫藥領域，特別涉及甲基化檢測試劑、試劑盒及其用途。本申請透過檢測SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合的甲基化水平，可以很好的從糞便標本中區分出結直腸癌標本。本申請利用含有該基因組合的甲基化試劑甲基化檢測試劑來檢測結直腸癌，檢測敏感性和特異性高達到90%以上。

Description

多基因聯合檢測試劑

本申請屬於生物醫藥領域，特別涉及引子、捕獲試劑、核酸探針、甲基化檢測試劑、試劑盒及其用途。

結直腸癌，又稱為大腸癌，是一種常見的消化道惡性腫瘤。其發病率在我國逐年升高，在我國部分沿海地區比如上海和廣州，大腸癌發病率已躍居第二位，僅次於肺癌。目前認為腸癌的形成是遺傳缺陷和表觀遺傳缺陷累積的結果。結直腸癌早期發病隱匿，常無明顯症狀，晚期可出現便血、腹痛、腹瀉等症狀。而當出現症狀就診時常常是晚期，這給病人帶來極大的痛苦和昂貴的治療費用。因此早發現、早診斷、早治療是降低結直腸癌發病率和死亡率的一項重要措施。

篩查可以早期發現腸癌和癌前病變，並去除病灶，從而阻止腸癌的發生。目前大腸癌的篩查方法主要有隱血試驗和腸鏡檢查。隱血試驗存在易受食物影響或對腺瘤檢出率不高的問題。腸鏡雖是腸癌診斷金標準，但作為篩查手段使用時人群依從性不高。因此急需一種準確性高、依從性高的腸癌篩查方法。

糞便基因檢測作為一種新的腸癌篩查方法，現在越來越受到重視。該方法（Cologuard^® ）於2016年納入美國的腸癌篩查指南。該方法具有方便、無創、對腸癌和癌前病變腺瘤的檢出率高等特點。要做成對腸癌檢測高性能的糞便基因檢測試劑盒，主要需要克服兩大障礙：糞便DNA的提取和標記選擇。一方面，糞便中成分複雜，對下游反應的抑制物多，還有許多細菌DNA，要從這樣的混合物中提取出人的目標基因，需要一套高敏的基因提取和純化方法；另一方面，目前和腸癌相關的標記很多，尤其是DNA甲基化標記，因為研究表明，DNA甲基化是腫瘤形成的早期事件。但很多甲基化標記在細胞、組織層面表現很好，當用於糞便、血液等篩查媒介時，其對腸癌的敏感性和特異性就降下來了，比如vimentin基因，其在組織中的敏感性有83%，在糞便標本中就降到了46% ( J. Natl. Cancer Inst. 2005 Aug 3; 97(15):1124-32.) 。

另外，由於大腸癌的發病機理比較複雜，是多基因遺傳疾病。現有對大腸癌單個甲基化標記檢測的方法存在以下兩點侷限性：第一，現有研究以及產品的檢測方法均是在一個PCR反應孔中檢測一個標記，檢測方法上未能夠實現在一個PCR反應孔中對甲基化標記的多重檢測。第二、現有對大腸癌檢測的甲基化標記如SDC2、ITAG4、Septin 9等透過檢測單基因的甲基化水平來檢測大腸癌時，檢測的敏感性受遺傳學因素的限制。甲基化SDC2基因的檢測敏感性為84.2%，特異性為97.9%；甲基化ITGA4的檢測敏感性為83.8%特異性為95.2%；甲基化Septin9的檢測敏感性為79.3%特異性為94.3%。這些單個標記對大腸癌的檢測的特異性均能夠達到90%以上，但是在特異性達到90%以上時的敏感性均未能夠達到90%以上。

雖然大腸癌單個甲基化標記能夠檢測出部分的大腸癌，但透過分子生物學的方法盡可能多的檢測出大腸癌患者則需要將大腸癌相關的標記進行組合，但所需要面臨的問題是：1、大多數大腸癌基因甲基化標記對大腸癌的檢測價值上呈現性能重疊的現象，即同一個大腸癌患者樣本的檢出情況在大多數甲基化標記中是一致的。因此篩選出在大腸癌檢測能力上能夠互相補充的基因甲基化標記難度非常大，需要大量的研究工作。另外，基因甲基化標記越多，則檢測體系的假陽性現象也會疊加，檢測的特異性會降低。因此，在一定的檢測特異性的前提下提高大腸癌檢測敏感性的難度非常大。2、需要平衡檢測成本、靈敏度以及特異性。

中國專利申請CN109207592A分析了多個標記檢測結直腸癌的模型，其中SEPT9、NDRG4、SDC2聯合檢測的敏感性僅為88.6%，特異性僅為89.1%；KRAS、BMP3、NDRG4、SEPT9、SDC2的多種不同組合檢測模型中，其ROC曲線的AUC值最高僅為0.912，且獲得此0.912的AUC需要同時聯合檢測5個基因標記。

因此，挑選在糞便中對腸癌有極高檢測敏感性和特異性的標記組合是腸癌糞便基因檢測的關鍵，並且這樣的標記組合有望真正用於腸癌的臨床檢測，且良好的引子、捕獲序列和探針的設計也是影響標記組合發揮作用的影響因素之一。

本申請的目的在於一種引子，及其在製備檢測結直腸腫瘤的試劑或試劑盒中的用途。

本申請的另一個目的在於提供一種捕獲序列，及其在製備檢測結直腸腫瘤的試劑或試劑盒中的用途。

本申請的另一個目的在於提供一種探針，及其在製備檢測結直腸腫瘤的試劑或試劑盒中的用途。

本申請的另一個目的還在於提供一種多基因甲基化聯合檢測試劑，所述基因為SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4。

本申請的另一個目的還在於提供一種特異性強、敏感度高的結直腸腫瘤檢測試劑和試劑盒。

本申請的上述目的透過以下技術手段實現：

本申請提供了一種引子，所述引子包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25所示序列或其互補序列中的至少任意一條。

作為本申請優選的實施方式，所述引子包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25所示的任意一條。

作為本申請優選的實施方式，所述引子包含SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19以及SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 25所示的至少一對引子對。

作為本申請優選的實施方式，所述引子包含SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8以及SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示的引子對。

作為本申請優選的實施方式，所述引子包含SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19以及SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 25所示的引子對。

另一方面，本申請還提供了一種捕獲序列，所述捕獲試劑包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 10所示序列或其互補序列中的至少任意一條。

作為本申請優選的實施方式，所述捕獲序列包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 10所示的至少一條。

作為本申請優選的實施方式，所述捕獲序列包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10所示的序列。

作為本申請優選的實施方式，所述捕獲序列包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10所示的序列。

另一方面，本申請還提供了一種核酸探針，所述核酸探針包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 13所示序列或其互補序列中的至少任意一條。

作為本申請優選的實施方式，所述核酸探針包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 13所示的至少一條。

作為本申請優選的實施方式，所述核酸探針包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 13所示的序列。

另一方面，本申請還提供了上述引子或捕獲序列或探針在製備檢測結直腸腫瘤的試劑或試劑盒中的用途。

另一方面，本申請還提供了上述引子或捕獲序列或探針或試劑或試劑盒在檢測結直腸腫瘤中的用途。

另一方面，本申請還提供了SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合的甲基化聯合檢測試劑，包括針對SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合中每個基因的獲得的捕獲序列、引子和／或探針。

在本申請的一些具體的實施方案中，包括針對SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合中每個基因的CpG島獲得的捕獲序列、引子和／或探針。

在本申請的一些具體的實施方案中，本申請提供的甲基化檢測試劑透過檢測SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合中的每個基因的基因體、基因間區或啟動子區及啟動子區附近區域的甲基化水平。

在本申請的一些具體實施方案中，本申請提供的甲基化檢測試劑包括針對SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合中的每個基因的啟動子區或所述啟動子區附近區域的CpG島獲得的捕獲序列、引子和／或探針。

在一些實施方案中，SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4可分別被檢測甲基化水平。在另一些實施方案中，SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4可同時被檢測甲基化水平，如採用多重實時螢光定量PCR檢測多個基因的甲基化水平。在某些方面，SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4採用多重PCR同時被檢測更具方便性。

本申請中的「COL4A1/COL4A2」指「COL4A1或COL4A2」。人類基因COL4A1和COL4A2在13號染色體長臂的遠端緊密相連，這兩個基因是「頭對頭」的位置關係，並且是相反的轉錄方向。COL4A1和COL4A2基因的5’端靠近，之間間隔127bp，這段序列是這兩個基因共用的雙向啟動子區[1]。因此，根據兩者共用的雙向啟動子設計的序列，既可以針對COL4A1，也可以針對COL4A2。在本申請中，無論以COL4A1還是COL4A2標注序列信息，兩者並無區別。

本申請中的「檢測」同「診斷」，除了結直腸腫瘤的早期診斷，還包括結直腸腫瘤中期和晚期的診斷，且也包括結直腸腫瘤篩選、風險評估、預後、疾病識別、病症階段的診斷和治療性靶標的選擇。

結直腸腫瘤標記組合SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4的應用使得結直腸腫瘤的早期診斷成為可能。當確定在癌症細胞中甲基化的基因在臨床上或形態學上正常表像的細胞中甲基化時，這就表明該正常表像的細胞向癌症發展。這樣，結直腸癌可在早期透過在正常表像的細胞中的結直腸腫瘤特異性SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合的甲基化而診斷。

其中，早期診斷指的是在轉移之前發現癌症的可能性，優選在可觀察到組織或者細胞的形態學變化之前。

除了結直腸腫瘤的早期診斷，本申請的試劑／試劑盒還有希望用於結直腸腫瘤篩選、風險評估、預後診斷、疾病識別、病症階段的診斷和治療性靶標的選擇。

作為病症階段可選的實施方式，可透過在結直腸腫瘤在不同階段或時期的進展可透過從樣品中獲取的SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合的甲基化程度的測量進行診斷。透過比較從結直腸癌的每個階段的樣品中分離出的核酸的SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合甲基化程度與從沒有細胞增殖性異常的腸組織中的樣品中分離出的一個或多個核酸的SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合甲基化程度，可檢測樣品中結直腸腫瘤的具體階段。

通常來說，CpG島是指富含CpG二核苷酸的一些區域，通常位於啟動子及其附近的區域，本申請中的甲基化的檢測位點不僅包括CpG島，也包括其他區域如基因體或者基因間區的雜合甲基化的CpG位點，或者是孤立的CpG位點。

所述SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合的甲基化聯合檢測試劑可以是現有技術中的甲基化檢測試劑。現有技術中，已經有多種方法可以檢測目的基因的甲基化，如甲基化特異性PCR（MSP）、甲基化特異性定量PCR（qMSP）、甲基化DNA特異性結合蛋白的PCR，定量PCR以及DNA芯片、甲基化敏感的限制性內切酶、重亞硫酸鹽測序法或者焦磷酸測序等等，除此之外，其他的甲基化檢測方法可以透過專利US62007687引入。每種檢測方法均有其相對應的試劑，這些試劑均可以用於本申請檢測SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合的甲基化。

在本申請的一些具體的實施方案中，引子和／或探針透過quantitative Methylation-Specific PCR (qMSP)檢測SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合中的每個基因的甲基化。

在本申請的一些具體實施方案中，本申請提供的甲基化聯合檢測試劑中所述SDC2基因捕獲序列包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： I、SEQ ID NO:1或2任一所示的核苷酸序列； II、如Ⅰ所示序列的互補序列；

所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化檢測的捕獲序列包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： III、SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列； IV、如III所示序列的互補序列；

所述ITGA4基因的甲基化檢測的捕獲序列包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： V、SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列； VI、如V所示序列的互補序列。

在本申請的一些具體實施方案中，本申請提供的所述SDC2基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： VII、SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列； VIII、如VII所示序列的互補序列；

所述SDC2基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： IX、SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列； X、如IX所示序列的互補序列；

所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XI、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18任一所示的核苷酸序列； XII、如XI所示序列的互補序列；

所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XIII、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:19任一所示的核苷酸序列； XIV、如XIII所示序列的互補序列；

在本申請的一些具體實施方案中，所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；

在本申請的一些具體實施方案中，所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示；

所述ITGA4基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XV、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:24任一所示的核苷酸序列； XVI、如XV所示序列的互補序列；

所述ITGA4基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XVII、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:25任一所示的核苷酸序列； XVIII、如XVII所示序列的互補序列；

在本申請的一些具體實施方案中，所述ITGA4基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；

在本申請的一些具體實施方案中，所述ITGA4基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示；

在本申請的一些具體實施方案中，本申請提供的甲基化檢測試劑中所述SDC2基因的甲基化檢測的探針包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XIX、SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列； XX、如XIX所示序列的互補序列；

所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化檢測的探針包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XXI、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列； XXII、如XXI所示序列的互補序列；

所述ITGA4基因的甲基化檢測的探針包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XXIII、SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列； XXIV、如XXIII所示序列的互補序列。

在一些實施方式中，所述核酸探針上還包含標記如放射性同位素、螢光基團、生物發光化合物、化學發光化合物、金屬螯合物和酶中的一種或多種。

在一些實施方式，探針的標記是螢光基團，這些螢光基團包含但不限於 VIC、ROX、FAM、Cy5、HEX、TET、JOE、NED和Texas Red等中的一種或多種。

在一些實施方式中，所述SDC2、COL4A1/COL4A2以及ITGA4基因的探針採用同一個螢光基團標記，從而可以透過一個螢光通道便捷地檢測出這幾個基因的甲基化水平總和，而不需要每個基因用不同的螢光通道檢測，降低了試驗的複雜程度。

本申請還提供了一種檢測腫瘤的試劑盒，包括所述甲基化檢測試劑。

在本申請的一些具體實施方案中，本申請提供的試劑盒包括：第一容器，其包含捕獲試劑；第二容器，其包含用於擴增的引子對；第三容器，其包含探針。

在本申請的一些具體實施方案中，本申請提供的試劑盒還包括試劑盒中的常用試劑，如qMSP中常用轉化劑，用於將非甲基化的胞嘧啶堿基都轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶堿基保持不變。所述轉化劑無特別限制，現有技術中報道的可實現胞嘧啶到尿嘧啶轉化的試劑均可以，如肼鹽、重亞硫酸氫鹽和亞硫酸氫鹽（例如偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鉀、亞硫酸氫銫、亞硫酸氫銨等）中的一種或幾種。又如擴增COL4A1基因中常用的DNA 聚合酶、dNTPs、Mg²⁺離子和緩衝液等等。

在一些具體的實施方式中，所述試劑盒包括：第一容器，其包含捕獲試劑；第二容器，其包含用於擴增的引子對；第三容器，其包含探針。第四容器，其包含轉化未甲基化的胞嘧啶的轉化試劑。

在一些具體的實施方式中，所述試劑盒還包含說明書。

在一些具體的實施方式中，所述試劑盒還包含核酸提取試劑。

在一些具體的實施方式中，所述試劑盒還包含取樣裝置。

本申請還提供了上述的甲基化檢測試劑、試劑盒、捕獲序列、引子和／或探針在製備甲基化檢測的試劑或試劑盒，或者製備檢測結直腸腫瘤的試劑或試劑盒中的用途。

本申請還提供了上述的甲基化檢測試劑、試劑盒、捕獲序列、引子和／或探針在甲基化檢測中的用途，或者在檢測結直腸腫瘤中的用途。

本申請還提供了一種腫瘤的檢測系統，所述系統包含有以下構件：（1）SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因的甲基化聯合檢測構件：（2）數據處理構件；（3）結果輸出構件；

在本申請的一些具體實施方案中，所述甲基化檢測構件含有甲基化檢測儀器；

在本申請的一些具體實施方案中，所述甲基化檢測構件還含有所述甲基化檢測試劑、試劑盒、捕獲序列、引子以及探針中一種或多種。

在本申請的一些具體實施方案中，所述甲基化檢測儀器包含螢光定量PCR儀、PCR儀、測序儀中的一種或多種。

在本申請的一些具體實施方案中，所述數據處理構件含有數據處理機器。

所述數據處理機器包括本領域技術人員可使用的任何可以進行數據處理的設備或儀器或裝置。

在本申請的一些具體實施方案中，所述數據處理機器包含計算器、電腦中的一種或多種。

所述電腦中附載有本領域技術人員可使用的任何可以進行數據處理或統計分析的軟體或程式。

在本申請的一些具體實施方案中，所述電腦包含附載有SPSS、SAS、Excel中一種或多種軟體的電腦。

在本申請的一些具體實施方案中，所述結果輸出構件含有結果輸出器。

所述輸出器包含任何可以將數據處理結果顯示為可閱讀的內容的設備或儀器或裝置。

在本申請的一些具體實施方案中，所述結果輸出器包含屏幕、紙質報告中的一種或多種。

在本申請的一些具體實施方案中，所述數據處理器被配置於a. 接收待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；b.儲存待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；c.比對同種類型的待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；d.根據比對結果，響應於受試者罹患腫瘤的概率或者可能性。

在本申請的一些具體實施方案中，所述結果輸出構件用於輸出受試者罹患腫瘤的概率或者可能性。

本申請還提供了一種結直腸腫瘤的診斷方法，所述方法包括以下步驟：（1）檢測來源於受試者的待測樣本SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因的甲基化水平；（2）將待測樣本與正常對照樣本的SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因甲基化水平比較；（3）基於待測樣本與正常對照樣本的甲基化水平的偏離，診斷結直腸腫瘤。

本申請的診斷方法可以在結直腸腫瘤治療前後使用或者與肺癌治療聯合使用，治療後使用如評價治療的成功或者監測治療後結直腸腫瘤的緩解、復發和／或進展(包括轉移)。

本申請另一方面提供了一種結直腸腫瘤的治療方法，所述方法包括對經上述診斷方法診斷為肺癌的患者，施用手術、化療、放療、放化療、免疫療法、溶瘤病毒療法、或其他本領域所用的任何其他類型結直腸腫瘤治療方法以及這些治療方法的組合。

本申請的一些具體實施方案中，所述腫瘤的檢測系統中的數據處理構件，或者所述結直腸腫瘤診斷方法的判斷標準為：根據甲基化特異性定量PCR（qMSP）的Ct值的界值判斷腫瘤標本和正常標本。

在本申請的一些具體實施方案中， Ct值的界值為36-39。

在本申請的一些具體實施方案中，Ct值的界值為38。

在本申請的一些具體實施方案中，上述的Ct值的界值為36-39或者38所針對的樣本為糞便樣本。

在本申請的一些具體實施方案中，當所述待測樣本的Ct值小於所述Ct值的界值則判斷為腫瘤樣本，當所述待測樣本的Ct值大於等於所述Ct值的界值則判斷為正常樣本。

在本申請的一些具體實施方案中，本申請所述腫瘤為結直腸腫瘤。

在本申請的一些具體實施方案中，本申請所述腫瘤為結直腸癌或腺瘤。

在本申請的一些具體實施方案中，本申請針對的待測樣本或者樣本類型包含組織、體液或排泄物。

在本申請的一些具體實施方案中，本申請所述組織包含腸組織。

在本申請的一些具體實施方案中，本申請所述體液包含血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、淋巴液、腦脊液或房水。

在本申請的一些具體實施方案中，所述排泄物包含痰液、尿液、唾液或糞便。

在本申請的一些具體實施方案中，所述排泄物包含糞便。

本申請透過研究發現：在一些具體的實施方案中，透過所述引子、捕獲試劑、核酸探針檢測SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合中每個基因的啟動子區的甲基化水平，可以很好的從的糞便標本中區分出結直腸癌標本。並且對腸癌的檢測敏感性和特異性極高。

與現有的檢測腸癌的標記相比，本申請提供的引子、捕獲試劑、核酸探針以及SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合和技術方案能夠以極高的敏感性和特異度來檢測結直腸癌，本申請的技術方案對結直腸癌的檢測敏感性和特異性都高於90%。具體有以下幾點：

1、本申請的一個技術方案對SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合的甲基化進行聯合檢測，該方法可以實現對多基因的聯合檢測，極大的降低了試驗的複雜程度，提高了檢測效率。

2、上述的另一個技術方案中，SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合的甲基化檢測試劑在糞便標本中能夠在特異性為95.28%時，檢測出91.36%的結直腸癌，可以簡便地糞便作為檢測樣本，對結直腸癌進行可靠的診斷。糞便樣品獲得非常容易，取樣無創簡單，而且不會對病人造成任何的痛苦和不便。

3、上述的另一個技術方案中含有SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因組合的甲基化檢測試劑，提取檢測方法能非常方便、準確地判斷出結直腸癌和正常人，該基因組合的甲基化檢測試劑有望用於糞便基因檢測試劑盒，並服務於腸癌的臨床檢測。

4、上述的另一個技術方案中的試劑／試劑盒是透過甲基化水平來檢測和診斷癌症，越來越多的研究證實甲基化改變是腫瘤發生過程中的早期事件，檢測甲基化異常更易發現早期病變。

以下透過具體的實施例進一步說明本申請的技術方案，具體實施例不代表對本申請保護範圍的限制。其他人根據本申請理念所做出的一些非本質的修改和調整仍屬於本申請的保護範圍。

本申請中的「捕獲序列」「引子」或「探針」是指一種寡核苷酸，其包含與靶核酸分子(例如靶基因)的至少6個連續核苷酸的序列互補的區域。在一些實施方案中，所述引子或探針至少一部分序列與擴增的序列不互補。在一些實施方案中，引子或探針包含與靶分子的至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20連續核苷酸的序列互補的區域。當引子或探針包含「與靶分子的至少x 個連續核苷酸互補」的區域時，所述引子或探針與靶分子的至少x 個連續或不連續的分塊核苷酸至少95％互補。在一些實施方案中，引子或探針與靶分子至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互補。

本申請中，「正常」樣本指分離自已知無所述癌症或腫瘤的個體的相同類型的樣本。

本申請中，所述「受試者」是哺乳動物，例如是人。

本申請甲基化檢測的樣本包括但不限於DNA，或RNA，或含mRNA的DNA和RNA樣品、或DNA-RNA雜交體。其中DNA或者 RNA可為單鏈或雙鏈。

本申請中，「甲基化水平」同「甲基化程度」，通常可以表示為甲基化胞嘧啶的百分比，其為甲基化的胞嘧啶數量除以甲基化胞嘧啶的數量與未甲基化胞嘧啶數量的總和；以及目前普遍採用甲基化靶向基因數量除以內參基因數量的方法來表示甲基化水平；以及其他現有技術中甲基化水平表示方法。

本申請中，「樣本」同「標本」。 實施例 1

按照表1設計SDC2三對引子進行研究擴增的特異性。 [表1] SDC2的引子

基因	引子名稱	序列信息
SDC2	S0	SEQ ID NO.3	FP	GAGGAAGCGAGCGTTTTC
SEQ ID NO.4	RP	AAAATACCGCAACGATTACGA
S1	SEQ ID NO.14	FP	GTAGGAGGAGGAAGCGAGCGTTTTC
SEQ ID NO.15	RP	CGCAACGATTACGACTCAAACTCGA
S2	SEQ ID NO.16	FP	CGGGGCGTAGTTGCGGGCGGC
SEQ ID NO.17	RP	CGCTCGACGCAACCCGCG

使用以上3對引子分別檢測2例結直腸癌患者糞便樣本DNA和2例正常人糞便樣本DNA，分析擴增的特異性。

3對引子擴增SDC2的擴增曲線如圖1-3所示。

結果顯示SDC2引子對S0的擴增特異性較好；而其它兩對引子其擴增曲線陰陽性樣本差異小，無法有效區分陰陽性樣本。 實施例 2

按照表2設計COL4A1/COL4A2三對引子進行研究擴增的特異性。 [表2] COL4A1/COL4A2的引子

基因	引物名稱	序列信息
COL4A1/ COL4A2	C0	SEQ ID NO.7	FP	AGAGAGTTTAGTAAGGTCGGGC
SEQ ID NO.8	RP	GACTTCAAAAACTACTACCCG
C1	SEQ ID NO.18	FP	AGAGAGTTTAGTAAGGTCGGAC
SEQ ID NO.19	RP	GACTTCAAAAACTACTACCCG
C2	SEQ ID NO.20	FP	AGAGAGTTTAGTAAGGTCGGGC
SEQ ID NO.21	RP	TTAGGGTTTGGGCGTCGTTCG

使用以上3對引子分別檢測3例結直腸癌患者糞便樣本DNA和3例正常人糞便樣本DNA，分析擴增的特異性。

3對引子擴增COL4A1/COL4A2的擴增曲線如圖4-6所示。

結果顯示COL4A1/COL4A2引子對C0和C1的擴增特異性較好；而引子對C2對COL4A1/COL4A2沒有擴增。 實施例 3

按照表3設計ITGA4三對引子進行研究擴增的特異性。 [表3] ITGA4的引子

基因	引物名稱	序列信息
ITGA4	I0	SEQ ID NO.11	FP	ACGCGAGTTTTGCGTAGAC
SEQ ID NO.12	RP	GCTAAATAAAATCCCGAACG
I1	SEQ ID NO.22	FP	ACGCGAGTCCTGCGCAGCC
SEQ ID NO.23	RP	GCTAAATAAAATCCCGAACG
I2	SEQ ID NO.24	FP	ACGCGAGTTTTGCGTAGTC
SEQ ID NO.25	RP	GCTAAATAAAATCCCGAACG

3對引子擴增ITGA4的擴增曲線如圖7-9所示。

結果顯示ITGA4引子對I0和I2的擴增特異性較好；而引子對I1其擴增曲線陰陽性樣本差異小，無法有效區分陰陽性樣本。 實施例 4

選取935例糞便標本（359例結直腸癌，67例腺瘤（≥1 cm），509例非腫瘤個體，均經腸鏡或病理確認），進行研磨離心，加入50 µL捕獲磁珠（含有SDC2，COL4A2，ITGA4以及內參基因ACTB的捕獲序列），並按如下所述技術方案操作，

技術方案如下：

1）收集有腸鏡病理結果的正常人和結直腸腫瘤病人的糞便標本，按1g糞便：4mL保護液混合研磨後5000 rpm離心10 min，取上清棄沉澱；

2）取出10 mL上清再次離心，取上清3.2 mL加入2 mL裂解液和50 µL捕獲磁珠M1，95℃孵育15 min，然後室溫放置30 min；

3）置於磁力架上棄部分上清後洗下磁珠轉移至2 mL離心管，加入800 µL洗液W1，室溫1300 rpm孵育1 min，置於磁力架上吸去上清，重複2次；

4）加入50 µL洗脫液，室溫 1300 rpm孵育5 min，置於磁力架上，3 min內轉移洗脫液至新的EP管中；

5）用EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research）對上一步驟中的DNA片段按照參考文獻[2]中的方法進行甲基化處理，最後的洗脫液20 µL用於qMSP檢測。

最後得到Bisulfite轉化後的DNA 20 µL。然後進行qMSP檢測，最後根據CT值判斷標本中SDC2、COL4A1/COL4A2和ITG4基因組合的甲基化水平。

本實施例qMSP反應體系：30 µL（無核酸酶水2.98 µL，5×Colorless GoTaq Flexi Buffer 6 µL，MgCl₂（25 mM）5 µL，dNTPs（10 mM）1 µL，GoTaq Hot Start polymerase 0.6 µL，ACTB-FP（100 µM）0.08 µL ，ACTB-RP（100 µM）0.08 µL，ACTB-Probe（100 µM）0.06 µL，SDC2-FP（100 µM）0.12 µL ，SDC2-RP（100 µM）0.12 µL，SDC2-Probe（100 µM）0.04 µL，COL4A2-FP（100 µM）0.06 µL ，COL4A2-RP（100 µM）0.06 µL，COL4A2-Probe（100 µM）0.04 µL，ITGA4-FP（100 µM）0.06 µL ，ITGA4-RP（100 µM）0.06 µL，ITGA4-Probe（100 µM）0.04 µL， DNA 10 µL）。反應程序：95 °C 5 min，（95 °C 15 s，58 °C 30 s，72 °C 30 s）×48 Cycles， 40 °C 30 s。

捕獲和PCR反應以ACTB作為內參基因，最後根據CT值判斷標本中甲基化水平，目標基因CT值≦38判斷為陽性，CT值>38判斷為陰性。

因為COL4A1和COL4A2基因5’端靠近，之間間隔127bp，為共用的雙向啟動子區。本實施例檢測的甲基化區域為COL4A1和COL4A2基因的雙向啟動子區。因此本實施例選擇該兩個基因中COL4A2的基因方向標注序列信息。

SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4這幾個基因發生甲基化的位點主要位於啟動子區或附近的CpG島上。

在本實施例中，採用同一種螢光基團標記SDC2，COL4A2和ITGA4的PCR探針，因此可以透過一個螢光通道便捷地檢測出這幾個基因的甲基化水平總和，而不需要每個基因用不同的螢光通道檢測，降低了試驗的複雜程度。

本實施例的捕獲序列、引子探針如下：

SDC2的捕獲序列1： SEQ ID NO.1：5’-AGCCCGCGCACACGAATCCGGAGCAGAGTACCG-3’或

SDC2的捕獲序列2： SEQ ID NO.2：5’-CTCCTGCCCAGCGCTCGGCGCAGCCCGC-3’

SDC2的qMSP引子探針： SEQ ID NO.3: SDC2-FP：5’-GAGGAAGCGAGCGTTTTC-3’ SEQ ID NO.4: SDC2-RP：5’-AAAATACCGCAACGATTACGA-3’ SEQ ID NO.5: SDC2-Probe：5’-AGTTTCGAGTTCGAGTTTTCGAGTTTG-3’

COL4A1/COL4A2的捕獲序列： SEQ ID NO.6：5’-GCTGCTGCCCGAACGCATTGGCCCTTCCAGAAGCA-3’

COL4A1/COL4A2的qMSP引子探針： SEQ ID NO.7: COL4A1/COL4A2-FP：5’-AGAGAGTTTAGTAAGGTCGGGC-3’ SEQ ID NO.8: COL4A1/COL4A2-RP：5’-GACTTCAAAAACTACTACCCG-3’ SEQ ID NO.9: COL4A1/COL4A2-Probe：5’-TGTCGGTGTGTCGTCGGC-3’

ITGA4的捕獲序列： SEQ ID NO.10：5’-CTACGCGCGGCTGCAGGGGGCGCTGGGGAACCT-3’

ITGA4的qMSP引子探針： SEQ ID NO.11: ITGA4-FP：5’-ACGCGAGTTTTGCGTAGAC-3’ SEQ ID NO.12: ITGA4-RP：5’-GCTAAATAAAATCCCGAACG-3’ SEQ ID NO.13: ITGA4-Probe：5’-ACGGAGTTCGGTTTTGCGTTTTC-3’

根據這935例糞便標本結果，使用IBM SPSS statistics 20軟體繪製該標記組合檢測結直腸癌和腺瘤的ROC曲線，如圖9所示。

結果顯示，SDC2、COL4A1/COL4A2和ITG4基因甲基化聯合檢測，在特異性為95.28％時，對結直腸癌敏感性高達91.36％，對腺瘤敏感性為50.75％；SDC2、COL4A1/COL4A2和ITG4基因甲基化聯合檢測，檢測結直腸癌的ROC曲線下面積為0.979，95% CI為0.970～0.988，檢測腺瘤的ROC曲線下面積為0.832，95% CI為0.771～0.894。 實施例 5

選取23例確診為結直腸癌的患者，分別在術前和術後3-6個月收集患者的糞便標本，用本申請的標記組合（SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4）檢測術前和術後共46例糞便標本，比較該標記組合在術前術後糞便中甲基化水平。

標記組合的檢測流程和結果判斷標準同實施例4。目標基因CT值≦38判斷為陽性，CT值>38判斷為陰性。結果如圖10所示。

結果顯示，術前這23例結直腸癌患者檢測結果均為陽性，手術後再次檢測其糞便標本，結果均為陰性。說明手術切除腫瘤後，該標記組合的甲基化水平顯著降低，提示該標記組合可用於結直腸癌患者的術後隨訪監測。 對比例 1

研究發現檢測糞便中甲基化SOX21基因可以用於結直腸癌的輔助診斷，現採用甲基化SOX21在糞便中檢測結直腸癌作為對比例。以下為糞便中檢測SOX21基因的流程和結果。

選取240例糞便標本（80例結直腸癌，77例≥1 cm腺瘤，83例正常，均經腸鏡或病理確認），進行研磨離心，加入50 µL捕獲磁珠（含有SOX21和內參基因ACTB的捕獲序列），並按實施例4中所述「技術方案」操作，最後得到Bisulfite轉化後的DNA 20 µL。然後進行qMSP檢測，最後根據CT值判斷標本中SOX21甲基化水平。

試劑中含有的捕獲序列、引子探針，以及qMSP反應體系和程序見參考文獻[2]。根據240例糞便標本結果，繪製SOX21基因檢測結直腸癌和腺瘤的ROC曲線，如圖11所示。

結果顯示，當甲基化的SOX21特異性為97.6％時，對結直腸癌敏感性為80％，對腺瘤敏感性為33.8％；SOX21檢測結直腸癌的ROC曲線下面積為0.926，95% CI為0.885～0.968，檢測腺瘤的ROC曲線下面積為0.667，95% CI為0.583～0.751。 對比例 2

選取161例糞便標本（79例結直腸癌，82例正常，均經腸鏡或病理確認），進行研磨離心，加入50 µL捕獲磁珠（含有SOX21、SDC2和內參基因ACTB的捕獲序列），並按實施例4中所述「技術方案」操作，最後得到Bisulfite轉化後的DNA 20 µL。然後進行qMSP檢測，最後根據CT值判斷標本中SOX21和SDC2的甲基化水平。

SOX21的捕獲序列、引子探針，以及qMSP反應體系和程序同對比例1；SDC2的捕獲序列、引子探針，以及qMSP反應體系和程序同實施例4。

檢測結果顯示甲基化SDC2基因的檢測敏感性為88.6%，特異性為93.9%；曲線下面積為0.939。甲基化SOX21基因的檢測敏感性為79.7%，特異性為86.6%；曲線下面積為0.924。甲基化SOX21基因與甲基化SDC2基因組合的檢測敏感性為87.34%，特異性為93.9%。甲基化SDC2基因與甲基化SOX21基因聯合檢測的檢測敏感性低於甲基化SDC2基因單獨作為大腸癌標記的檢測敏感性，同時也低於本申請SDC2、COL4A1/COL4A2和ITG4基因甲基化聯合檢測的敏感性。 對比例 3

選取109例糞便標本（61例結直腸癌，48例正常，均經腸鏡或病理確認），進行研磨離心，加入50 µL捕獲磁珠（含有ITGA4、COL4A1/COL4A2和內參基因ACTB的捕獲序列）

ITGA4、COL4A1/COL4A2的捕獲序列、引子探針，以及qMSP反應體系和程序同實施例4。

根據這109例糞便標本結果，繪製該標記組合檢測結直腸癌的ROC曲線，如圖12所示。

結果顯示結直腸癌與正常人樣本的區分的曲線下面積為0.964。選擇陽性判斷Ct值為38時，甲基化ITGA4+ COL4A1/COL4A2基因對大腸癌的檢測的敏感性為86.89%，特異性為91.67%。其敏感性及特異性均低於本申請SDC2、COL4A1/COL4A2和ITG4基因甲基化聯合檢測的敏感性和特異性。

以上所述僅是本申請的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本申請原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本申請的保護範圍。

參考文獻： 1. Fischer G, Schmidt, Cornelia, et al. Identification of a novel sequence element in the common promoter region of human collagen type IV genes, involved in the regulation of divergent transcription. Biochem. J. 1993 292: 687-695. 2. Niu F, Wen J, Fu X, et al. Stool DNA Test of Methylated Syndecan-2 for the Early Detection of Colorectal Neoplasia. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2017;26:1411-1419. 3. 劉相林，文加玲，牛鳳，等. 糞便中SOX21基因甲基化檢測在結直腸癌診斷中應用價值[J]. 中華腫瘤防治雜誌,2018(24):1710-1715.

無。

圖1為實施例1中引子對S0的擴增曲線；圖2為實施例1中引子對S0的擴增曲線；圖3為實施例1中引子對S0的擴增曲線；圖4為實施例2中引子對C0的擴增曲線；圖5為實施例2中引子對C1的擴增曲線；圖6為實施例2中引子對C2的擴增曲線；圖7為實施例3中引子對I0的擴增曲線；圖8為實施例3中引子對I1的擴增曲線；圖9為實施例3中引子對I0的擴增曲線；圖10為實施例4中935例糞便標本，SDC2、COL4A1/COL4A2和ITG4基因聯合檢測結直腸癌和腺瘤（≥1 cm）的ROC曲線；圖11為實施例5中用SDC2、COL4A1/COL4A2和ITG4基因聯合檢測的方法檢測23例結直腸癌患者術前術後糞便樣本的檢測結果；圖12為對比例1中240例糞便標本，SOX21基因檢測結直腸癌和腺瘤的ROC曲線；圖13 為對比例2中109例糞便標本，ITGA4、COL4A1/COL4A2基因聯合檢測結直腸癌的ROC曲線。

Claims

一種引子，包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、及SEQ ID NO: 25所示序列、及該些序列之互補序列，中的至少任意一條。
如請求項1所述之引子，其中包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25所示的任意一條；優選地，該引子包含SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4；SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8；SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12；SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19；以及SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 25，所示的至少一對引子對；優選地，該引子包含SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4；SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8；以及SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12，所示的引子對；優選地，該引子包含SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4；SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19；以及SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 25，所示的引子對。
一種捕獲序列，包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 10所示序列、及此些序列之互補序列，中的至少任意一條。
如請求項3所述之捕獲序列，包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6、及SEQ ID NO: 10所示序列，的至少一條；優選地，該捕獲序列包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10所示的序列；優選地，該捕獲序列包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10所示的序列。
一種核酸探針，包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 9、及SEQ ID NO: 13所示序列、及此些序列之互補序列，中的至少任意一條。
如請求項5所述之該核酸探針，包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 13所示序列中的至少一條；優選地，該核酸探針包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 13所示的序列。
一種多基因甲基化聯合檢測試劑，包括SDC2、COL4A1/COL4A2和ITGA4基因的甲基化檢測的試劑。
如請求項7所述之多基因甲基化聯合檢測試劑，其中包括針對SDC2、COL4A1/COL4A2和ITGA4基因的捕獲序列、引子和／或探針。
如請求項7所述之多基因甲基化聯合檢測試劑，其中該SDC2基因的甲基化檢測的捕獲序列包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： I、SEQ ID NO:1或2任一所示的核苷酸序列；及 II、如Ⅰ所示序列的互補序列；且／或該COL4A1/COL4A2基因的甲基化檢測的捕獲序列包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： III、SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；及 IV、如III所示序列的互補序列；且／或該ITGA4基因的甲基化檢測的捕獲序列包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： V、SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；及 VI、如V所示序列的互補序列；優選地，該SDC2基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： VII、SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；及 VIII、如VII所示序列的互補序列；且／或該SDC2基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： IX、SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；及 X、如IX所示序列的互補序列；且／或該COL4A1/COL4A2基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XI、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18任一所示的核苷酸序列；及 XII、如XI所示序列的互補序列；且／或該COL4A1/COL4A2基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XIII、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:19任一所示的核苷酸序列； XIV、如XIII所示序列的互補序列；優選地，該COL4A1/COL4A2基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；優選地，該COL4A1/COL4A2基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示；且／或該ITGA4基因的甲基化檢測的引子中的上游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XV、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:24任一所示的核苷酸序列；及 XVI、如XV所示序列的互補序列；且／或該ITGA4基因的甲基化檢測的引子中的下游引子包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XVII、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:25任一所示的核苷酸序列；及 XVIII、如XVII所示序列的互補序列；優選地，該ITGA4基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；優選地，該ITGA4基因的甲基化檢測的引子對如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示；優選地，該SDC2基因的甲基化檢測的探針包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XIX、SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；及 XX、如XIX所示序列的互補序列；且／或該COL4A1/COL4A2基因的甲基化檢測的探針包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XXI、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；及 XXII、如XXI所示序列的互補序列；且／或該ITGA4基因的甲基化檢測的探針包含如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XXIII、SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；及 XXIV、如XXIII所示序列的互補序列。
一種包含請求項1所述引子、或請求項2所述捕獲序列、或請求項3所述核酸探針、或請求項4-5任一所述試劑的試劑盒；優選地，該試劑盒包括：第一容器，其包含捕獲試劑；第二容器，其包含用於擴增的引子對；第三容器，其包含探針。
如請求項1或2所述引子，或者請求項3或4所述捕獲試劑，或者請求項5或6所述核酸探針，或者請求項7-9任一所述試劑，在製備甲基化檢測的試劑或試劑盒中的用途，或者製備檢測結直腸腫瘤的試劑或試劑盒中的用途。
如請求項1或2所述引子，或者請求項3或4所述捕獲試劑，或者請求項5或6所述核酸探針，或者請求項7-9任一所述試劑，或者請求項10所述試劑盒，在甲基化檢測中的用途，或者在檢測結直腸腫瘤中的用途。
如請求項11或12任一所述之用途，其中該結直腸腫瘤為結直腸癌或腺瘤。
如請求項11或12任一所述之用途，其中，檢測所針對的待測樣本包含組織、體液或排泄物；優選地，該組織包含腸組織；優選地，該體液包含血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、淋巴液、腦脊液或房水；優選地，該排泄物包含痰液、尿液、唾液或糞便；更優選地，該排泄物包含糞便。