TW202028473A - Hoxa9甲基化檢測試劑在製備肺癌診斷試劑中的用途 - Google Patents

Hoxa9甲基化檢測試劑在製備肺癌診斷試劑中的用途 Download PDF

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Abstract

本公開涉及一種以HOXA9的甲基化為檢測對象的檢測試劑在製備肺癌診斷試劑中的用途。本公開以HOXA9作為檢測肺癌的腫瘤標記，其在痰液中的敏感度高達74.3%，特異性高達95%，檢測敏感度高於現有的肺癌標記，在灌洗液中的敏感度高達61.9%，特異性高達95%，尤其是對腺癌，敏感度有了大幅度的提升，對於腺癌的檢測有極大的應用價值。

Description

HOXA9甲基化檢測試劑在製備肺癌診斷試劑中的用途
本公開屬基因診斷領域，更具體地，本公開涉及一種診斷人HOXA9基因甲基化檢測試劑在製備肺癌診斷試劑中的應用，以及人HOXA9基因甲基化檢測的方法。
肺癌是起源於支氣管黏膜、腺體或肺泡上皮的肺部惡性腫瘤。按照病理類型可以分為：1、小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）：一種特殊病理學類型的肺癌，有明顯的遠處轉移傾向，預後較差，但多數病人對放化療敏感。2、非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）：除小細胞肺癌以外其他病理學類型的肺癌，包括鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌等。在生物學行為和臨床病程方面具有一定差異。按照發生位置又可以分為：1、中心型肺癌（central lung cancer）：生長在肺段支氣管開口及以上的肺癌。2、周圍型肺癌（peripheral lung cancer）：生長在肺段支氣管開口以遠的肺癌。
肺癌的早期診斷與早期手術是提高肺癌5年生存率、降低死亡率最有效的方法之一。
肺癌目前的臨床輔助診斷主要有以下幾種，但是他們都不能完全做到早發現，早診斷：
1、血液生化檢查：對於原發性肺癌，目前無特異性血液生化檢查。肺癌病人血液鹼性磷酸酶或血鈣升高考慮骨轉移的可能，血液鹼性磷酸酶、穀草轉胺酶、乳酸脫氫酶或膽紅素升高考慮肝轉移的可能。
2、腫瘤標記檢查：（1）CEA：30%～70%肺癌患者血清中有異常高水平的CEA，但主要見於較晚期肺癌患者。目前血清中CEA的檢查主要用於估計肺癌預後以及對治療過程的監控。（2）NSE：是小細胞肺癌首選標記，用於小細胞肺癌的診斷和監測治療反應，根據檢測方法和使用試劑的不同，參考值不同。（3）CYFRA21-1：是非小細胞肺癌的首選標記，對肺鱗癌診斷的敏感性可達60%，根據檢測方法和使用試劑的不同，參考值不同。
3、影像學檢查：（1）胸部X光檢查：應包括胸部正位和側位片。在基層醫院，胸部正側位片仍是肺癌初診時最基本和首選的影像診斷方法。一旦診斷或疑診肺癌，即行胸部CT檢查。（2）CT檢查：胸部CT是肺癌的最常用和最重要的檢查方法，用於肺癌的診斷與鑒別診斷、分期及治療後隨診。有條件的醫院在肺癌病人行胸部CT掃描時範圍應包括腎上腺。應儘量採用增強掃描，尤其是肺中心型病變的患者。CT是顯示腦轉移瘤的基本檢查方法，有臨床症狀者或進展期病人應行腦CT掃描，並盡可能採用增強掃描。CT引導下肺穿刺活檢是肺癌的重要診斷技術，有條件的醫院可將其用於難以定性的肺內病變的診斷，以及臨床診斷肺癌需經細胞學、組織學證實而其它方法又難以取材的病例。（3）超聲檢查：主要用於發現腹部重要器官及腹腔、腹膜後淋巴結有無轉移，也用於頸部淋巴結的檢查。對於貼鄰胸壁的肺內病變或胸壁病變，可鑒別其囊實性及進行超聲引導下穿刺活檢；超聲還常用于胸水抽取定位。（4）骨掃描：對肺癌骨轉移檢出的敏感性較高，但有一定的假陽性率。可用於以下情況：肺癌的術前檢查；伴有局部症狀的病人。
4、其它檢查：（1）痰細胞學檢查：目前肺癌簡單方便的無創診斷方法，連續塗片檢查可提高陽性率約達60%，是可疑肺癌病例的常規診斷方法。（2）纖維支氣管鏡檢查：肺癌診斷中最重要的手段之一，對於肺癌的定性定位診斷和手術方案的選擇有重要的作用。對擬行手術治療的患者為必需的常規檢查項目。而經支氣管鏡穿刺活檢檢查（TBNA），雖利於治療前分期，但因技術難度和風險較大，有需要者應轉上級醫院進一步檢查。（3）其他：如經皮肺穿刺活檢、胸腔鏡活檢、縱隔鏡活檢、胸水細胞學檢查等，在有適應症的情況下，可根據現有條件分別採用以協助診斷。
影像學檢查中的多層螺旋CT和低劑量CT（LDCT）是發現早期肺癌和降低死亡率的有效篩查工具，全美國家肺癌篩查研究（NLST）已經表明LDCT相比胸部X光篩查可降低20%肺癌的死亡率。在臨床實踐工作中證明，任何肺癌篩查項目的成敗取決於高危人群的識別，融合多重高危因素的風險預測模型已被世界公認是識別肺癌高危人群的方法之一。風險模型通過協助臨床醫生改進干預措施或治療手段，從而進一步改善肺癌患者的療效。雖然世界已經認同針對高危人群的篩查能夠降低肺癌目前較高的死亡率，但高危人群界定仍然是難以解決的問題。為了使肺癌篩查的效益—傷害比達到最大化，關鍵的問題第一是如何界定高危患病風險的人群；第二是用什麼方法對該人群進行篩查，包括高危因素的界定，總體風險的量化匯總以及篩查效益界值的選擇。
現有的肺癌檢測技術中主要存在靈敏度低、假陽性高，有創，並且，目前常規檢測技術難以檢出早期肺癌。
而肺癌的無創檢測，例如，痰液檢測，難度則更大。儘管也有研究者研究肺癌患者痰液中的腫瘤標記，然而，對比起其他腫瘤患者血液樣本的腫瘤標記檢測及評估，痰液樣本的成功率卻很低。這主要由於以下原因：①痰液的成分比較複雜，不同的人群在不同的疾病或者環境下痰液的成分和黏度等差異比較大；②痰液中含有較多的氣管上皮細胞和細菌，口腔黏膜細胞等非肺癌細胞的成分，一般的樣本處理方法無法有效的富集到數目充足的肺癌來源的DNA；③有很多的吸煙患者並不表現出咳痰。A J Hubers等人在《Molecular sputum analysis for the diagnosis of lung cancer》中對過去10篇文獻研究顯示，肺癌組織中標記的中位數的甲基化程度為48%，而痰液的中位數的甲基化程度為38%，結果顯示甲基化標記在組織中的檢出率明顯高於痰液。同時，Rosalia Cirincione（Methylation profile in tumor and sputum samples of lung cancer patientsdetected by spiral computed tomography: A nested case–contro）報道了RARbeta2、P16、RASSF1A在肺癌組織中檢出率分別達到65.5%、41.4%、51.7%，而在痰液中分別只有44.4%、5%、5%。
目前肺癌的漏檢率較高。特別是，對於腺癌這種類型，痰液無創檢測更加是難上加難，檢出率極其低。這是因為，多數腺癌起源於較小的支氣管，為周圍型肺癌，肺深部的脫落細胞更加難以通過痰液咳出。因此，目前腺癌的痰液檢測手段幾乎為零。
降低漏檢率在腫瘤早期篩查中是尤其重要的。如果一個腫瘤早期篩查產品無法將所有或絕大部分的病患篩查出來的話，那麼漏檢的那些將無法得到足夠的風險提示，從而延誤的治療時機，這對患者來說是一個巨大的損失。
儘管現有技術中已經發現了一些肺癌相關的腫瘤標記，但是，受限於針對這些腫瘤標記的檢測試劑或者檢測手段，導致這些腫瘤標記的靈敏度和特異性不能滿足需求，因此，目前本領域中仍然需要進一步研究能夠切實地應用於肺癌的篩查手段。雖然無創式的篩查具有取樣方面獨到的優勢，然而，其也具有其他方面的一些局限，例如，肺癌中的腺癌這種類型，由於其肺深部的脫落細胞難以通過痰液咳出，通常說來，本領域技術人員會認為該種類型的肺癌不適宜採用無創篩查。另一方面，即使是其他類型的肺癌，目前已報道的無創篩查方法也很難達到臨床使用的要求。儘管相關研究已進展多年，但至今仍未有可以推向臨床的肺癌無創篩查方法。
本公開的目的在於提供一種肺癌腫瘤標記的甲基化檢測試劑在製備肺癌診斷試劑中的用途。
本公開的另一個目的在於提供一種在痰液和灌洗液中檢測敏感性不明顯亞於組織中的肺癌腫瘤標記的甲基化檢測試劑在製備肺癌診斷試劑中的用途。
本公開的另一個目的在於提供一種在痰液和灌洗液中針對腺癌具有高敏感性和特異性的腫瘤標記的甲基化的檢測試劑在製備肺癌診斷試劑中的用途。
本公開的另一個目的在於提供一種檢測HOXA9基因甲基化的方法。
本公開的上述目的通過以下技術手段實現：
發明人經過深入的研究，揭示了一種檢測基因甲基化來提高肺癌檢出率的方法，所述甲基化基因是人HOXA9基因。發明人不僅在組織樣本中驗證了檢測HOXA9甲基化對肺癌的檢出具有較高的特異性和靈敏性，同時驗證了在痰液樣本和灌洗液樣本中具有同樣高的特異性和靈敏性。
本公開的第一方面提供了HOXA9基因甲基化的檢測試劑在製備肺癌診斷試劑中的用途。
HOXA9基因是HOX（homebox 同源盒）基因家族的一員，屬染色體7p15-p14上的HOXA簇基因，與其他的HOX基因一樣，均含有一段180bp的DNA片段，轉錄由60個胺基酸組成的同源結構域。HOXA9是編碼序列特異性轉錄調控因子，在胚胎的時空發育，細胞的分化、增殖與遷移，腫瘤的惡性演變和誘發凋亡都有著重要作用。目前研究比較多的是HOXA9的異常表達在白血病的發生和發展中起著重要的作用，也有部分報道HOXA9基因的肺癌、人細胞膠質瘤等癌症相關。
其中，所述HOXA9基因甲基化的檢測試劑檢測HOXA9基因經轉化試劑修飾後的序列。其中，轉化試劑是指使DNA中的胞嘧啶脫胺基成為尿嘧啶，同時使5-MeC基本上不受影響的試劑。示例性的轉化試劑包括肼鹽、重亞硫酸氫鹽（例如重亞硫酸氫鈉等）、亞硫酸氫鹽（例如偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鉀、亞硫酸氫銫、亞硫酸氫銨等）、或在適當的反應條件下可產生肼鹽、重亞硫酸氫鹽、亞硫酸氫鹽的化合物中的一種或幾種。作為一種示範性的實施方式，所述HOXA9基因甲基化的檢測試劑檢測經重亞硫酸氫鹽修飾後的序列。
甲基化的發生是胞嘧啶上多了一個甲基，經過亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽或肼鹽處理後，胞嘧啶會變成脲嘧啶，因為在進行PCR擴增時尿嘧啶與胸腺嘧啶相似而會被識別為胸腺嘧啶，體現在PCR擴增序列上就是沒有發生甲基化的胞嘧啶變成了胸腺嘧啶（C變成T），甲基化的胞嘧啶（C）則不會發生變化。PCR檢測甲基化基因的技術通常為甲基化特異性PCR（Methylmion Specific PCR，MSP），針對處理後的甲基化片段（即片段中未改變的C）設計引子，進行PCR擴增，如果有擴增則說明發生了甲基化，無擴增則沒有甲基化。
作為可選的實施方式，HOXA9基因甲基化的檢測試劑所針對HOXA9基因的檢測區域包含HOXA9基因的CG富集區域或非CG富集區域或CTCF（CTCF-binding sites）區域。作為優選的實施方式，HOXA9基因甲基化的檢測試劑所針對的檢測區域包含HOXA9基因的CG富集區域或CTCF（CTCF-binding sites）區域。
或者，HOXA9基因甲基化的檢測試劑所針對HOXA9基因的檢測區域包含HOXA9基因體或者其啟動子區域。
在一些實施方式中，所述HOXA9基因甲基化的檢測試劑針對檢測區域包含SEQ ID NO: 22（區域1）、SEQ ID NO: 24（區域2）或SEQ ID NO: 26（區域3）所示的序列。作為更優選的實施方式，所述試劑針對檢測區域包含SEQ ID NO: 22所示的序列。
發明人經實驗發現，HOXA9基因檢測區域的選擇，會對腫瘤的檢測效能產生影響，根據HOXA9基因CG富集區域設計的引子，不同區域設計的引子對檢測結果有明顯的差異，好的區域對腫瘤的檢出率比差的區域高出50%~60%。發明人經過實驗比較發現，對GC富集區域或CTCF（CTCF-binding sites）區域的檢測結果要明顯較非高甲基化區域好。
本公開的HOXA9基因甲基化的檢測試劑，包含擴增引子。作為可選的實施方式，所述引子包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58中的至少任意一條。作為優選的實施方式，所述引子包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示引子對。
本公開的HOXA9基因甲基化的檢測試劑，還包含探針。作為可選的實施方式，所述探針如SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 59所示。作為優選的實施方式，所述探針如SEQ ID NO: 3所示。作為本公開的優選方式，為方便臨床使用，檢測探針標記的螢光基團包含但不限於 VIC、ROX、FAM、Cy5、HEX、TET、JOE、NED、Texas Red 等 ；淬滅基團包含但不限於TAMRA、BHQ、MGB、Dabcyl等等，以適用於目前臨床檢測常用的多通道 PCR 檢測系統，實現在一個反應管中進行多色螢光檢測。
作為優選的實施方式，本公開的HOXA9基因甲基化的檢測試劑包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示引子對以及如SEQ ID NO: 3所示所述探針。
作為可選的實施方式，本公開的HOXA9基因甲基化的檢測還包含亞硫酸氫鹽、重亞硫酸氫鹽或肼鹽，用於將HOXA9中甲基化的胞嘧啶修飾成胸腺嘧啶。當然，也可以不包含在本公開的試劑中。使用時獨立購買即可。
作為可選的實施方式，本公開的HOXA9基因甲基化的檢測還包含DNA 聚合酶、dNTPs、Mg²⁺離子、緩衝液中的一種或幾種；優選地，包含DNA 聚合酶、dNTPs、Mg²⁺離子和緩衝液，用於對HOXA9基因進行擴增反應。
作為可選的實施方式，本公開的HOXA9基因甲基化的檢測還包含參考基因的檢測試劑。優選地，所述參考基因包含β-actin或COL2A1，除了這兩個參考基因，也可以採用現有技術的其他的甲基化檢測的參考基因。進一步的，所述參考基因β-actin的檢測試劑包含針對參考基因的引子和探針。作為優選的實施方式，所述參考基因的檢測試劑包含SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17所示的引子對，以及SEQ ID NO: 18的探針。所述參考基因COL2A1的檢測試劑包含SEQ ID NO: 60（TTTTGGATTTAAGGGGAAGATAAA）、SEQ ID NO: 61（TTTTTCCTTCTCTAC​ATCTTTCTACCT）所示的引子對，以及SEQ ID NO: 62（AAGGGAAATTGAGAAATGAGAGAAG​GGA）所示的探針。
本公開另一方面提供了一種檢測HOXA9基因的DNA 甲基化的方法，包括以下步驟： （1） 將檢測樣本進行亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽或肼鹽處理，獲得經修飾的檢測樣本； （2） 利用上述的HOXA9基因甲基化的檢測對步驟（1）經修飾的檢測樣本進行HOXA9基因甲基化情況檢測。
作為可選的方式，採用甲基化特異性聚合酶鏈反應（MSP）或實時螢光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative methylation-specific PCR，qMSP）進行檢測。其餘現有技術中報道的DNA甲基化檢測方法也可以應用於本公開中。現有技術的甲基化檢測方法可通過專利USSN62/175,916引入本公開。
本公開另一方面還提供了一種肺癌的檢測／診斷／預後系統，所述系統含有： HOXA9基因的DNA 甲基化檢測構件，以及， 結果判斷構件。
在一些實施方式中，所述HOXA9基因的DNA甲基化檢測構件含有上述HOXA9基因甲基化的檢測試劑。
在一些實施方式中，所述甲基化檢測構件包含螢光定量PCR儀、PCR儀、測序儀中的一種或多種。在一些實施方式中，所述結果判斷構件用於根據檢測構件檢測的HOXA9基因的DNA 甲基化水平，輸出診斷結果如肺癌的患病風險和／或肺癌類型；
在一些實施方式，所述患病風險是通過結果判斷構件比較待測樣本與正常樣本的甲基化水平，基於待測樣本與正常樣本的甲基化水平的偏離得出的。
在一些實施方式中，所述結果判斷構件含有數據處理機器。
在一些實施方式中，所述數據處理機器包括本領域技術人員可使用的任何可以進行數據處理的設備或儀器或裝置。
在一些實施方式中，所述數據處理機器包含計算機、電腦中的一種或多種。所述電腦中附載有本領域技術人員可使用的任何可以進行數據處理或統計分析的軟體或程序。在一些實施方式中，所述電腦包含附載有SPSS、SAS、Excel中一種或多種軟體的電腦。
在一些實施方式中，所述結果判斷構件還含有結果輸出器。所述輸出器包含任何可以將數據處理結果顯示為可閱讀的內容的設備或儀器或裝置。在一些實施方式中，所述結果輸出器包含屏幕、紙質報告中的一種或多種。
本公開另一方面提供了一種肺癌的診斷方法，所述方法包括以下步驟： 檢測來源於受試者的待測樣本HOXA9基因甲基化水平； 將待測樣本與正常樣本的HOXA9基因甲基化水平比較； 基於待測樣本與正常樣本的甲基化水平的偏離情況，診斷肺癌。
在一些實施方式中，所述待測痰液樣本甲基化水平大於2.3%時，則判定待測樣本為肺癌樣本，甲基化水平小於等於2.3%時，則判定待測樣本為非肺癌樣本。
在一些實施方式中，當所述待測灌洗液樣本甲基化水平大於0.5%時，則判定待測樣本為肺癌樣本，甲基化水平小於等於0.5%時，則判定待測樣本為非肺癌樣本。
本公開的診斷方法可以在肺癌治療前後使用或者與肺癌治療聯合使用，治療後使用如評價治療的成功或者監測治療後肺癌的緩解、復發和／或進展（包括轉移）。
本公開另一方面提供了一種肺癌的治療方法，所述方法包括對經上述診斷方法診斷為肺癌的患者，施用手術、化療、放療、放化療、免疫療法、溶瘤病毒療法、或其他本領域所用的任何其他類型肺癌治療方法以及這些治療方法的組合。本公開中，所述HOXA9基因甲基化的檢測試劑的檢測樣本包含痰液、肺部灌洗液、肺部組織、胸水，血液、血清、血漿、尿液、前列腺液、淚液或糞便等等。作為優選的實施方式，所述HOXA9基因甲基化的檢測試劑的檢測樣本包含痰液、組織或肺部灌洗液。作為更優選的實施方式，所述HOXA9基因甲基化的檢測試劑的檢測樣本包含痰液或肺部灌洗液。
本公開發現，HOXA9基因在組織中的甲基化水平與肺癌的發病關聯度很高。185例組織中，HOXA9基因正常組和全部肺癌組比較，其特異性高達95% ，而靈敏度為78.6%，雖然靈敏度較本公開實驗中另外一個腫瘤標記SHOX2（靈敏度80.6%）基因低，而讓人意外的發現是，HOXA9基因在痰液以及肺部灌洗液中所檢出的甲基化水平與肺癌的發病也保持了較高的關聯度，在痰液中，HOXA9的敏感性為74.3%，特異性95%；在肺部灌洗液中，敏感性為61.9%，特異性95%。
在發明人研究的多種分子標記中，無一不是痰液樣本的檢測敏感性或特異性對比組織樣本大幅下降。例如，SHOX2、PCDHGA12、HOXD8、GATA3這幾個被報道跟肺癌有關的基因，其中，SHOX2在組織中的檢測敏感性為80.6%，高於HOXA9基因的靈敏度，而在痰液中，敏感度大幅度降低到51.4%，顯著低於HOXA9基因的74.3%（註：正常組和全部癌症組比較）。因此，在以痰液為檢測樣本時，尤其適合採用HOXA9基因作為腫瘤標記。
研究發現，多種肺癌標記僅在組織中顯示出良好的檢測敏感性和特異性；而在痰液和肺部灌洗液樣本中，無論如何設計和優化檢測區域、檢測引子、探針等，敏感性仍大幅下降，嚴重影響了肺癌的診斷。
而HOXA9基因在痰液和肺部灌洗液樣本中的也保持較高的靈敏度，且保持高達95%的特異性，這使得這種基因極其特別地可以作為痰液和肺部灌洗液樣本中可靠的肺癌標記。
本公開中，所述肺癌選自小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）；進一步地，所述非小細胞肺癌選自鱗狀細胞癌、腺癌或大細胞癌。作為優選的實施方式，所述肺癌選自腺癌。
經實驗證實，HOXA9基因在多種不同類型肺癌中，均具有很高的特異性以及較高的靈敏度，即便是在肺腺癌中，也具有比其他腫瘤標記高的靈敏度，如在痰液中，HOXA9的檢測靈敏度是55.6%，而SHOX2的靈敏度卻是11.1%（見實施例2表6），這更加說明了，HOXA9尤其適合以痰液作為檢測樣本，特別是針對肺腺癌的檢測。目前，肺腺癌的漏檢率較高。一方面，由於肺腺癌較容易發生於女性及不抽煙者，發病率比鱗癌和未分化癌低，發病年齡較小，女性相對多見；另一方面，多數腺癌起源於較小的支氣管，為周圍型肺癌，肺深部的脫落細胞更加難以通過痰液咳出；再一方面，肺腺癌早期一般沒有明顯的臨床症狀。因此，對肺腺癌的檢測更具困難性和價值性。
上述技術方案中的一個技術方案的有益效果為：不僅可以以組織作為檢測樣本，且突出的，其在痰液和肺部灌洗液中具有更高的靈敏度，可以簡便地以痰液和肺部灌洗液作為檢測樣本，對肺癌進行可靠的診斷。痰液樣品獲得非常容易，而且不會對病人造成任何的痛苦和不便。使用樣本量極少，取樣過程非常方便且對病人無任何影響。同時樣品便於郵寄或者是隨身帶到醫院做檢查。
上述技術方案中的一個技術方案的有益效果為：可以檢測多種類型的肺癌，且針對難檢測的腺癌，其也具有相對其他標記更高的靈敏度。
上述技術方案中的一個技術方案的有益效果為：無需考慮檢測的對象和年齡，適用範圍廣。
上述技術方案中的一個技術方案的有益效果為：通過甲基化水平來檢測和診斷癌症，越來越多的研究證實甲基化改變是腫瘤發生過程中的早期事件，檢測甲基化異常更易發現早期病變。
以下通過具體的實施例進一步說明本公開的技術方案，具體實施例不代表對本公開保護範圍的限制。其他人根據本公開理念所做出的一些非本質的修改和調整仍屬本公開的保護範圍。
本公開中的「引子」或「探針」是指一種寡核苷酸，其包含與靶核酸分子（例如靶基因）的至少6個連續核苷酸的序列互補的區域。在一些實施方案中，所述引子或探針至少一部分序列與擴增的序列不互補。在一些實施方案中，引子或探針包含與靶分子的至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個連續或不連續的分塊核苷酸的序列互補的區域。當引子或探針包含「與靶分子的至少x 個連續核苷酸互補」的區域時，所述引子或探針與靶分子的至少x 個連續核苷酸至少95%互補。在一些實施方案中，引子或探針與靶分子至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%互補。
本公開的「診斷」，除了肺癌的早期診斷，還包括肺癌中期和晚期的診斷，且也包括肺癌篩選、風險評估、預後、疾病識別、病症階段的診斷和治療性靶標的選擇。
肺癌標記HOXA9的應用使得肺癌的早期診斷成為可能。當確定在癌症細胞中甲基化的基因在臨床上或形態學上正常表像的細胞中甲基化時，這就表明該正常表像的細胞向癌症發展。這樣，肺癌可在早期通過在正常表像的細胞中的肺癌特異性基因HOXA9的甲基化而診斷。
作為病症階段診斷可選的實施方式，可在肺癌在不同階段或時期的進展，通過從樣品中獲取的HOXA9的甲基化程度的測量進行診斷。通過比較從肺癌的每個階段的樣品中分離出的核酸的HOXA9基因甲基化程度與從沒有細胞增殖性異常的肺部組織中的樣品中分離出的一個或多個核酸的HOXA9基因甲基化程度，可檢測樣品中肺癌的具體階段。
本公開中，「正常」樣本指分離自已知無所述癌症或腫瘤的個體的相同類型的樣本。
本公開中，所述「受試者」是哺乳動物，例如是人。
本公開甲基化檢測的樣本包括但不限於DNA，或RNA，或含mRNA的DNA和RNA樣品、或DNA-RNA雜交體。其中DNA或者 RNA可為單鏈或雙鏈。
用於甲基化檢測的方法是公知的，如甲基化特異性聚合酶鏈反應、實時螢光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應、焦磷酸測序、使用甲基化DNA特異性結合蛋白的PCR，定量PCR，以及DNA芯片、差別化甲基化檢測—甲基化敏感的限制性內切酶、差別化甲基化檢測—亞硫酸鹽測序法等等，除此之外，其他的甲基化檢測方法可以通過專利US62007687引入。
本公開中，「甲基化水平」同「甲基化程度」，通常可以表示為甲基化胞嘧啶的百分比，其為甲基化的胞嘧啶數量除以甲基化胞嘧啶的數量與未甲基化胞嘧啶數量的總和；以及目前普遍採用甲基化靶向基因數量除以參考基因數量的方法來表示甲基化水平；以及其他現有技術中的甲基化水平表示方法。
實施例 1 ：檢測靶基因的選擇
以甲基化 DNA 作為檢測靶標具有明顯的優點，相比蛋白質類標記，DNA 是可以擴增的，並且很容易檢測到 ；與突變類標記相比，發生DNA甲基化的部位都位於基因的特定部位，一般在啟動子區，這使檢測變得更容易和方便。為了完成本公開，發明人經過多輪的篩選，從數百個候選基因中篩選出較好的HOXA9、SHOX2、PCDHGA12、HOXD8、GATA3 作為候選的檢測基因，β-actin基因作為參考基因，研究各個基因甲基化位點分佈情況，設計檢測的引子探針分別用於實時螢光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative methylation-specific PCR，qMSP）檢測。各基因檢測引子探針如下：
HOXA9的檢測引子和探針為： SEQ ID NO: 1  HOXA9-F2 引子F：TTAGTTTTTTCGGTAGGCGGC SEQ ID NO: 2  HOXA9-R2 引子R：AAACGCCAAACACCGTCG SEQ ID NO: 3  HOXA9-P2 探針：FAM-ACGTTGGTCGAGTATTTCGATTTTAGTTC-BQ1
SHOX2的檢測引子和探針為： SEQ ID NO: 4  SHOX2 引子F：TTTAAAGGGTTCGTCGTTTAAGTC SEQ ID NO: 5  SHOX2 引子R：AAACGATTACTTTCGCCCG SEQ ID NO: 6  SHOX2 探針：FAM-TTAGAAGGTAGGAGGCGGAAAATTAG-BQ1
PCDHGA12的檢測引子和探針為： SEQ ID NO: 7  PCDHGA12 引子F：TTGGTTTTTACGGTTTTCGAC SEQ ID NO: 8  PCDHGA12 引子R：AAATTCTCCGAAACGCTCG SEQ ID NO: 9  PCDHGA12 探針：FAM-ATTCGGTGCGTATAGGTATCGCGC-BQ1
HOXD8的檢測引子和探針為： SEQ ID NO: 10  HOXD8 引子F：TTAGTTTCGGCGCGTAGC SEQ ID NO: 11  HOXD8 引子R：CCTAAAACCGACGCGATCTA SEQ ID NO: 12  HOXD8 探針：FAM-AAAACTTACGATCGTCTACCCTCCG-BQ1
GATA3的檢測引子和探針為： SEQ ID NO: 13  GATA3 引子F：TTTCGGTAGCGGGTATTGC SEQ ID NO: 14  GATA3 引子R：AAAATAACGACGAACCAACCG SEQ ID NO: 15  GATA3 探針：FAM-CGCGTTTATGTAGGAGTGGTTGAGGTTC-BQ1
β-actin的檢測引子和探針為： SEQ ID NO: 16  β-actin 引子F：TTTTGGATTGTGAATTTGTG SEQ ID NO: 17  β-actin 引子R：AAAACCTACTCCTCCCTTAAA SEQ ID NO: 18  β-actin 探針：FAM-TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT-BQ1
實驗過程：
1 、提取 DNA
收集確診肺癌患者的標本和非腫瘤患者標本，分別包括石蠟組織標本、痰液標本、灌洗液標本，樣品預處理及分離細胞，按照美基生物公司試劑盒HiPure FFPE DNA Kit(D3126-03) 說明書進行DNA提取。
2 、 DNA 重亞硫酸氫鹽處理
以 ZYMO RESEARCH 生物公司試劑盒 EZ DNA Methylation™ KIT(D5002)說明書進行重亞硫酸氫鹽修飾。
3 、擴增與檢測 [表1] 配液體系
HOXA9 SHOX2 PCDHGA12 HOXD8 GATA3 β-actin
反應組分 加入量(µl) 加入量(µl) 加入量(µl) 加入量(µl) 加入量(µl) 加入量(µl)
上游引子 (100 µM) 0.125 0.05 0.125 0.05 0.125 0.125
下游引子 (100 µM) 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125
探針(100 µM) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
鎂離子(25 mM) 4 5 5 5 3 5
dNTPs(10 mM) 1 1 1 1 1 1
Taq聚合酶(5 unit/µl) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
5×緩衝液 5 5 5 5 5 5
滅菌水 13.2 12.275 12.2 12.275 14.2 12.2
模板DNA 1 1 1 1 1 1
總體積 25 25 25 25 25 25
擴增體系： [表2] PCR反應過程
  HOXA9 SHOX2 PCDHGA12 HOXD8 GATA3 β-actin  
步驟 溫度和時間 溫度和時間 溫度和時間 溫度和時間 溫度和時間 溫度和時間 循環數目
預變性 95°C 5分鐘 95°C 5分鐘 95°C 5分鐘 95°C 5分鐘 95°C 5分鐘 95°C 5分鐘 1
擴增1 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 10
63°C 30秒 60°C 30秒 60°C 30秒 60°C 30秒 60°C 30秒 62°C 30秒
70°C 30秒 70°C 30秒 70°C 30秒 70°C 30秒 70°C 30秒 70°C 30秒
擴增2 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 45
60°C 30秒 55°C 60秒 55°C 60秒 55°C 60秒 55°C 60秒 54°C 60秒
72°C 30秒 72°C 30秒 72°C 30秒 72°C 30秒 72°C 30秒 72°C 30秒
冷卻 40°C 30秒 40°C 30秒 40°C 30秒 40°C 30秒 40°C 30秒 40°C 30秒 1
4 、檢測結果
4.1、石蠟組織中的檢測結果
樣本信息：肺組織樣本共計185例，其中正常組織樣本87例，癌組織樣本98例，98例癌症組樣本中有鱗癌15例，腺癌81例，未明確分類的肺癌2例，其中癌和癌旁對照樣本73對。
HOXA9、SHOX2、PCDHGA12、HOXD8、GATA3在所有組織標本中檢測的ROC曲線圖1所示。各基因在組織中檢測的統計結果表3所示。 [表3] 組織中的檢測結果
分析組別 指標 HOXA9 SHOX2 PCDHGA12 HOXD8 GATA3
正常組和全部癌症組比較 特異性 95.0% 95.0% 95.0% 95.0% 95.0%
靈敏度 78.6% 80.6% 69.4% 40.8% 67.3%
正常組和全部鱗癌組比較 特異性 95.0% 95.0% 95.0% 95.0% 95.0%
靈敏度 93.3% 93.3% 53.3% 60.0% 73.3%
正常組和全部腺癌組比較 特異性 95.0% 95.0% 95.0% 95.0% 95.0%
靈敏度 75.3% 79.0% 71.6% 38.3% 65.4%
從以上結果可以看出，在組織樣本中，無論是將肺癌作為一個整體進行比較分析，還是按照肺癌的亞型進行比較分析，SHOX2和HOXA9的檢測效果最好， PCDHGA12和GATA3的檢測效果次之，HOXD8的檢測效果最差，靈敏度只達到40.8%。
根據以上結果，為了研究痰液中的不同基因的檢測情況，發明對HOXA9、SHOX2、PCDHGA12、HOXD8和GATA3這5個標記在痰液中進行進一步的篩選，因為痰液作為無創性的檢測樣本，更具重要意義。
實施例 2 ： HOXA9 、 SHOX2 、 PCDHGA12 、 HOXD8 和 GATA3 基因在痰液中的檢測
樣本信息：測試痰液樣本共計90例，其中正常對照組樣本55例，癌症組對照樣本35例，35例癌症組樣本中有鱗癌12例，小細胞癌6例，腺癌9例，大細胞癌2例，未明確分類的肺癌6例。
試驗過程：
a. 收集確診為肺癌患者和非肺癌患者的痰液標本，使用DTT解稠後，離心取沉澱分離細胞，使用PBS洗滌2遍，然後使用美基生物公司（Magen）的DNA提取試劑盒（HiPure FFPE DNA Kit，D3126-03）提取DNA。
b. 使用ZYMO RESEARCH生物公司的DNA轉化試劑盒（EZ DNA Methylation Kit，D5002）進行DNA的重亞硫酸氫鹽修飾。
c. 配液體系如下： [表4] 配液體系
HOXA9 SHOX2 PCDHGA12 HOXD8 GATA3 β-actin
反應組分 加入量(µl) 加入量(µl) 加入量(µl) 加入量(µl) 加入量(µl) 加入量(µl)
上游引子 (100 µM) 0.125 0.05 0.125 0.05 0.125 0.125
下游引子 (100 µM) 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125
探針(100 µM) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
鎂離子(25 mM) 4 5 5 5 3 5
dNTPs(10 mM) 1 1 1 1 1 1
Taq聚合酶(5 unit/µl) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
5×緩衝液 5 5 5 5 5 5
滅菌水 13.2 12.275 12.2 12.275 14.2 12.2
模板DNA 1 1 1 1 1 1
總體積 25 25 25 25 25 25
d. 擴增體系如下： [表5] 擴增體系
　 HOXA9 SHOX2 PCDHGA12 HOXD8 GATA3 β-actin 　  
步驟 溫度和時間 溫度和時間 溫度和時間 溫度和時間 溫度和時間 溫度和時間 循環數目  
預變性 95°C 5分鐘 95°C 5分鐘 95°C 5分鐘 95°C 5分鐘 95°C 5分鐘 95°C 5分鐘 1  
擴增1 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 10  
63°C 30秒 60°C 30秒 60°C 30秒 60°C 30秒 60°C 30秒 62°C 30秒
70°C 30秒 70°C 30秒 70°C 30秒 70°C 30秒 70°C 30秒 70°C 30秒
擴增2 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 95°C 20秒 45
60°C 30秒 55°C 60秒 55°C 60秒 55°C 60秒 55°C 60秒 54°C 60秒
72°C 30秒 72°C 30秒 72°C 30秒 72°C 30秒 72°C 30秒 72°C 30秒
冷卻 40°C 30秒 40°C 30秒 40°C 30秒 40°C 30秒 40°C 30秒 40°C 30秒 1
e. 檢測結果如下： [表6] 痰液中的檢測結果
分析組別 指標 HOXA9 SHOX2 PCDHGA12 HOXD8 GATA3
正常組和全部癌症組比較 特異性 95.0% 95.0% 95.0% 95.0% 95.0%
靈敏度 74.3% 51.4% 20.0% 42.9% 17.1%
正常組和全部鱗癌組比較 特異性 95.0% 95.0% 95.0% 95.0% 95.0%
靈敏度 75.0% 66.7% 25.0% 66.7% 25.0%
正常組和全部腺癌組比較 特異性 95.0% 95.0% 95.0% 95.0% 95.0%
靈敏度 55.6% 11.1% 33.3% 11.1% 0.0%
正常組和全部小細胞癌組比較 特異性 95.0% 95.0% 95.0% 95.0% 95.0%
靈敏度 100% 83.3% 0.0% 50.0% 33.3%
f. HOXA9、SHOX2、PCDHGA12、HOXD8、GATA3在痰液標本中檢測的ROC曲線見圖2，統計結果見表6，從以上結果可以看出，在痰液樣本中，同時檢測這5個基因進行比較，無論是將肺癌作為一個整體進行比較分析，還是按照肺癌的亞型進行比較分析，HOXA9的檢測效果都要優於其他4個基因的檢測效果。特別是對腺癌的檢測效果，HOXA9的檢出率遠高於其他基因。腺癌一般為周圍型，由於支氣管的樹狀生理結構，肺深部的脫落細胞更加難以通過痰液咳出，大部分腫瘤標記，在以痰液為檢測標本時，均會失效或者效能降低，如本公開中，在組織中對腺癌最有最高靈敏度的SHOX2，在痰液中，其靈敏度卻大幅降低到11.1%，因此對這部分的檢測更加困難和有意義。
實施例 3 ： HOXA9 與 SHOX2 基因在痰液中的檢測
大量文獻顯示SHOX2可用作檢測肺癌的標記，並且有專利顯示[CN201510203539-診斷人SHOX2基因和人RASSF1A基因甲基化的方法和試劑盒-申請公開]，SHOX2在肺泡灌洗液、病變部位組織、胸水、痰液等樣本中具有較高的檢出率。為了驗證HOXA9的檢測效果，在該實施例中，SHOX2基因的檢出效率採用專利CN201510203539中公開的引子和探針序列，並將SHOX2基因表述為SHOX2_n3，以區別於本公開實施例1和2中採用自行設計的引子和探針檢測的SHOX2基因。
各基因檢測引子探針如下：
HOXA9的檢測引子和探針為： SEQ ID NO: 1  HOXA9-F2 引子F：TTAGTTTTTTCGGTAGGCGGC SEQ ID NO: 2  HOXA9-R2 引子R：AAACGCCAAACACCGTCG SEQ ID NO: 3  HOXA9-P2 探針：FAM-ACGTTGGTCGAGTATTTCGATTTTAGTTC-BQ1
SHOX2_n3的檢測引子和探針為： SEQ ID NO: 19  SHOX2_n3 引子F：TTTGGATAGTTAGGTAATTTTCG SEQ ID NO: 20  SHOX2_n3 引子R：CGTACACGCCTATACTCGTACG SEQ ID NO: 21  SHOX2_n3.2 探針：FAM-CCCCGATCGAACAAACGAAAC-BQ1
a. 配液體系如下： [表7] 配液體系
HOXA9 SHOX2_n3 β-actin
反應組分 加入量(µl) 加入量(µl) 加入量(µl)
上游引子 (100 µM) 0.125 0.125 0.125
下游引子 (100 µM) 0.125 0.125 0.125
探針(100 µM) 0.05 0.05 0.05
鎂離子(25 mM) 4 5 5
dNTPs(10 mM) 1 1 1
Taq聚合酶(5 unit/µl) 0.5 0.5 0.5
5×緩衝液 5 5 5
滅菌水 13.2 12.2 12.2
模板DNA 1 1 1
總體積 25 25 25
b. 擴增體系如下： [表8] 擴增體系
  HOXA9 β-actin  
步驟 溫度和時間 溫度和時間 循環數目
預變性 95°C 5分鐘 95°C 5分鐘 1
擴增1 95°C 20秒 95°C 20秒 10
63°C 30秒 62°C 30秒
70°C 30秒 70°C 30秒
擴增2 95°C 20秒 95°C 20秒 45
60°C 30秒 54°C 60秒
72°C 30秒 72°C 30秒
冷卻 40°C 30秒 40°C 30秒 1
[表9] SHOX2_n3反應程序
步驟 溫度和時間 循環數目
預變性 95°C 5分鐘 1
擴增1 95°C 20秒 45
60°C 30秒
72°C 30秒
冷卻 40°C 30秒 1
c. 檢測結果如下：
利用標準曲線計算各基因在標本中的甲基化拷貝數，採用比值=靶向基因拷貝數/ACTB拷貝數*100來進行判斷兩組樣本的甲基化程度，最後選取HOXA9的閾值為2.3，SHOX2_n3的閾值為1.3，作為判斷癌症組和對照組的標準，換算後的比值超過設定閾值可判斷為陽性「+」，等於或小於設定閾值可判斷為陰性「-」。根據此標準，90例痰液標本的檢測結果如下： [表10] 檢測結果
    HOXA9 SHOX2_n3 HOXA9 SHOX2_n3
序號 樣本類型 甲基化率 甲基化率 檢出情況 檢出情況
1 非肺癌對照 0.1 0.2 − −
2 非肺癌對照 0.5 0.0 − −
3 非肺癌對照 0.5 0.0 − −
4 非肺癌對照 0.8 0.2 − −
5 非肺癌對照 0.5 0.1 − −
6 非肺癌對照 0.6 0.3 − −
7 非肺癌對照 1.6 0.2 − −
8 非肺癌對照 0.6 0.3 − −
9 非肺癌對照 0.3 0.0 − −
10 非肺癌對照 7.1 4.0 + +
11 非肺癌對照 0.9 0.4 − −
12 非肺癌對照 0.0 0.2 − −
13 非肺癌對照 0.3 0.0 − −
14 非肺癌對照 0.4 0.1 − −
15 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
16 非肺癌對照 0.3 0.3 − −
17 非肺癌對照 0.4 0.0 − −
18 非肺癌對照 0.4 0.0 − −
19 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
20 非肺癌對照 2.3 1.1 − −
21 非肺癌對照 1.3 0.4 − −
22 非肺癌對照 0.8 2.0 − +
23 非肺癌對照 0.3 0.1 − −
24 非肺癌對照 0.5 0.0 − −
25 非肺癌對照 1.2 0.5 − −
26 非肺癌對照 0.5 0.3 − −
27 非肺癌對照 0.2 0.0 − −
28 非肺癌對照 0.4 0.0 − −
29 非肺癌對照 0.3 0.0 − −
30 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
31 非肺癌對照 0.0 0.4 − −
32 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
33 非肺癌對照 0.3 0.5 − −
34 非肺癌對照 0.0 0.7 − −
35 非肺癌對照 0.2 0.3 − −
36 非肺癌對照 0.7 0.8 − −
37 非肺癌對照 0.0 0.1 − −
38 非肺癌對照 0.8 0.6 − −
39 非肺癌對照 0.2 0.3 − −
40 非肺癌對照 0.0 0.2 − −
41 非肺癌對照 3.7 1.7 + +
42 非肺癌對照 0.4 0.0 − −
43 非肺癌對照 0.6 0.6 − −
44 非肺癌對照 0.0 1.1 − −
45 非肺癌對照 0.0 0.2 − −
46 非肺癌對照 0.1 0.2 − −
47 非肺癌對照 0.0 0.2 − −
48 非肺癌對照 0.1 0.0 − −
49 非肺癌對照 0.1 0.4 − −
50 非肺癌對照 0.1 0.2 − −
51 非肺癌對照 0.0 0.4 − −
52 非肺癌對照 0.0 0.2 − −
53 非肺癌對照 0.5 0.6 − −
54 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
55 非肺癌對照 2.3 0.7 + −
56 鱗癌 4.9 3.5 + +
57 鱗癌 46.5 22.7 + +
58 鱗癌 27.4 8.3 + +
59 鱗癌 73.8 23.6 + +
60 鱗癌 2.2 9.5 − +
61 鱗癌 4.7 1.2 + −
62 鱗癌 7.2 7.1 + +
63 鱗癌 98.0 96.8 + +
64 鱗癌 2.1 0.9 − −
65 鱗癌 22.3 23.0 + +
66 鱗癌 66.7 94.2 + +
67 鱗癌 0.9 0.0 − −
68 腺癌 2.5 2.9 + +
69 腺癌 1.0 0.2 − −
70 腺癌 0.7 0.0 − −
71 腺癌 1.7 1.6 − +
72 腺癌 6.0 0.0 + −
73 腺癌 2.8 0.4 + −
74 腺癌 3.5 2.7 + +
75 腺癌 0.8 0.1 − −
76 腺癌 2.5 0.0 + −
77 小細胞癌 29.3 17.3 + +
78 小細胞癌 34.1 16.8 + +
79 小細胞癌 29.9 20.4 + +
80 小細胞癌 14.8 16.5 + +
81 小細胞癌 21.3 40.1 + +
82 小細胞癌 5.9 0.8 + −
83 大細胞癌 9.9 7.7 + +
84 大細胞癌 1.1 0.1 − −
85 低分化癌 0.3 0.5 − −
86 低分化癌 9.0 11.6 + +
87 肺癌 29.9 6.3 + +
88 肺癌 49.4 88.7 + +
89 肺癌 48.6 48.6 + +
90 肺癌 4.4 1.1 + −
d. 結果分析 [表11] 統計結果
分析組別 指標 HOXA9 SHOX2_n3
正常組和全部癌症組比較 特異性 95.0% 95.0%
靈敏度 74.3% 62.9%
正常組和全部鱗癌組比較 特異性 95.0% 95.0%
靈敏度 75.0% 75.0%
正常組和全部腺癌組比較 特異性 95.0% 95.0%
靈敏度 55.6% 33.3%
正常組和全部小細胞癌組比較 特異性 95.0% 95.0%
靈敏度 100% 83.3%
e. HOXA9與SHOX2_n3在所有痰液標本中檢測的ROC曲線見圖3， HOXA9與SHOX2_n3在痰液標本中的擴增曲線見圖4，統計結果見表11，從以上結果可以看出，在痰液樣本中，無論將肺癌作為一個整體進行比較分析，還是按照肺癌的亞型進行比較分析，HOXA9的檢測效果都要優於SHOX2基因的檢測效果。特別是對腺癌的檢測效果， HOXA9檢出率遠高於SHOX2基因33.3%。腺癌一般為周圍型，由於支氣管的樹狀生理結構，肺深部的脫落細胞更加難以通過痰液咳出。而本公開首次發現一種能以痰液作為樣本檢測腺癌，並可將靈敏度大幅提升至55.6%的標記，這一突破對腺癌的檢測具有重大意義。
實施例 4 ： HOXA9 以及 SHOX2 基因在灌洗液中的檢測
樣本信息：測試肺泡灌洗液樣本共計79例，其中正常對照組樣本58例，癌症組對照樣本21例，21例癌症組樣本中有鱗癌6例，小細胞癌4例，腺癌11例。
試驗過程：
a. 收集確診為肺癌患者和非肺癌患者的肺泡灌洗液標本，離心分離細胞，然後使用美基生物公司（Magen）的DNA提取試劑盒（HiPure FFPE DNA Kit，D3126-03）提取DNA。
b. 使用ZYMO RESEARCH生物公司的DNA轉化試劑盒（EZ DNA Methylation Kit，D5002）進行DNA的重亞硫酸氫鹽修飾。
c. 擴增檢測體系如下： [表12] 擴增體系
HOXA9 SHOX2_n3 β-actin
反應組分 加入量(µl) 加入量(µl) 加入量(µl)
上游引子 (100 µM) 0.125 0.125 0.125
下游引子 (100 µM) 0.125 0.125 0.125
探針(100 µM) 0.05 0.05 0.05
鎂離子(25 mM) 4 5 5
dNTPs(10 mM) 1 1 1
Taq聚合酶(5 unit/µl) 0.5 0.5 0.5
5×緩衝液 5 5 5
滅菌水 13.2 12.2 12.2
模板DNA 1 1 1
總體積 25 25 25
d. 檢測體系如下： [表13] HOXA9和β-actin的反應程序
  HOXA9 β-actin  
步驟 溫度和時間 溫度和時間 循環數目
預變性 95°C 5分鐘 95°C 5分鐘 1
擴增1 95°C 20秒 95°C 20秒 10
63°C 30秒 62°C 30秒
70°C 30秒 70°C 30秒
擴增2 95°C 20秒 95°C 20秒 45
60°C 30秒 54°C 60秒
72°C 30秒 72°C 30秒
冷卻 40°C 30秒 40°C 30秒 1
[表14] SHOX2_n3反應程序
步驟 溫度和時間 循環數目
預變性 95°C 5分鐘 1
擴增1 95°C 20秒 45
60°C 30秒
72°C 30秒
冷卻 40°C 30秒 1
e. 檢測結果如下：
利用標準曲線計算各基因在標本中的甲基化拷貝數，採用比值=靶向基因拷貝數/ACTB拷貝數*100來進行判斷兩組樣本的甲基化程度，最後選取HOXA9的閾值為0.5，SHOX2_n3的閾值為0.6，作為判斷癌症組和對照組的標準，換算後的比值超過設定閾值可判斷為陽性「+」，等於或小於設定閾值可判斷為陰性「−」。根據此標準，79例灌洗液標本的檢測結果如下： [表15] 檢測結果
    HOXA9 SHOX2_n3 HOXA9 SHOX2_n3
序號 組織類型 甲基化率 甲基化率 檢出情況 檢出情況
1 非肺癌對照 0.2 0.3 − −
2 非肺癌對照 0.1 0.7 − +
3 非肺癌對照 0.2 0.1 − −
4 非肺癌對照 0.5 0.6 − −
5 非肺癌對照 0.1 0.2 − −
6 非肺癌對照 0.2 0.1 − −
7 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
8 非肺癌對照 0.1 0.0 − −
9 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
10 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
11 非肺癌對照 0.0 0.1 − −
12 非肺癌對照 0.0 0.1 − −
13 非肺癌對照 0.0 0.1 − −
14 非肺癌對照 0.3 0.1 − −
15 非肺癌對照 0.3 0.5 − −
16 非肺癌對照 0.1 0.1 − −
17 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
18 非肺癌對照 0.4 0.2 − −
19 非肺癌對照 0.1 0.2 − −
20 非肺癌對照 0.0 0.3 − −
21 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
22 非肺癌對照 0.0 0.2 − −
23 非肺癌對照 0.0 0.1 − −
24 非肺癌對照 0.0 0.1 − −
25 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
26 非肺癌對照 0.1 0.2 − −
27 非肺癌對照 0.1 0.1 − −
28 非肺癌對照 0.1 0.3 − −
29 非肺癌對照 0.1 0.1 − −
30 非肺癌對照 0.5 0.5 − −
31 非肺癌對照 0.0 0.2 − −
32 非肺癌對照 0.0 0.4 − −
33 非肺癌對照 0.1 0.1 − −
34 非肺癌對照 0.5 0.5 − −
35 非肺癌對照 0.1 0.2 − −
36 非肺癌對照 0.8 0.8 + +
37 非肺癌對照 0.1 0.4 − −
38 非肺癌對照 0.1 0.1 − −
39 非肺癌對照 0.2 0.2 − −
40 非肺癌對照 0.3 0.3 − −
41 非肺癌對照 0.4 0.3 − −
42 非肺癌對照 0.1 0.1 − −
43 非肺癌對照 0.8 0.6 + +
44 非肺癌對照 0.0 0.1 − −
45 非肺癌對照 0.2 0.2 − −
46 非肺癌對照 0.0 0.1 − −
47 非肺癌對照 0.1 0.1 − −
48 非肺癌對照 0.3 0.2 − −
49 非肺癌對照 0.1 0.4 − −
50 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
51 非肺癌對照 0.2 0.0 − −
52 非肺癌對照 0.5 0.5 − −
53 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
54 非肺癌對照 1.1 0.1 + −
55 非肺癌對照 0.4 0.0 − −
56 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
57 非肺癌對照 0.2 0.0 − −
58 非肺癌對照 0.0 0.0 − −
59 鱗癌 0.5 0.3 − −
60 鱗癌 76.9 321.9 + +
61 鱗癌 60.9 56.7 + +
62 鱗癌 0.3 0.0 − −
63 鱗癌 17.7 7.6 + +
64 鱗癌 1.5 0.6 + +
65 腺癌 0.5 0.6 − −
66 腺癌 0.3 0.0 − −
67 腺癌 0.3 0.4 − −
68 腺癌 3.7 33.5 + +
69 腺癌 2.9 2.3 + +
70 腺癌 0.1 0.0 − −
71 腺癌 0.3 0.3 − −
72 腺癌 0.0 1.4 + +
73 腺癌 20.8 8.6 + +
74 腺癌 5.3 0.3 + −
75 腺癌 0.9 0.2 + −
76 小細胞癌 0.8 0.3 + −
77 小細胞癌 26.4 97.7 + +
78 小細胞癌 1.8 7.6 + +
79 小細胞癌 0.6 2.4 + +
[表16] 分析結果
分析組別 指標 HOXA9 SHOX2_n3
正常組和全部癌症組比較 特異性 95.0% 95.0%
靈敏度 61.9% 52.4%
正常組和全部鱗癌組比較 特異性 95.0% 95.0%
靈敏度 66.7% 66.7%
正常組和全部腺癌組比較 特異性 95.0% 95.0%
靈敏度 45.5% 36.4%
正常組和全部小細胞癌組比較 特異性 95.0% 95.0%
靈敏度 100% 75.0%
f. HOXA9與SHOX2_n3在所有灌洗液標本中檢測的ROC曲線見圖5，擴增曲線見圖6，統計結果見表16。從以上結果可以看出，在灌洗液標本中，同時檢測HOXA9和SHOX2，將肺癌作為一個整體進行比較分析，HOXA9的檢出率為61.9%，高於SHOX2的52.4%，按照肺癌的亞型進行比較分析，HOXA9在腺癌和小細胞癌的檢出率要高於SHOX2_n3，由於腺癌一般為周圍型，由於支氣管的樹狀生理結構，肺泡灌洗液不容易接觸到肺深部的肺泡或者癌組織，因此對這部分的檢測更加困難和有意義。此外，對於小細胞癌，HOXA9的靈敏度高達100%，顯著高於SHOX2的75.0%。
綜合上述的4個實施例，能夠充分的說明HOXA9在對肺癌檢測診斷，尤其是應用痰液，肺泡灌洗液等生物樣本上具有更好的檢測效果。能夠更加容易的應用于大規模的人群篩查。具有更加優越的社會經濟學價值。
實施例 5 ： HOXA9 的檢測區域、引子、探針對檢測效果的影響
一、檢測區域對檢測效果的影響
各種研究資料表明，同一個基因的甲基化狀態和分佈並不均勻，因此對於同一個基因來說，選擇不同的區域設計的甲基化引子、探針檢測體系對同一樣本，同一腫瘤的診斷檢測效能並不一樣，甚至有時候選擇的區域不合適造成對腫瘤完全沒有診斷效果，本發明人對多個檢測區域經過反復的研究和比較，部分示範性的檢測區域如下表17。 [表17] 待檢測序列
序列名稱 序列
SEQ ID NO: 22 HOXA9 區域 1 參考序列 AATTTCCGTGGGTCGGGCCGGGCGGGCCAGGCGCTGGGCACGGTGATGGCCACCACTGGGGCCCTGGGCAACTACTACGTGGACTCGTTCCTGCTGGGCGCCGACGCCGCGGATGAGCTGAGCGTTGGCCGCTATGCGCCGGGGACCCTGGGCCAGCCTCCCCGGCAGGCGGCGACGCTGGCCGAGCACCCCGACTTCAGCCCGTGCAGCTTCCAGTCCAAGGCGACGGTGTTTGGCGCCTCGTGGAACCCAGTGCACGCGGCGGGCGCCAACGCTGTACCCGCTGCGGTGTACCACCACCATCACCACCACCCCTACGTGCACCCCCAGGCGCCCGTGGCGGCG
SEQ ID NO: 23 HOXA9 區域 1 序列經重亞硫酸氫鹽處理過後轉化的序列 AATTTTCGTGGGTCGGGTCGGGCGGGTTAGGCGTTGGGTACGGTGATGGTTATTATTGGGGTTTTGGGTAATTATTACGTGGATTCGTTTTTGTTGGGCGTCGACGTCGCGGATGAGTTGAGCGTTGGTCGTTATGCGTCGGGGATTTTGGGTTAGTTTTTTCGGTAGGCGGCGACGTTGGTCGAGTATTTCGATTTTAGTTCGTGTAGTTTTTAGTTTAAGGCGACGGTGTTTGGCGTTTCGTGGAATTTAGTGTACGCGGCGGGCGTTAACGTTGTATTCGTTGCGGTGTATTATTATTATTATTATTATTTTTACGTGTATTTTTAGGCGTTCGTGGCGGCG
SEQ ID NO: 24 HOXA9 區域 2 參考序列 GACAGGACGGGGCCATTTCGGAGTTCATTGTGTCGGCCACTTCCCTCTTCCAGGCGCGGGTGCAGGAAGGGGCACCCAGTCGGTATCCGCGCGGCTTGGCAGCCTCGCTGGTATTTGGGAGTCCCAGCCGGAAGTGTGTCAGGGTGTTTGAGGGGGGGATTACTGGAACTGCTGGTGAGGATGAAGGCAAAAGAGAGAGAGAGAGATGGAAGCGCCCGAGGCCGCCAGCCTCGCCGCCAGGGAAGTGGGCTAATGAAAAACACACTGTTGCAGGCACAGTATCCACACGTGAATTTGATTACCCCTGTTCTAGGAGTCGCTGCTTTCTGTTAGGAATTGGGGGCAGGGGGAGTTTCCTTCCAATTAACGGAGTGGCGGCGACCTTTTAATTTACCCCCAACGGGTGAGAAATAAACTTCCCCAACGTGGCCAGGCCCAGGAATGGGACTGGAGTCGATGCCCTTTTACCCCTCCCCGTTCTAATTTCCAGCCCTGGCCTTGAGCTGTGGCTGCCTCTCTTTGGGCCTTGTACCTCTCCGCCGAGTCTCCGGGCCCCGTAGGTAACCAAGGCGAGGCCCGGAGTAGCAGCTGGAAAGGGAGGAAGGAGCCCTGAAAGGCTCACGCGGCCCCGGGACAGGCCACATCGGTGCGGGCCTCCCAGGTTCCGGAGCTGCGGGGTCTCTTAGGCGAGGCTGCCTTTTCCCAAACCGAACTTGCCTTCCATTCATGCCACTTGTAGTTTTTTCCCCAGCTGGGATTCACGGAGCGCAACCAGGCTTGCAGCGCTCATGGTTAGAGCCTCTGAGGCTGGAGCACAGGGCTGGGTCGCCAGCCGCCTGCGCCTGGGAATCCTGATTGCCAGCTGATGAGAAAGGCGGGCTGGGCGCGCGTGTGCGTGGGGTCGAGGGCCGGGGACCGAGCGCGCCGCACAACCAACCAGGCCCTCAAAACCTTCGCCCTGGTGGCGGCTGGCCGCTCCCTCCTGGCCAGCTCCTCCGTGGGGTCCTCGTAGCAAAGGCGAATTTAAGGGTTGCCCGGGCGCCCCTCGCTCCAGGCGGGTAGCTGTGGGGACCTACACCCGCGGTACTCCCTGAGCGGCCGGTCCCTGCCTGGAGTGCCCTGGTAGGGCCGGCGGCGGCTCCGTTTGGGACGGATCCTGCGTTGAATTTGACTTTTCGAGGGCGGCCGCGGGTAAACTCGCCTCTCCCGGGGACCGCAGGGATTATTTACAGGGAGCTCGCCAACCAAACACAACAGTCTAACCTTTCCAAGTCCTCGTAAATTTTTACAGCTGGGAGCCACGGCGAGGCAAACGAATCTGTTGGTCGTTTCCGACTTCCCGCCAGCCTGTGTGGCTTCTGAAACAATAACTCCTTATGAAATATCATAAATATAGATTTAAATACAGTAGAGCGACAATGCGATTTGGCTGCTTTTTTATGGCTTCAATTATTGTCTAATTTTATGTGAGGGGCTCCGCTGGCCGCACTCGCACGCGGGACCCGCGCCTTCTTGATGGCGTGATTAATTGTGATATAAAATAGTCCGCTTAAGAAGTGTGTGTATGGGGGGGGAGACGGGAGAGTACAGAGACAAGGCTAGATTTGATCTTTTAATCGTCGTTGGCCACAATTAAAACAAACCCCATCGTAGAGCGGCACGATCCCTTTACATAAAAACATATGGCTTTTGCTATAAAAATTATGACTGCAAAACATCGGACCATTAATAGCGTGCGGAGTGATTTACGCGTTATTGTTCTGCTGGACGGGCACGTGACGCGCACGGCCAATGGGGGCGCGGGCGCCGGCAACTTATTAGGTGACTGTACTTCCCCCCCGGTGCCACCAAGTTGTTACATGAAATCTGCAGTTTCATAATTTCCGTGGGTCGGGCCG
SEQ ID NO: 25 HOXA9 區域 2 參考序列經重亞硫酸鹽處理過後轉化的序列 GATAGGACGGGGTTATTTCGGAGTTTATTGTGTCGGTTATTTTTTTTTTTTAGGCGCGGGTGTAGGAAGGGGTATTTAGTCGGTATTCGCGCGGTTTGGTAGTTTCGTTGGTATTTGGGAGTTTTAGTCGGAAGTGTGTTAGGGTGTTTGAGGGGGGGATTATTGGAATTGTTGGTGAGGATGAAGGTAAAAGAGAGAGAGAGAGATGGAAGCGTTCGAGGTCGTTAGTTTCGTCGTTAGGGAAGTGGGTTAATGAAAAATATATTGTTGTAGGTATAGTATTTATACGTGAATTTGATTATTTTTGTTTTAGGAGTCGTTGTTTTTTGTTAGGAATTGGGGGTAGGGGGAGTTTTTTTTTAATTAACGGAGTGGCGGCGATTTTTTAATTTATTTTTAACGGGTGAGAAATAAATTTTTTTAACGTGGTTAGGTTTAGGAATGGGATTGGAGTCGATGTTTTTTTATTTTTTTTCGTTTTAATTTTTAGTTTTGGTTTTGAGTTGTGGTTGTTTTTTTTTGGGTTTTGTATTTTTTCGTCGAGTTTTCGGGTTTCGTAGGTAATTAAGGCGAGGTTCGGAGTAGTAGTTGGAAAGGGAGGAAGGAGTTTTGAAAGGTTTACGCGGTTTCGGGATAGGTTATATCGGTGCGGGTTTTTTAGGTTTCGGAGTTGCGGGGTTTTTTAGGCGAGGTTGTTTTTTTTTAAATCGAATTTGTTTTTTATTTATGTTATTTGTAGTTTTTTTTTTAGTTGGGATTTACGGAGCGTAATTAGGTTTGTAGCGTTTATGGTTAGAGTTTTTGAGGTTGGAGTATAGGGTTGGGTCGTTAGTCGTTTGCGTTTGGGAATTTTGATTGTTAGTTGATGAGAAAGGCGGGTTGGGCGCGCGTGTGCGTGGGGTCGAGGGTCGGGGATCGAGCGCGTCGTATAATTAATTAGGTTTTTAAAATTTTCGTTTTGGTGGCGGTTGGTCGTTTTTTTTTGGTTAGTTTTTTCGTGGGGTTTTCGTAGTAAAGGCGAATTTAAGGGTTGTTCGGGCGTTTTTCGTTTTAGGCGGGTAGTTGTGGGGATTTATATTCGCGGTATTTTTTGAGCGGTCGGTTTTTGTTTGGAGTGTTTTGGTAGGGTCGGCGGCGGTTTCGTTTGGGACGGATTTTGCGTTGAATTTGATTTTTCGAGGGCGGTCGCGGGTAAATTCGTTTTTTTCGGGGATCGTAGGGATTATTTATAGGGAGTTCGTTAATTAAATATAATAGTTTAATTTTTTTAAGTTTTCGTAAATTTTTATAGTTGGGAGTTACGGCGAGGTAAACGAATTTGTTGGTCGTTTTCGATTTTTCGTTAGTTTGTGTGGTTTTTGAAATAATAATTTTTTATGAAATATTATAAATATAGATTTAAATATAGTAGAGCGATAATGCGATTTGGTTGTTTTTTTATGGTTTTAATTATTGTTTAATTTTATGTGAGGGGTTTCGTTGGTCGTATTCGTACGCGGGATTCGCGTTTTTTTGATGGCGTGATTAATTGTGATATAAAATAGTTCGTTTAAGAAGTGTGTGTATGGGGGGGGAGACGGGAGAGTATAGAGATAAGGTTAGATTTGATTTTTTAATCGTCGTTGGTTATAATTAAAATAAATTTTATCGTAGAGCGGTACGATTTTTTTATATAAAAATATATGGTTTTTGTTATAAAAATTATGATTGTAAAATATCGGATTATTAATAGCGTGCGGAGTGATTTACGCGTTATTGTTTTGTTGGACGGGTACGTGACGCGTACGGTTAATGGGGGCGCGGGCGTCGGTAATTTATTAGGTGATTGTATTTTTTTTTCGGTGTTATTAAGTTGTTATATGAAATTTGTAGTTTTATAATTTTCGTGGGTCGGGTCG
SEQ ID NO: 26 HOXA9 區域 3 參考序列 CCCAGGCGCCCGTGGCGGCGGCGGCGCCGGACGGCAGGTACATGCGCTCCTGGCTGGAGCCCACGCCCGGTGCGCTCTCCTTCGCGGGCTTGCCCTCCAGCCGGCCTTATGGCATTAAACCTGAACCGCTGTCGGCCAGAAGGGGTGACTGTCCCACGCTTGACACTCACACTTTGTCCCTGACTGACTATGCTTGTGGTTCTCCTCCAGTTGATAGAGAAAAACAACCCAGCGAAGGCGCCTTCTCTGAAAACAATGCTGAGAATGAGAGCGGCGGAGACAAGCCCCCCATCGATCCCAGTAAGTGTCTCCTCCCTTCAAATCCGCCGCCGCCTCCACGCCGGCCTCCCGGATCTGCTGGCCCGCCAGGTTTCTCTCGAGCCTGCCTTCGTCCTCGCTGGAAGCCTCTCGAGTTGGGGCCAGGAGCCAGAAGTTGGTGTTTGGGACGCCTCAGATAGGGCCCCAAGTCTGGAGAGCAGTGAAGAGCGGCCCGCAGGGCTACGGGAGAGGAGGCGGCTGCTGCAGCGAGAGGGGGCGGGGCGGGCACTTCGGGACGAGCCAAGACTGGCCGCCCCTCTCCTTGGCTGCCCAGGCCCAGGACCGAGATACTTTGGGCCGTTCTTCGAAAGCAGTGCAGCCCAGAGAGCCTTTTGTACAACTAGATTGTCCGTGAGCGGCGGCAGCCAGGGCAGCCGGAGCTGGGACGCTGGGGGAGACGGCCGATTCCTTCCACTTCTTGCCTTCGGCCAGTGGCGGCGTAAATCCTGCCAAGATGAGGCTGCGGGCGACCCGGGCCACAAGGGTCCCCATGACAGATTATTCAAATAAGCCACAGACGTGATCAGCGGCCTTAGGGCGCCCTGACGGCTTGCCCAGCTCCGAAGGCCTTCCAGGAAGGTTAAATAAGGAGTGGGGGGCGTAGAGGGACAGGTTGGGAAAGAAAGACG
SEQ ID NO: 27 HOXA9 區域 3 參考序列經重亞硫酸鹽處理過後轉化的序列 TTTAGGCGTTCGTGGCGGCGGCGGCGTCGGACGGTAGGTATATGCGTTTTTGGTTGGAGTTTACGTTCGGTGCGTTTTTTTTCGCGGGTTTGTTTTTTAGTCGGTTTTATGGTATTAAATTTGAATCGTTGTCGGTTAGAAGGGGTGATTGTTTTACGTTTGATATTTATATTTTGTTTTTGATTGATTATGTTTGTGGTTTTTTTTTAGTTGATAGAGAAAAATAATTTAGCGAAGGCGTTTTTTTTGAAAATAATGTTGAGAATGAGAGCGGCGGAGATAAGTTTTTTATCGATTTTAGTAAGTGTTTTTTTTTTTTAAATTCGTCGTCGTTTTTACGTCGGTTTTTCGGATTTGTTGGTTCGTTAGGTTTTTTTCGAGTTTGTTTTCGTTTTCGTTGGAAGTTTTTCGAGTTGGGGTTAGGAGTTAGAAGTTGGTGTTTGGGACGTTTTAGATAGGGTTTTAAGTTTGGAGAGTAGTGAAGAGCGGTTCGTAGGGTTACGGGAGAGGAGGCGGTTGTTGTAGCGAGAGGGGGCGGGGCGGGTATTTCGGGACGAGTTAAGATTGGTCGTTTTTTTTTTTGGTTGTTTAGGTTTAGGATCGAGATATTTTGGGTCGTTTTTCGAAAGTAGTGTAGTTTAGAGAGTTTTTTGTATAATTAGATTGTTCGTGAGCGGCGGTAGTTAGGGTAGTCGGAGTTGGGACGTTGGGGGAGACGGTCGATTTTTTTTATTTTTTGTTTTCGGTTAGTGGCGGCGTAAATTTTGTTAAGATGAGGTTGCGGGCGATTCGGGTTATAAGGGTTTTTATGATAGATTATTTAAATAAGTTATAGACGTGATTAGCGGTTTTAGGGCGTTTTGACGGTTTGTTTAGTTTCGAAGGTTTTTTAGGAAGGTTAAATAAGGAGTGGGGGGCGTAGAGGGATAGGTTGGGAAAGAAAGACG
SEQ ID NO: 28 β-actin 區域參考序列 AGCCCGGGGCGGGGTGGGGCTGGAGCTCCTGTCTCTTGGCCAGCTGAATGGAGGCCCAGTGGCAACACAGGTCCTGCCTGGGGATCAGGTCTGCTCTGCACCCCACCTTGCTGCCTGGAGCCGCCCACCTGACAACCTCTCATCCCTGCTCTGCAGATCCGGTCCCATCCCCACTGCCCACCCCACCCCCCCAGCACTCCACCCAGTTCAACGTTCCACGAACCCCCAGAACCAGCCCTCATCAACAGGCAGCAAGAAGGGCCCCCCGCCCATCGCCCCACAACGCCAGCCGGGTGAACGTTGGCAGGTCCTGAGGCAGCTGGCAAGACGCCTGCAGCTGAAAGATACAAGGCCAGGGACAGGACAGTCCCATCCCCAGGAGGCAGGGAGTATACAGGCTGGGGAAGTTTGCCCTTGCGTGGGGTGGTGATGGAGGAGGCTCAGCAAGTCTTCTGGACTGTGAACCTGTGTCTGCCACTGTGTGCTGGGTGGTGGTCATCTTTCCCACCAGGCTGTGGCCTCTGCAACCTTCAAGGGAGGAGCAGGTCCCATTGGCTGAGCACAGCCTTGTACCGTGAACTGGAACAAGCAGCCTCCTTCCTGGCCACAGGTTCCATGTCCTTATATGGACTCATCTTTGCCTATTGCGACACACACTCAGTGAACACCTACTACGCGCTGCAAAGAGCCCCGCAGGCCTGAGGTGCCCCCACCTCACCACTCTTCCTATTTTTGTGTAAAAATCCAGCTTCTTGTCACCACCTCCAAGGAGGGGGAGGAGGAGGAAGGCAGGTTCCTCTAGGCTGAGCCGAATGCCCCTCTGTGGTCCCACGCCACTGATCGCTGCATGCCCACCACCTGGGTACACACAGTCTGTGATTCCCGGAGCAGAACGGACCCTGCCCACCCGGTCTTGTGTGCTACTCAGTGGACAGACCCAAGGCAAGAAAGGGTGACAAGGACAGGGTCTTC
SEQ ID NO: 29 β-actin 序列經重亞硫酸氫鹽處理過後轉化的序列 AGTTCGGGGCGGGGTGGGGTTGGAGTTTTTGTTTTTTGGTTAGTTGAATGGAGGTTTAGTGGTAATATAGGTTTTGTTTGGGGATTAGGTTTGTTTTGTATTTTATTTTGTTGTTTGGAGTCGTTTATTTGATAATTTTTTATTTTTGTTTTGTAGATTCGGTTTTATTTTTATTGTTTATTTTATTTTTTTAGTATTTTATTTAGTTTAACGTTTTACGAATTTTTAGAATTAGTTTTTATTAATAGGTAGTAAGAAGGGTTTTTCGTTTATCGTTTTATAACGTTAGTCGGGTGAACGTTGGTAGGTTTTGAGGTAGTTGGTAAGACGTTTGTAGTTGAAAGATATAAGGTTAGGGATAGGATAGTTTTATTTTTAGGAGGTAGGGAGTATATAGGTTGGGGAAGTTTGTTTTTGCGTGGGGTGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTGAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGTGGTGGTTATTTTTTTTATTAGGTTGTGGTTTTTGTAATTTTTAAGGGAGGAGTAGGTTTTATTGGTTGAGTATAGTTTTGTATCGTGAATTGGAATAAGTAGTTTTTTTTTTGGTTATAGGTTTTATGTTTTTATATGGATTTATTTTTGTTTATTGCGATATATATTTAGTGAATATTTATTACGCGTTGTAAAGAGTTTCGTAGGTTTGAGGTGTTTTTATTTTATTATTTTTTTTATTTTTGTGTAAAAATTTAGTTTTTTGTTATTATTTTTAAGGAGGGGGAGGAGGAGGAAGGTAGGTTTTTTTAGGTTGAGTCGAATGTTTTTTTGTGGTTTTACGTTATTGATCGTTGTATGTTTATTATTTGGGTATATATAGTTTGTGATTTTCGGAGTAGAACGGATTTTGTTTATTCGGTTTTGTGTGTTATTTAGTGGATAGATTTAAGGTAAGAAAGGGTGATAAGGATAGGGTTTTT
我們根據序列區域1、區域2和區域3設計不同的甲基化引子和探針，各引子探針信息見表18，其中組1、組2、組3、組4和組5是根據區域1設計的甲基化引子和探針；組6、組7、組8是根據區域2設計的甲基化引子和探針；組9、組10、組11是根據區域3設計的甲基化引子和探針（引子和探針的序列見表20）。
在36例肺組織樣本檢測以上11組引子探針組合，其中正常組織樣本11例，癌組織樣本25例，25例癌症組樣本中有鱗癌4例，腺癌21例。檢測結果如下表。 [表18] 在組織中的檢測結果
所處區域 組別 引子探針組合 特異性 靈敏性
區域1 組1 H9-F2, H9-R2, H9-P2 100% 76%
區域1 組2 H9-F3, H9-R3, H9-P3 100% 76%
區域1 組3 H9-F4, H9-R4, H9-P4 100% 40%
區域1 組4 H9-F5, H9-R5, H9-P5 100% 60%
區域1 組5 H9-F6, H9-R6, H9-P6 100% 68%
區域2 組6 H9-F7, H9-R7, H9-P7 100% 32%
區域2 組7 H9-F8, H9-R8, H9-P8 100% 20%
區域2 組8 H9-F9, H9-R9, H9-P9 100% 12%
區域3 組9 H9-F10, H9-R10, H9-P10 100% 16%
區域3 組10 H9-F11, H9-R11, H9-P11 100% 24%
區域3 組11 H9-F12, H9-R12, H9-P12 100% 24%
結果顯示，無論區域2和3如何設計引子和探針，針對這兩個區域的檢測靈敏度最高僅能達到32%，而無論採用本公開設計的何種引子和探針，區域1的檢測靈敏度最低也可達到40%，最高達到76%。因此，區域1的檢出率明顯較區域2和3高（見表18）。
根據各組引子探針的檢測結果，優選的檢測序列如下表19。 [表19] 優化後的檢測序列
序列名稱 序列
SEQ ID NO: 22 HOXA9 區域 1 參考序列 AATTTCCGTGGGTCGGGCCGGGCGGGCCAGGCGCTGGGCACGGTGATGGCCACCACTGGGGCCCTGGGCAACTACTACGTGGACTCGTTCCTGCTGGGCGCCGACGCCGCGGATGAGCTGAGCGTTGGCCGCTATGCGCCGGGGACCCTGGGCCAGCCTCCCCGGCAGGCGGCGACGCTGGCCGAGCACCCCGACTTCAGCCCGTGCAGCTTCCAGTCCAAGGCGACGGTGTTTGGCGCCTCGTGGAACCCAGTGCACGCGGCGGGCGCCAACGCTGTACCCGCTGCGGTGTACCACCACCATCACCACCACCCCTACGTGCACCCCCAGGCGCCCGTGGCGGCG
SEQ ID NO: 23 HOXA9 區域 1 序列經重亞硫酸氫鹽處理過後轉化的序列 AATTTTCGTGGGTCGGGTCGGGCGGGTTAGGCGTTGGGTACGGTGATGGTTATTATTGGGGTTTTGGGTAATTATTACGTGGATTCGTTTTTGTTGGGCGTCGACGTCGCGGATGAGTTGAGCGTTGGTCGTTATGCGTCGGGGATTTTGGGTTAGTTTTTTCGGTAGGCGGCGACGTTGGTCGAGTATTTCGATTTTAGTTCGTGTAGTTTTTAGTTTAAGGCGACGGTGTTTGGCGTTTCGTGGAATTTAGTGTACGCGGCGGGCGTTAACGTTGTATTCGTTGCGGTGTATTATTATTATTATTATTATTTTTACGTGTATTTTTAGGCGTTCGTGGCGGCG
二、引子和探針對檢測效果的影響
除了檢測區域會影響檢測效果，引子和探針也對腫瘤標記的檢測效果有極大的影響，發明人在研究過程中，設計了多對引子及其對應的探針，以尋找到盡可能提高檢測靈敏度和特異性的探針和引子，以使本公開的檢測試劑能夠實際應用到臨床檢測中。部分引子和檢測探針如下表20所示，檢測結果如表21所示。所有的引子和探針均由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。 [表20] 引子和探針
名稱 序列編號 序列 作用
H9-F2 SEQ ID NO: 1 TTAGTTTTTTCGGTAGGCGGC HOXA9基因上游引子
H9-R2 SEQ ID NO: 2 AAACGCCAAACACCGTCG HOXA9基因下游引子
H9-P2 SEQ ID NO: 3 FAM-ACGTTGGTCGAGTATTTCGATTTTAGTTC-BQ1 HOXA9基因檢測探針
H9-F3 SEQ ID NO: 30 AATTTTCG TGGGTCG GGTC HOXA9基因上游引子
H9-R3 SEQ ID NO: 31 CCAAACACCGTCGCCTTAA HOXA9基因下游引子
H9-P3 SEQ ID NO: 32 FAM-ACGTGGATTCGTTTTTGTTGGGC-BQ1 HOXA9基因檢測探針
H9-F4 SEQ ID NO: 33 CGTCGCGGATGAGTTGAGC HOXA9基因上游引子
H9-R4 SEQ ID NO: 34 CACGAACGCCTAAAAATACACG HOXA9基因下游引子
H9-P4 SEQ ID NO: 35 FAM-TGGTCGTTATGCGTCGGGGATT-BQ1 HOXA9基因檢測探針
H9-F5 SEQ ID NO: 36 AGCGTTGGTCGTTATGCGTC HOXA9基因上游引子
H9-R5 SEQ ID NO: 37 CCAAACACCGTCGCCTTAAAC HOXA9基因下游引子
H9-P5 SEQ ID NO: 38 FAM-GACGTTGGTCGAGTATTTCGATTTTAG-BQ1 HOXA9基因檢測探針
H9-F6 SEQ ID NO: 39 CGACGTTGGTCGAGTATTTC HOXA9基因上游引子
H9-R6 SEQ ID NO: 40 GCCACGAACGCCTAAAAAT HOXA9基因下游引子
H9-P6 SEQ ID NO: 41 FAM-TTAGTTTAAGGCGACGGTGTTTGG-BQ1 HOXA9基因檢測探針
H9-F7 SEQ ID NO: 42 CGTTTTGGTGGCGGTTGGTC HOXA9基因上游引子
H9-R7 SEQ ID NO: 43 AATAATCCCTACGATCCCCGA HOXA9基因下游引子
H9-P7 SEQ ID NO: 44 FAM-GGGCGTTTTTCGTTTTAGGCGG-BQ1 HOXA9基因檢測探針
H9-F8 SEQ ID NO: 45 TCGTTTGGGACGGATTTTGC HOXA9基因上游引子
H9-R8 SEQ ID NO: 46 ACAAATTCGTTTACCTCGCCG HOXA9基因下游引子
H9-P8 SEQ ID NO: 47 FAM-ATTCGTTTTTTTCGGGGATCGTAGG-BQ1 HOXA9基因檢測探針
H9-F9 SEQ ID NO: 48 AATAGCG TGCG GAGTGATTTAC HOXA9基因上游引子
H9-R9 SEQ ID NO: 49 CGACCCGACCCACGAAAAT HOXA9基因下游引子
H9-P9 SEQ ID NO: 50 FAM-CGTTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG-BQ1 HOXA9基因檢測探針
H9-F10 SEQ ID NO: 51 TTTAGGCGTTCGTGGCGGC HOXA9基因上游引子
H9-R10 SEQ ID NO: 52 CCCTTCTAACCGACAACGATTC HOXA9基因下游引子
H9-P10 SEQ ID NO: 53 FAM-CGGACGGTAGGTATATGCGTTTTTGG-BQ1 HOXA9基因檢測探針
H9-F11 SEQ ID NO: 54 AATTCGTCGTCGTTTTTACGTC HOXA9基因上游引子
H9-R11 SEQ ID NO: 55 TCCCGTAACCCTACGAACCG HOXA9基因下游引子
H9-P11 SEQ ID NO: 56 FAM-TCGGATTTGTTGGTTCGTTAGGTTTTTTTC-BQ1 HOXA9基因檢測探針
H9-F12 SEQ ID NO: 57 TTAGATTGTTCGTGAGCGGC HOXA9基因上游引子
H9-R12 SEQ ID NO: 58 TTATAACCCGAATCGCCCG HOXA9基因下游引子
H9-P12 SEQ ID NO: 59 FAM-TTGGGACGTTGGGGGAGACGGT-BQ1 HOXA9基因檢測探針
A3-TqMF SEQ ID NO: 16 TTTTGGATTGTGAATTTGTG β-actin基因上游引子
A3-TqMR SEQ ID NO: 17 AAAACCTACTCCTCCCTTAAA β-actin基因下游引子
A3-TqP SEQ ID NO: 18 FAM-TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT-BQ1 β-actin基因檢測探針
[表21] 在組織中的檢測結果
組別 引子探針組合 特異性 靈敏性
組1 H9-F2, H9-R2, H9-P2 100% 76%
組2 H9-F3, H9-R3, H9-P3 100% 76%
組3 H9-F4, H9-R4, H9-P4 100% 40%
組4 H9-F5, H9-R5, H9-P5 100% 60%
組5 H9-F6, H9-R6, H9-P6 100% 68%
組6 H9-F7, H9-R7, H9-P7 100% 32%
組7 H9-F8, H9-R8, H9-P8 100% 20%
組8 H9-F9, H9-R9, H9-P9 100% 12%
組9 H9-F10, H9-R10, H9-P10 100% 16%
組10 H9-F11, H9-R11, H9-P11 100% 24%
組11 H9-F12, H9-R12, H9-P12 100% 24%
在36例肺組織樣本檢測以上11組引子探針組合，其中正常組織樣本11例，癌組織樣本25例，25例癌症組樣本中有鱗癌4例，腺癌21例。結果顯示組1、組2、組4、組5均有較好的檢出率。
為了進一步驗證其在痰液中的檢出率，我們選取了22例痰液標本進行驗證，其中包括7例正常對照，15例肺癌對照，15例肺癌中有鱗癌7例，腺癌7例，大細胞癌1例，檢測結果如下表22。 [表22] 在痰液中的檢測結果
組別 引子探針組合 特異性 靈敏性
組1 H9-F2, H9-R2, H9-P2 100% 66.7%
組2 H9-F3, H9-R3, H9-P3 100% 44.6%
組4 H9-F5, H9-R5, H9-P5 100% 33.3%
組5 H9-F6, H9-R6, H9-P6 100% 40.0%
從22例痰液標本的檢測結果顯示，組1：H9-F2,H9-R2,H9-P2的檢出率最高，達到66.7%。雖然在組織樣本中，組1和組2的靈敏度均能達到76%，但針對痰液檢測樣本，組2的靈敏度卻大幅下降至44.6%，這也從一方面證實了針對痰液樣本，設計具有高靈敏度的檢測試劑尤其不易。
最終，根據各組引子探針的檢測結果，最優選的引子探針序列如下表23。 [表23] 優化後的引子
名稱 序列編號 序列 作用
H9-F2 SEQ ID NO: 1 TTAGTTTTTTCGGTAGGCGGC HOXA9基因上游引子
H9-R2 SEQ ID NO: 2 AAACGCCAAACACCGTCG HOXA9基因下游引子
H9-P2 SEQ ID NO: 3 FAM-ACGTTGGTCGAGTATTTCGATTTTAGTTC-BQ1 HOXA9基因檢測探針
無。
[圖1] HOXA9、SHOX2、PCDHGA12、HOXD8、GATA3在所有組織標本中檢測的ROC曲線； [圖2] HOXA9、SHOX2、PCDHGA12、HOXD8、GATA3在痰液標本中檢測的ROC曲線； [圖3] HOXA9與SHOX2-n3在所有痰液標本中檢測的ROC曲線； [圖4] HOXA9與SHOX2_n3在痰液標本中的擴增曲線（A為HOXA9的擴增圖，B為SHOX2_n3的擴增圖； [圖5] HOXA9與SHOX2_n3在所有灌洗液標本中檢測的ROC曲線； [圖6] HOXA9與SHOX2_n3在灌洗液標本中的擴增曲線（A為HOXA9的擴增圖，B為SHOX2_n3的擴增圖）。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015

Claims (12)

  1. HOXA9基因甲基化的檢測試劑在製備肺癌診斷試劑中的用途。
  2. 根據請求項1所述之用途，其中該試劑的一檢測樣本包含痰液、肺部灌洗液、肺部組織、胸水、血液、血清、血漿、尿液、唾液、前列腺液、淚液或糞便； 優選地，該檢測樣本包含痰液、肺部組織或肺部灌洗液； 更優選地，該檢測樣本包含痰液或肺部灌洗液。
  3. 根據請求項1所述之用途，其中該HOXA9基因甲基化的檢測試劑檢測HOXA9基因經一轉化試劑修飾後的序列； 優選地，該轉化試劑選自肼鹽、重亞硫酸氫鹽和亞硫酸氫鹽中的一種或幾種； 更優選地，該轉化試劑選自重亞硫酸氫鹽。
  4. 根據請求項1所述之用途，其中該HOXA9基因甲基化的檢測試劑的檢測區域包含HOXA9的基因體或啟動子區域； 優選地，該HOXA9基因甲基化的檢測試劑的檢測區域包含SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 26所示的序列； 更優選地，該HOXA9基因甲基化的檢測試劑的檢測區域包含SEQ ID NO: 22所示的序列。
  5. 根據請求項1所述之用途，其中該HOXA9基因甲基化的檢測試劑包含一擴增引子； 優選地，該擴增引子包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58中的至少任意一條； 更優選地，該擴增引子包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示引子對。
  6. 根據請求項1所述之用途，其中該HOXA9基因甲基化的檢測試劑更包含一探針； 優選地，該探針包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 59所示的序列； 更優選地，該探針包含SEQ ID NO: 3所示的序列。
  7. 根據請求項1所述之用途，其中該HOXA9基因甲基化的檢測試劑更包含亞硫酸氫鹽、重亞硫酸鹽或肼鹽。
  8. 根據請求項1所述之用途，其中該HOXA9基因甲基化的檢測試劑更包含DNA 聚合酶、dNTPs、Mg²⁺離子和緩衝液中的一種或幾種； 優選地，包含DNA 聚合酶、dNTPs、Mg²⁺離子和緩衝液。
  9. 根據請求項1所述之用途，其中該HOXA9基因甲基化的檢測試劑更包含一參考基因的檢測試劑； 優選地，該參考基因包含β-actin或COL2A1； 優選地，該參考基因的檢測試劑包含參考基因的引子和探針； 優選地，該參考基因β-actin的檢測試劑包含SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17所示的引子對，以及SEQ ID NO: 18所示探針； 優選地，該參考基因COL2A1的檢測試劑包含SEQ ID NO: 60和SEQ ID NO: 61所示引子對，以及SEQ ID NO: 62所示探針。
  10. 一種檢測HOXA9基因的DNA甲基化的方法，包括以下步驟： （1） 將檢測樣本提取DNA後進行亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽或肼鹽處理，獲得經修飾的檢測樣本； （2） 利用請求項1-9任一所述之HOXA9基因甲基化的檢測試劑對步驟（1）經修飾的檢測樣本進行HOXA9基因甲基化情況檢測； 優選地，步驟（2）中，採用甲基化特異性聚合酶鏈反應或實時螢光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應進行檢測。
  11. 一種肺癌的診斷系統，包含： a.   一HOXA9基因的DNA甲基化檢測構件，以及， b.   一結果判斷構件； 優選地，該HOXA9基因的DNA甲基化檢測構件包含請求項1-9任一所述HOXA9基因甲基化的檢測試劑； 優選地，該甲基化檢測構件包含螢光定量PCR儀、PCR儀、測序儀中的一種或多種； 優選地，該結果判斷構件包含數據處理機器； 優選地，該結果判斷構件用於根據檢測構件檢測的HOXA9基因的DNA甲基化水平，輸出一診斷結果； 更優選地，該診斷結果是通過結果判斷構件比較待測樣本與正常樣本的甲基化水平，基於待測樣本與正常樣本的甲基化水平的偏離得出的。
  12. 一種肺癌的診斷方法，包括以下步驟： （1）   檢測來源於受試者的待測樣本HOXA9基因甲基化水平； （2）   將待測樣本與正常樣本的HOXA9基因甲基化水平比較 （3） 基於待測樣本與正常樣本的甲基化水平的偏離，診斷肺癌； 優選地，該待測樣本包含痰液、肺部灌洗液、肺部組織、胸水、血液、血清、血漿、尿液、唾液、前列腺液、淚液或糞便； 優選地，該待測樣本包含痰液、肺部組織或肺部灌洗液； 更優選地，該待測樣本包含痰液或肺部灌洗液。
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