CN110331142A - 一种多基因联合检测试剂 - Google Patents

一种多基因联合检测试剂 Download PDF

Info

Publication number
CN110331142A
CN110331142A CN201910625789.2A CN201910625789A CN110331142A CN 110331142 A CN110331142 A CN 110331142A CN 201910625789 A CN201910625789 A CN 201910625789A CN 110331142 A CN110331142 A CN 110331142A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sequence
primer
gene
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910625789.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110331142B (zh
Inventor
吴孝林
刘相林
罗茵
邹鸿志
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Kangliming Biological Science & Technology Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Kangliming Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Kangliming Biological Science & Technology Co Ltd filed Critical Guangzhou Kangliming Biological Science & Technology Co Ltd
Priority to CN201910625789.2A priority Critical patent/CN110331142B/zh
Publication of CN110331142A publication Critical patent/CN110331142A/zh
Priority to TW108143399A priority patent/TWI741418B/zh
Priority to PCT/CN2020/094963 priority patent/WO2021004215A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110331142B publication Critical patent/CN110331142B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药领域，特别涉及肿瘤标志物、甲基化检测试剂、试剂盒及其应用。本发明通过研究发现：通过检测SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合启动子区的甲基化水平，可以很好的从粪便标本中区分出结直肠癌标本。本发明就是利用含有该基因组合的甲基化试剂甲基化检测试剂来检测结直肠癌的，并且对肠癌的检测敏感性和特异性非常高，均能达到90％以上。

Description

一种多基因联合检测试剂
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及引物、捕获试剂、核酸探针、甲基化检测试剂、试剂盒及其应用。
发明背景
结直肠癌，又称为大肠癌，是一种常见的消化道恶性肿瘤。其发病率在我国逐年升高，在我国部分沿海地区比如上海和广州，大肠癌发病率已跃居第二位，仅次于肺癌。目前认为肠癌的形成是遗传缺陷和表观遗传缺陷累积的结果。结直肠癌早期发病隐匿，常无明显症状，晚期可出现便血、腹痛、腹泻等症状。而当出现症状就诊时常常是晚期，这给病人带来极大的痛苦和昂贵的治疗费用。因此早发现、早诊断、早治疗是降低结直肠癌发病率和死亡率的一项重要措施。
筛查可以早期发现肠癌和癌前病变，并去除病灶，从而阻止肠癌的发生。目前大肠癌的筛查方法主要有隐血试验和肠镜检查。隐血试验存在易受食物影响或对腺瘤检出率不高的问题。肠镜虽是肠癌诊断金标准，但作为筛查手段使用时人群依从性不高。因此急需一种准确性高、依从性高的肠癌筛查方法。
粪便基因检测作为一种新的肠癌筛查方法，现在越来越受到重视。该方法于2016年纳入美国的肠癌筛查指南。该方法具有方便、无创、对肠癌和癌前病变腺瘤的检出率高等特点。要做成对肠癌检测高性能的粪便基因检测试剂盒，主要需要克服两大障碍：粪便DNA的提取和标志物选择。一方面，粪便中成分复杂，对下游反应的抑制物多，还有许多细菌DNA，要从这样的混合物中提取出人的目标基因，需要一套高敏的基因提取和纯化方法；另一方面，目前和肠癌相关的标志物很多，尤其是DNA甲基化标志物，因为研究表明，DNA甲基化是肿瘤形成的早期事件。但很多甲基化标志物在细胞、组织层面表现很好，当用于粪便、血液等筛查媒介时，其对肠癌的敏感性和特异性就降下来了，比如vimentin基因，其在组织中的敏感性有83％，在粪便标本中就降到了46％(J NatlCancer Inst.2005Aug 3；97(15):1124-32.)。
另外，由于大肠癌的发病机理比较复杂，是多基因遗传疾病。现有对大肠癌单个甲基化标志物检测的方法存在以下两点局限性：第一，现有研究以及产品的检测方法均是在一个PCR反应孔中检测一个标志物，检测方法上未能够实现在一个PCR反应孔中对甲基化标志物的多重检测。第二、现有对大肠癌检测的甲基化标志物如SDC2、ITAG4、Septin 9等通过检测单基因的甲基化水平来检测大肠癌时，检测的敏感性受遗传学因素的限制。甲基化SDC2基因的检测敏感性为84.2％，特异性为97.9％；甲基化ITGA4的检测敏感性为83.8％特异性为95.2％；甲基化Septin9的检测敏感性为79.3％特异性为94.3％。这些单个标志物对大肠癌的检测的特异性均能够达到90％以上，但是在特异性达到90％以上时的敏感性均未能够达到90％以上。
虽然大肠癌单个甲基化标志物能够检测出部分的大肠癌，但通过分子生物学的方法尽可能多的检测出大肠癌患者则需要将大肠癌相关的标志物进行组合，但所需要面临的问题是：1、大多数大肠癌基因甲基化标志物对大肠癌的检测价值上呈现性能重叠的现象，即同一个大肠癌患者样本的检出情况在大多数甲基化标志物中是一致的。因此筛选出在大肠癌检测能力上能够互相补充的基因甲基化标志物难度非常大，需要大量的研究工作。另外，基因甲基化标志物越多，则检测体系的假阳性现象也会叠加，检测的特异性会降低。因此，在一定的检测特异性的前提下提高大肠癌检测敏感性的难度非常大。2、需要平衡检测成本、灵敏度以及特异性。
中国专利申请CN109207592A分析了多个标志物检测结直肠癌的模型，其中SEPT9、NDRG4、SDC2联合检测的敏感性仅为88.6％，特异性仅为89.1％；KRAS、BMP3、NDRG4、SEPT9、SDC2的多种不同组合检测模型中，其ROC曲线的AUC值最高仅为0.912，且获得此0.912的AUC需要同时联合检测5个基因标志物。
因此，挑选在粪便中对肠癌有极高检测敏感性和特异性的标志物组合是肠癌粪便基因检测的关键，并且这样的标志物组合有望真正用于肠癌的临床检测，且良好的引物、捕获序列和探针的设计也是影响标志物组合发挥作用的影响因素之一。
发明内容
本发明的目的在于一种引物，及其在制备检测结直肠肿瘤的试剂或试剂盒中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种捕获序列，及其在制备检测结直肠肿瘤的试剂或试剂盒中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种探针，及其在制备检测结直肠肿瘤的试剂或试剂盒中的应用。
本发明的另一个目的还在于提供一种多基因甲基化联合检测试剂，所述基因为SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4。
本发明的另一个目的还在于提供一种特异性强、敏感度高的结直肠肿瘤检测试剂和试剂盒。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
本发明提供了一种引物，所述引物选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25所示序列或其互补序列中的至少任意一条。
作为本发明优选的实施方式，所述引物选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25所示的任意一条。
作为本发明优选的实施方式，所述引物选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19以及SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的至少一对引物对。
作为本发明优选的实施方式，所述引物选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8以及SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的引物对。
作为本发明优选的实施方式，所述引物选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：18和SEQ ID NO：19以及SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的引物对。
另一方面，本发明还提供了一种捕获序列，所述捕获试剂选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10所示序列或其互补序列中的至少任意一条。
作为本发明优选的实施方式，所述捕获序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：6、SEQ ID NO：10所示的至少一条。
作为本发明优选的实施方式，所述捕获序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6和SEQID NO：10所示的序列。
作为本发明优选的实施方式，所述捕获序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQID NO：10所示的序列。
另一方面，本发明还提供了一种核酸探针，所述核酸探针选自SEQ ID NO：5、SEQID NO：9、SEQ ID NO：13所示序列或其互补序列中的至少任意一条。
作为本发明优选的实施方式，所述核酸探针选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQID NO：13所示的至少一条。
作为本发明优选的实施方式，所述核酸探针选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQID NO：13所示的序列。
另一方面，本发明还提供了上述引物或捕获序列或探针在制备检测结直肠肿瘤的试剂或试剂盒中的应用。
另一方面，本发明还提供了上述引物或捕获序列或探针或试剂或试剂盒在检测结直肠肿瘤中的应用。
另一方面，本发明还提供了SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合的甲基化联合检测试剂，包括针对SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合中每个基因的获得的捕获序列、引物和/或探针。
在本发明的一些具体的实施方案中，包括针对SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合中每个基因的CpG岛获得的捕获序列、引物和/或探针。
在本发明的一些具体的实施方案中，本发明提供的甲基化检测试剂通过检测SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合中的每个基因的基因体、基因间区或启动子区及启动子区附近区域的甲基化水平。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的甲基化检测试剂包括针对SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合中的每个基因的启动子区或所述启动子区附近区域的CpG岛获得的捕获序列、引物和/或探针。
本发明中的“COL4A1/COL4A2”指“COL4A1或COL4A2”。人类基因COL4A1和COL4A2在13号染色体长臂的远端紧密相连，这两个基因是“头对头”的位置关系，并且是相反的转录方向。COL4A1和COL4A2基因的5’端靠近，之间间隔127bp，这段序列是这两个基因共用的双向启动子区[1]。因此，根据两者共用的双向启动子设计的序列，既可以针对COL4A1，也可以针对COL4A2。在本发明中，无论以COL4A1还是COL4A2标注序列信息，两者并无区别。
本发明中的“检测”同诊断，除了结直肠肿瘤的早期诊断，还包括结直肠肿瘤中期和晚期的诊断，且也包括结直肠肿瘤筛选、风险评估、预后、疾病识别、病症阶段的诊断和治疗性靶标的选择。
结直肠肿瘤标志物组合SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4的应用使得结直肠肿瘤的早期诊断成为可能。当确定在癌症细胞中甲基化的基因在临床上或形态学上正常表象的细胞中甲基化时，这就表明该正常表象的细胞向癌症发展。这样，结直肠癌可在早期通过在正常表象的细胞中的结直肠肿瘤特异性SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合的甲基化而诊断。
其中，早期诊断指的是在转移之前发现癌症的可能性，优选在可观察到组织或者细胞的形态学变化之前。
除了结直肠肿瘤的早期诊断，本发明的试剂/试剂盒还有希望用于结直肠肿瘤筛选、风险评估、预后诊断、疾病识别、病症阶段的诊断和治疗性靶标的选择。
作为病症阶段可选的实施方式，可通过在结直肠肿瘤在不同阶段或时期的进展可通过从样品中获取的SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合的甲基化程度的测量进行诊断。通过比较从结直肠癌的每个阶段的样品中分离出的核酸的SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合甲基化程度与从没有细胞增殖性异常的肠组织中的样品中分离出的一个或多个核酸的SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合甲基化程度，可检测样品中结直肠肿瘤的具体阶段。
通常来说，CpG岛是指富含CpG二核苷酸的一些区域，通常位于启动子及其附近的区域，本发明中的CpG岛，不仅指启动子及其附近的区域富含CpG二核苷酸，也包括杂合甲基化的CpG位点，或者是孤立的CpG位点。
所述的SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合的甲基化联合检测试剂可以是现有技术中的甲基化检测试剂。现有技术中，已经有多种方法可以检测目的基因的甲基化，如甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化特异性定量PCR(qMSP)、甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR，定量PCR以及DNA芯片、甲基化敏感的限制性内切酶、重亚硫酸盐测序法或者焦磷酸测序等等。每种检测方法均有其相对应的试剂，这些试剂均可以用于本发明检测SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合的甲基化。
在本发明的一些具体的实施方案中，引物和/或探针通过quantitativeMethylation-Specific PCR(qMSP)检测SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合中的每个基因的甲基化。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的甲基化检测试剂中所述SDC2基因捕获序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
I、具有SEQ ID NO:1或2任一所示的核苷酸序列；
II、如Ⅰ所示序列的互补序列；
所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化检测的捕获序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
III、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
IV、如III所示序列的互补序列；
所述ITGA4基因的甲基化检测的捕获序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
V、具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
VI、如V所示序列的互补序列。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的所述SDC2基因的甲基化检测的引物中的上游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
VII、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
VIII、如VII所示序列的互补序列；
所述SDC2基因的甲基化检测的引物中的下游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
IX、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
X、如IX所示序列的互补序列；
所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化检测的引物中的上游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
XI、具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18任一所示的核苷酸序列；
XII、如XI所示序列的互补序列；
所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化检测的引物中的下游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
XIII、具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:19任一所示的核苷酸序列；
XIV、如XIII所示序列的互补序列；
在本发明的一些具体实施方案中，所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化检测的引物对如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；
在本发明的一些具体实施方案中，所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化检测的引物对如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示；
所述ITGA4基因的甲基化检测的引物中的上游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
XV、具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:24任一所示的核苷酸序列；
XVI、如XV所示序列的互补序列；
所述ITGA4基因的甲基化检测的引物中的下游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
XVII、具有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:25任一所示的核苷酸序列；
XVIII、如XVII所示序列的互补序列；
在本发明的一些具体实施方案中，所述ITGA4基因的甲基化检测的引物对如SEQID NO:11和SEQ ID NO:12所示；
在本发明的一些具体实施方案中，所述ITGA4基因的甲基化检测的引物对如SEQID NO:24和SEQ ID NO:25所示；
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的甲基化检测试剂中所述SDC2基因的甲基化检测的探针具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
XIX、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
XX、如XIX所示序列的互补序列；
所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化检测的探针具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
XXI、具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；
XXII、如XXI所示序列的互补序列；
所述ITGA4基因的甲基化检测的探针具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
XXIII、具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；
XXIV、如XXIII所示序列的互补序列。
本发明还提供了一种检测肿瘤的试剂盒，包括所述的甲基化检测试剂。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的试剂盒包括：第一容器，其包含捕获试剂；第二容器，其包含用于扩增的引物对；第三容器，其包含探针。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的试剂盒还包括试剂盒中的常用试剂，如qMSP中常用转化剂，用于将非甲基化的胞嘧啶碱基都转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶碱基保持不变。所述的转化剂无特别限制，现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以，如肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或几种。又如扩增COL4A1基因中常用的DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+离子和缓冲液等等。
本发明还提供了上述的甲基化检测试剂、试剂盒、捕获序列、引物、探针在制备甲基化检测的试剂或试剂盒，或者制备检测结直肠肿瘤的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了上述的甲基化检测试剂、试剂盒、捕获序列、引物、探针在甲基化检测中的应用，或者在检测结直肠肿瘤中的应用。
本发明还提供了一种肿瘤的检测系统，所述的系统包含有以下构件：
(1)SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因的甲基化联合检测构件：
(2)数据处理构件；
(3)结果输出构件；
在本发明的一些具体实施方案中，所述的甲基化检测构件含有甲基化检测仪器；
在本发明的一些具体实施方案中，所述的甲基化检测构件还含有所述的甲基化检测试剂、试剂盒、捕获序列、引物、探针。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的甲基化检测仪器包含荧光定量PCR仪、PCR仪、测序仪中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的数据处理构件含有数据处理机器。
所述的数据处理机器包括本领域技术人员可使用的任何可以进行数据处理的设备或仪器或装置。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的数据处理机器包含计算器、计算机中的一种或多种。
所述的计算机中附载有本领域技术人员可使用的任何可以进行数据处理或统计分析的软件或程序。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的计算机包含附载有SPSS、SAS、Excel中一种或多种软件的计算机。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的结果输出构件含有结果输出器。
所述的输出器包含任何可以将数据处理结果显示为可阅读的内容的设备或仪器或装置。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的结果输出器包含屏幕、纸质报告中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的数据处理器被配置于a.接收待测样本以及正常对照样本的测试数据；b.储存待测样本以及正常对照样本的测试数据；c.比对同种类型的待测样本以及正常对照样本的测试数据；d.根据比对结果，响应于测试者罹患肿瘤的概率或者可能性。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的结果输出构件用于输出测试者罹患肿瘤的概率或者可能性。
在本发明的一些具体实施方案中，数据处理构件的判断标准为：根据界值判断肿瘤标本和正常标本。
在本发明的一些具体实施方案中，标本中的Ct值的界值为36-39。
在本发明的一些具体实施方案中，粪便标本中的Ct值的界值为38。
在本发明的一些具体实施方案中，标本的Ct值小于所述Ct值的界值则判断为肿瘤标本，所述标本的Ct值大于等于所述Ct值的界值则判断为正常标本。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明所述肿瘤为结直肠肿瘤。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明所述肿瘤为结直肠癌或腺瘤。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明针对的待测样本或者样本类型为组织、体液或排泄物。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明所述的组织为肠组织。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明所述的体液为血液、血清、血浆、细胞外液、组织液、淋巴液、脑脊液或房水。
在本发明的一些具体实施方案中，所述排泄物为痰液、尿液、唾液或粪便。
在本发明的一些具体实施方案中，所述排泄物为粪便。
本发明通过研究发现：在一些具体的实施方案中，通过所述的引物、捕获试剂、核酸探针检测SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合中每个基因的启动子区的甲基化水平，可以很好的从的粪便标本中区分出结直肠癌标本。并且对肠癌的检测敏感性和特异性极高。
与现有的检测肠癌的标志物相比，本发明提供的引物、捕获试剂、核酸探针以及SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合和技术方案能够以极高的敏感性和特异度来检测结直肠癌，本发明的技术方案对结直肠癌的检测敏感性和特异性都高于90％。具体有以下几点：
1、本发明的技术方案对SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合的甲基化进行联合检测，该方法可以实现对多基因的联合检测，极大的降低了试验的复杂程度，提高了检测效率。
2、在一次验证中，SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合的甲基化检测试剂在粪便标本中能够在特异性为95.28％时，检测出91.36％的结直肠癌，可以简便地粪便作为检测样本，对结直肠癌进行可靠的诊断。粪便样品获得非常容易，取样无创简单，而且不会对病人造成任何的痛苦和不便。
3、上述的一个技术方案中含有SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4基因组合的甲基化检测试剂，提取检测方法能非常方便、准确地判断出结直肠癌和正常人，该基因组合的甲基化检测试剂有望用于粪便基因检测试剂盒，并服务于肠癌的临床检测。
4、上述的一个技术方案中的试剂/试剂盒是通过甲基化水平来检测和诊断癌症，越来越多的研究证实甲基化改变是肿瘤发生过程中的早期事件，检测甲基化异常更易发现早期病变。
附图说明
图1为实施例1中引物对S0的扩增曲线；
图2为实施例1中引物对S0的扩增曲线；
图3为实施例1中引物对S0的扩增曲线；
图4为实施例2中引物对C0的扩增曲线；
图5为实施例2中引物对C1的扩增曲线；
图6为实施例2中引物对C2的扩增曲线；
图7为实施例3中引物对I0的扩增曲线；
图8为实施例3中引物对I1的扩增曲线；
图9为实施例3中引物对I0的扩增曲线；
图10为实施例4中935例粪便标本，SDC2、COL4A1/COL4A2和ITG4基因联合检测结直肠癌和腺瘤(≧1cm)的ROC曲线；
图11为实施例5中用SDC2、COL4A1/COL4A2和ITG4基因联合检测的方法检测23例结直肠癌患者术前术后粪便样本的检测结果；
图12为对比例1中240例粪便标本，SOX21基因检测结直肠癌和腺瘤的ROC曲线；
图13为对比例2中109例粪便标本，ITGA4、COL4A1/COL4A2基因联合检测结直肠癌的ROC曲线
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1
按照表1设计SDC2三对引物进行研究扩增的特异性。
表1 SDC2的引物
使用以上3对引物分别检测2例结直肠癌患者粪便样本DNA和2例正常人粪便样本DNA，分析扩增的特异性。
3对引物扩增SDC2的扩增曲线如图1-3所示。
结果显示SDC2引物对S0的扩增特异性较好；而其它两对引物其扩增曲线阴阳性样本差异小，无法有效区分阴阳性样本。
实施例2
按照表2设计COL4A1/COL4A2三对引物进行研究扩增的特异性。
表2 COL4A1/COL4A2的引物
使用以上3对引物分别检测3例结直肠癌患者粪便样本DNA和3例正常人粪便样本DNA，分析扩增的特异性。
3对引物扩增COL4A1/COL4A2的扩增曲线如图4-6所示。
结果显示COL4A1/COL4A2引物对C0和C1的扩增特异性较好；而引物对C2对COL4A1/COL4A2没有扩增。
实施例3
按照表3设计ITGA4三对引物进行研究扩增的特异性。
表3 ITGA4的引物
使用以上3对引物分别检测3例结直肠癌患者粪便样本DNA和3例正常人粪便样本DNA，分析扩增的特异性。
3对引物扩增ITGA4的扩增曲线如图7-9所示。
结果显示ITGA4引物对I0和I2的扩增特异性较好；而引物对I1其扩增曲线阴阳性样本差异小，无法有效区分阴阳性样本。
实施例4
选取935例粪便标本(359例结直肠癌，67例腺瘤(≧1cm)，509例非肿瘤个体，均经肠镜或病理确认)，进行研磨离心，加入50ul捕获磁珠(含有SDC2，COL4A2，ITGA4以及内参基因ACTB的捕获序列)，并按如下所述技术方案操作，
技术方案如下：
1)收集有肠镜病理结果的正常人和结直肠肿瘤病人的粪便标本，按1g粪便：4mL保护液混合研磨后5000rpm离心10min，取上清弃沉淀；
2)取出10mL上清再次离心，取上清3.2mL加入2mL裂解液和50ul捕获磁珠M1，95℃孵育15min，然后室温放置30min；
3)置于磁力架上弃部分上清后洗下磁珠转移至2mL离心管，加入800ul洗液W1，室温1300rpm孵育1min，置于磁力架上吸去上清，重复2次；
4)加入50ul洗脱液，室温1300rpm孵育5min，置于磁力架上，3min内转移洗脱液至新的EP管中；
5)用EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research)对上一步骤中的DNA片段按照参考文献[2]中的方法进行甲基化处理，最后的洗脱液20ul用于qMSP检测。
最后得到Bisulfite转化后的DNA 20ul。然后进行qMSP检测，最后根据CT值判断标本中SDC2、COL4A1/COL4A2和ITG4基因组合的甲基化水平。
本实施例qMSP反应体系：30ul(无核酸酶水2.98ul，5×Colorless GoTaq FlexiBuffer 6ul，MgCl2(25mM)5ul，dNTPs(10mM)1ul，GoTaq Hot Start polymerase0.6ul，ACTB-FP(100uM)0.08ul，ACTB-RP(100uM)0.08ul，ACTB-Probe(100uM)0.06ul，SDC2-FP(100uM)0.12ul，SDC2-RP(100uM)0.12ul，SDC2-Probe(100uM)0.04ul，COL4A2-FP(100uM)0.06ul，COL4A2-RP(100uM)0.06ul，COL4A2-Probe(100uM)0.04ul，ITGA4-FP(100uM)0.06ul，ITGA4-RP(100uM)0.06ul，ITGA4-Probe(100uM)0.04ul，DNA 10ul)。反应程序：95℃5min，(95℃15s，58℃30s，72℃30s)×48Cycles，40℃30s。
捕获和PCR反应以ACTB作为内参基因，最后根据CT值判断标本中甲基化水平，目标基因CT值≦38判断为阳性，CT值>38判断为阴性。
因为COL4A1和COL4A2基因5’端靠近，之间间隔127bp，为共用的双向启动子区。本实施例检测的甲基化区域为COL4A1和COL4A2基因的双向启动子区。因此本实施例选择该两个基因中COL4A2的基因方向标注序列信息。
SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4这几个基因发生甲基化的位点主要位于启动子区或附近的CpG岛上。
在本实施例中，采用同一种荧光基团标记SDC2，COL4A2和ITGA4的PCR探针，因此可以通过一个荧光通道便捷地检测出这几个基因的甲基化水平总和，而不需要每个基因用不同的荧光通道检测，降低了试验的复杂程度。
本实施例的捕获序列、引物探针如下：
SEQ ID NO.1:SDC2的捕获序列1：
5’-AGCCCGCGCACACGAATCCGGAGCAGAGTACCG-3’或
SEQ ID NO.2:SDC2的捕获序列2：
5’-CTCCTGCCCAGCGCTCGGCGCAGCCCGC-3’
SDC2的qMSP引物探针：
SEQ ID NO.3:SDC2-FP：5’-GAGGAAGCGAGCGTTTTC-3’
SEQ ID NO.4:SDC2-RP：5’-AAAATACCGCAACGATTACGA-3’
SEQ ID NO.5:SDC2-Probe：5’-AGTTTCGAGTTCGAGTTTTCGAGTTTG-3’
SEQ ID NO.6:COL4A1/COL4A2的捕获序列：
5’-GCTGCTGCCCGAACGCATTGGCCCTTCCAGAAGCA-3’
COL4A1/COL4A2的qMSP引物探针：
SEQ ID NO.7:COL4A1/COL4A2-FP：5’-AGAGAGTTTAGTAAGGTCGGGC-3’
SEQ ID NO.8:COL4A1/COL4A2-RP：5’-GACTTCAAAAACTACTACCCG-3’
SEQ ID NO.9:COL4A1/COL4A2-Probe：5’-TGTCGGTGTGTCGTCGGC-3’
SEQ ID NO.10:ITGA4的捕获序列：
5’-CTACGCGCGGCTGCAGGGGGCGCTGGGGAACCT-3’
ITGA4的qMSP引物探针：
SEQ ID NO.11:ITGA4-FP：5’-ACGCGAGTTTTGCGTAGAC-3’
SEQ ID NO.12:ITGA4-RP：5’-GCTAAATAAAATCCCGAACG-3’
SEQ ID NO.13:ITGA4-Probe：5’-ACGGAGTTCGGTTTTGCGTTTTC-3’
根据这935例粪便标本结果，使用IBM SPSS statistics 20软件绘制该标志物组合检测结直肠癌和腺瘤的ROC曲线，如图1所示。
结果显示，SDC2、COL4A1/COL4A2和ITG4基因甲基化联合检测，在特异性为95.28％时，对结直肠癌敏感性高达91.36％，对腺瘤敏感性为50.75％；SDC2、COL4A1/COL4A2和ITG4基因甲基化联合检测，检测结直肠癌的ROC曲线下面积为0.979，95％CI为0.970～0.988，检测腺瘤的ROC曲线下面积为0.832，95％CI为0.771～0.894。
实施例5
选取23例确诊为结直肠癌的患者，分别在术前和术后3-6个月收集患者的粪便标本，用本发明的标志物组合(SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4)检测术前和术后共46例粪便标本，比较该标志物组合在术前术后粪便中甲基化水平。
标志物组合的检测流程和结果判断标准同实施例1。目标基因CT值≦38判断为阳性，CT值>38判断为阴性。结果如图2所示。
结果显示，术前这23例结直肠癌患者检测结果均为阳性，手术后再次检测其粪便标本，结果均为阴性。说明手术切除肿瘤后，该标志物组合的甲基化水平显著降低，提示该标志物组合可用于结直肠癌患者的术后随访监测。
对比例1
研究发现检测粪便中甲基化SOX21基因可以用于结直肠癌的辅助诊断，现采用甲基化SOX21在粪便中检测结直肠癌作为对比例。以下为粪便中检测SOX21基因的流程和结果。
选取240例粪便标本(80例结直肠癌，77例≧1cm腺瘤，83例正常，均经肠镜或病理确认)，进行研磨离心，加入50ul捕获磁珠(含有SOX21和内参基因ACTB的捕获序列)，并按实施例1中所述“技术方案”操作，最后得到Bisulfite转化后的DNA 20ul。然后进行qMSP检测，最后根据CT值判断标本中SOX21甲基化水平。
试剂中含有的捕获序列、引物探针，以及qMSP反应体系和程序见参考文献[2]。根据240例粪便标本结果，绘制SOX21基因检测结直肠癌和腺瘤的ROC曲线，如图3所示。
结果显示，当甲基化的SOX21特异性为97.6％时，对结直肠癌敏感性为80％，对腺瘤敏感性为33.8％；SOX21检测结直肠癌的ROC曲线下面积为0.926，95％CI为0.885～0.968，检测腺瘤的ROC曲线下面积为0.667，95％CI为0.583～0.751。
对比例2
选取161例粪便标本(79例结直肠癌，82例正常，均经肠镜或病理确认)，进行研磨离心，加入50ul捕获磁珠(含有SOX21、SDC2和内参基因ACTB的捕获序列)，并按实施例1中所述“技术方案”操作，最后得到Bisulfite转化后的DNA 20ul。然后进行qMSP检测，最后根据CT值判断标本中SOX21和SDC2的甲基化水平。
SOX21的捕获序列、引物探针，以及qMSP反应体系和程序同对比例1；SDC2的捕获序列、引物探针，以及qMSP反应体系和程序同实施例1。
检测结果显示甲基化SDC2基因的检测敏感性为88.6％，特异性为93.9％；曲线下面积为0.939。甲基化SOX21基因的检测敏感性为79.7％，特异性为86.6％；曲线下面积为0.924。甲基化SOX21基因与甲基化SDC2基因组合的检测敏感性为87.34％，特异性为93.9％。甲基化SDC2基因与甲基化SOX21基因联合检测的检测敏感性低于甲基化SDC2基因单独作为大肠癌标志物的检测敏感性，同时也低于本发明SDC2、COL4A1/COL4A2和ITG4基因甲基化联合检测的敏感性。
对比例3
选取109例粪便标本(61例结直肠癌，48例正常，均经肠镜或病理确认)，进行研磨离心，加入50ul捕获磁珠(含有ITGA4、COL4A1/COL4A2和内参基因ACTB的捕获序列)
ITGA4、COL4A1/COL4A2的捕获序列、引物探针，以及qMSP反应体系和程序同实施例1。
根据这109例粪便标本结果，绘制该标志物组合检测结直肠癌的ROC曲线，如图4所示。
结果显示结直肠癌与正常人样本的区分的曲线下面积为0.964。选择阳性判断Ct值为38时，甲基化ITGA4+COL4A1/COL4A2基因对大肠癌的检测的敏感性为86.89％，特异性为91.67％。其敏感性及特异性均低于本发明SDC2、COL4A1/COL4A2和ITG4基因甲基化联合检测的敏感性和特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
参考文献：
1.Fischer G,Schmidt,Cornelia,et al.Identification of a novel sequenceelement in the common promoter region of human collagen type IV genes,involvedin the regulation of divergent transcription.Biochem.J.1993 292:687-695.
2.Niu F,Wen J,Fu X,et al.Stool DNA Test of Methylated Syndecan-2 forthe Early Detection of Colorectal Neoplasia.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev2017；26:1411-1419.
3.刘相林，文加玲，牛凤，等.粪便中SOX21基因甲基化检测在结直肠癌诊断中应用价值[J].中华肿瘤防治杂志,2018(24):1710-1715.
序列表
<110> 广州市康立明生物科技有限责任公司
<120> 一种多基因联合检测试剂
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SDC2的捕获序列1
<400> 1
agcccgcgca cacgaatccg gagcagagta ccg 33
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SDC2的捕获序列2
<400> 2
ctcctgccca gcgctcggcg cagcccgc 28
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SDC2-FP
<400> 3
gaggaagcga gcgttttc 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SDC2-RP
<400> 4
aaaataccgc aacgattacg a 21
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SDC2-Probe
<400> 5
agtttcgagt tcgagttttc gagtttg 27
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> COL4A1/COL4A2的捕获序列
<400> 6
gctgctgccc gaacgcattg gcccttccag aagca 35
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> COL4A1/COL4A2-FP
<400> 7
agagagttta gtaaggtcgg gc 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> COL4A1/COL4A2-RP
<400> 8
gacttcaaaa actactaccc g 21
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> COL4A1/COL4A2-Probe
<400> 9
tgtcggtgtg tcgtcggc 18
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ITGA4的捕获序列
<400> 10
ctacgcgcgg ctgcaggggg cgctggggaa cct 33
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ITGA4-FP
<400> 11
acgcgagttt tgcgtagac 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ITGA4-RP
<400> 12
gctaaataaa atcccgaacg 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ITGA4-Probe
<400> 13
acggagttcg gttttgcgtt ttc 23
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SDC2-FP
<400> 14
gtaggaggag gaagcgagcg ttttc 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SDC2-RP
<400> 15
cgcaacgatt acgactcaaa ctcga 25
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SDC2-FP
<400> 16
cggggcgtag ttgcgggcgg c 21
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SDC2-RP
<400> 17
cgctcgacgc aacccgcg 18
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> COL4A1/COL4A2-FP
<400> 18
agagagttta gtaaggtcgg ac 22
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> COL4A1/COL4A2-RP
<400> 19
gacttcaaaa actactaccc g 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> COL4A1/COL4A2-FP
<400> 20
agagagttta gtaaggtcgg gc 22
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> COL4A1/COL4A2-RP
<400> 21
ttagggtttg ggcgtcgttc g 21
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ITGA4-FP
<400> 22
acgcgagtcc tgcgcagcc 19
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ITGA4-RP
<400> 23
gctaaataaa atcccgaacg 20
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ITGA4-FP
<400> 24
acgcgagttt tgcgtagtc 19
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ITGA4-RP
<400> 25
gctaaataaa atcccgaacg 20

Claims (10)

1.一种引物，其特征在于，所述引物选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25所示序列或其互补序列中的至少任意一条；
优选的，所述引物选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25所示的任意一条；
优选的，所述引物选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8、SEQID NO：11和SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19以及SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的至少一对引物对；
优选的，所述引物选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8以及SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的引物对；
优选的，所述引物选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19以及SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的引物对。
2.一种捕获序列，其特征在于，所述捕获序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：10所示序列或其互补序列中的至少任意一条；
优选的，所述捕获序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10所示的至少一条；
优选的，所述捕获序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10所示的序列；
优选的，所述捕获序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10所示的序列。
3.一种核酸探针，其特征在于，所述核酸探针选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：13所示序列或其互补序列中的至少任意一条；
优选的，所述核酸探针选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13所示的至少一条；
优选的，所述核酸探针选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：13所示的序列。
4.一种多基因甲基化联合检测试剂，所述基因为SDC2，COL4A1/COL4A2和ITGA4，其特征在于，包括每个基因的甲基化检测的捕获序列、引物和/或探针；
优选地，包括针对每个基因的CpG岛获得的捕获序列、引物和/或探针；
优选地，包括针对每个基因的基因体、基因间区、启动子区或所述启动子区附近区域的CpG岛获得的捕获序列、引物和/或探针；
优选地，所述引物如权利要求1所示；
优选地，所述捕获序列如权利要求2所示；
优选地，所述探针如权利要求3所示。
5.如权利要求4所述的多基因甲基化联合检测试剂，其特征在于，所述SDC2基因的甲基化检测的捕获序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
I、具有SEQ ID NO:1或2任一所示的核苷酸序列；
II、如Ⅰ所示序列的互补序列；
所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化检测的捕获序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
III、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
IV、如III所示序列的互补序列；
所述ITGA4基因的甲基化检测的捕获序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
V、具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
VI、如V所示序列的互补序列；
优选地，所述SDC2基因的甲基化检测的引物中的上游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
VII、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
VIII、如VII所示序列的互补序列；
所述SDC2基因的甲基化检测的引物中的下游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
IX、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
X、如IX所示序列的互补序列；
所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化检测的引物中的上游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
XI、具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18任一所示的核苷酸序列；
XII、如XI所示序列的互补序列；
所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化检测的引物中的下游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
XIII、具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:19任一所示的核苷酸序列；
XIV、如XIII所示序列的互补序列；
优选的，所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化检测的引物对如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；
优选的，所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化检测的引物对如SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:19所示；
所述ITGA4基因的甲基化检测的引物中的上游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
XV、具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:24任一所示的核苷酸序列；
XVI、如XV所示序列的互补序列；
所述ITGA4基因的甲基化检测的引物中的下游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
XVII、具有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:25任一所示的核苷酸序列；
XVIII、如XVII所示序列的互补序列；
优选地，所述ITGA4基因的甲基化检测的引物对如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；
优选地，所述ITGA4基因的甲基化检测的引物对如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示；
优选地，所述SDC2基因的甲基化检测的探针具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
XIX、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
XX、如XIX所示序列的互补序列；
所述COL4A1/COL4A2基因的甲基化检测的探针具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
XXI、具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；
XXII、如XXI所示序列的互补序列；
所述ITGA4基因的甲基化检测的探针具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
XXIII、具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；
XXIV、如XXIII所示序列的互补序列。
6.包含权利要求1所述引物、或权利要求2所述捕获序列、或权利要求3所述核酸探针、或权利要求4-5任一所述试剂的试剂盒；
优选地，所述试剂盒包括：第一容器，其包含捕获试剂；第二容器，其包含用于扩增的引物对；第三容器，其包含探针。
7.如权利要求1所述的引物，或者权利要求2所述的捕获试剂，或者权利要求3所述的核酸探针，或者权利要求4-5任一所述试剂，在制备甲基化检测的试剂或试剂盒中应用，或者制备检测结直肠肿瘤的试剂或试剂盒中的应用。
8.如权利要求1所述的引物，或者权利要求2所述的捕获试剂，或者权利要求3所述的核酸探针，或者权利要求4-5任一所述的试剂，或者权利要求6所述的试剂盒，在甲基化检测中的应用，或者在检测结直肠肿瘤中的应用。
9.如权利要求7或8任一所述的应用，其特征在于，所述结直肠肿瘤为结直肠癌或腺瘤。
10.如权利要求7或8任一所述的应用，其特征在于，
检测所针对的待测样本为组织、体液或排泄物；
优选地，所述的组织为肠组织；
优选地，所述的体液为血液、血清、血浆、细胞外液、组织液、淋巴液、脑脊液或房水；
优选地，所述排泄物为痰液、尿液、唾液或粪便；
更优选地，所述排泄物为粪便。
CN201910625789.2A 2019-07-11 2019-07-11 一种多基因联合检测试剂 Active CN110331142B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910625789.2A CN110331142B (zh) 2019-07-11 2019-07-11 一种多基因联合检测试剂
TW108143399A TWI741418B (zh) 2019-07-11 2019-11-28 多基因聯合檢測試劑
PCT/CN2020/094963 WO2021004215A1 (zh) 2019-07-11 2020-06-08 一种多基因联合检测试剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910625789.2A CN110331142B (zh) 2019-07-11 2019-07-11 一种多基因联合检测试剂

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110331142A true CN110331142A (zh) 2019-10-15
CN110331142B CN110331142B (zh) 2021-12-21

Family

ID=68146400

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910625789.2A Active CN110331142B (zh) 2019-07-11 2019-07-11 一种多基因联合检测试剂

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN110331142B (zh)
TW (1) TWI741418B (zh)
WO (1) WO2021004215A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111534590A (zh) * 2020-04-30 2020-08-14 福建西陇生物技术有限公司 一种结直肠癌多基因甲基化联合检测试剂盒及其应用
WO2021004215A1 (zh) * 2019-07-11 2021-01-14 广州市康立明生物科技有限责任公司 一种多基因联合检测试剂
CN112575084A (zh) * 2020-12-23 2021-03-30 安徽安龙基因科技有限公司 基于算法的肺结节良恶性评估的甲基化检测试剂盒及应用
WO2024082624A1 (zh) * 2022-10-21 2024-04-25 南京普济生物医学有限公司 一种带有茎环结构的引物及应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114107498B (zh) * 2021-11-17 2023-10-03 武汉大学中南医院 结直肠癌血液检测标记物及其应用
CN115948554B (zh) * 2022-12-26 2024-08-20 广州尔立简生物科技有限公司 Col4a1和notch2基因甲基化在检测乳腺癌中的应用和引物探针组合物及试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543354A (zh) * 2015-12-31 2016-05-04 广州市康立明生物科技有限责任公司 一种肿瘤分子检测/诊断试剂
CN106687600A (zh) * 2014-06-05 2017-05-17 临床基因组学私人有限公司 用于甲基化分析的方法
CN106947822A (zh) * 2017-04-12 2017-07-14 广州市康立明生物科技有限责任公司 Itga4基因甲基化检测试剂、试剂盒及检测方法
CN110512001A (zh) * 2018-05-22 2019-11-29 广州市康立明生物科技有限责任公司 肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用
CN110511997A (zh) * 2018-05-22 2019-11-29 广州市康立明生物科技有限责任公司 肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011002029A1 (ja) * 2009-07-03 2011-01-06 国立大学法人東京大学 癌細胞の存否を判定する方法および癌患者の予後を判定する方法
KR101142131B1 (ko) * 2009-11-05 2012-05-11 (주)지노믹트리 장암 진단을 위한 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법
CA2938451C (en) * 2014-01-30 2023-10-17 The Regents Of The University Of California Methylation haplotyping for non-invasive diagnosis (monod)
WO2018087129A1 (en) * 2016-11-08 2018-05-17 Region Nordjylland, Aalborg University Hospital Colorectal cancer methylation markers
CN108103195B (zh) * 2018-01-22 2021-08-03 上海酷乐生物科技有限公司 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用
CN110511998A (zh) * 2018-05-22 2019-11-29 广州市康立明生物科技有限责任公司 肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用
CN109355390A (zh) * 2018-12-05 2019-02-19 苏州艾达康医疗科技有限公司 用于检测结直肠癌的试剂盒及其应用
CN110317871B (zh) * 2019-07-11 2022-06-07 广州康立明生物科技股份有限公司 一种基因标志物组合及其应用
CN110331142B (zh) * 2019-07-11 2021-12-21 广州康立明生物科技股份有限公司 一种多基因联合检测试剂

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106687600A (zh) * 2014-06-05 2017-05-17 临床基因组学私人有限公司 用于甲基化分析的方法
CN105543354A (zh) * 2015-12-31 2016-05-04 广州市康立明生物科技有限责任公司 一种肿瘤分子检测/诊断试剂
CN106947822A (zh) * 2017-04-12 2017-07-14 广州市康立明生物科技有限责任公司 Itga4基因甲基化检测试剂、试剂盒及检测方法
CN110512001A (zh) * 2018-05-22 2019-11-29 广州市康立明生物科技有限责任公司 肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用
CN110511997A (zh) * 2018-05-22 2019-11-29 广州市康立明生物科技有限责任公司 肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VLADIMIR A NAUMOV等: ""Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips"", 《EPIGENETICS》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021004215A1 (zh) * 2019-07-11 2021-01-14 广州市康立明生物科技有限责任公司 一种多基因联合检测试剂
CN111534590A (zh) * 2020-04-30 2020-08-14 福建西陇生物技术有限公司 一种结直肠癌多基因甲基化联合检测试剂盒及其应用
CN112575084A (zh) * 2020-12-23 2021-03-30 安徽安龙基因科技有限公司 基于算法的肺结节良恶性评估的甲基化检测试剂盒及应用
CN112575084B (zh) * 2020-12-23 2024-07-19 安徽安龙基因科技有限公司 基于算法的肺结节良恶性评估的甲基化检测试剂盒及应用
WO2024082624A1 (zh) * 2022-10-21 2024-04-25 南京普济生物医学有限公司 一种带有茎环结构的引物及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110331142B (zh) 2021-12-21
TWI741418B (zh) 2021-10-01
TW202102689A (zh) 2021-01-16
WO2021004215A1 (zh) 2021-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110331142A (zh) 一种多基因联合检测试剂
CN108977543B (zh) 一种基于联合检测sdc2和sfrp2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂
CN110317871A (zh) 一种基因标志物组合及其应用
ES2510842T3 (es) Gen asociado con cáncer de hígado, y método para la determinación del riesgo de adquirir cáncer de hígado
CN109072310A (zh) 在尿液中检测癌症
CN106987638A (zh) 用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的引物、探针、试剂盒及检测方法
CN110387420A (zh) 用于子宫内膜癌诊断的试剂盒以及应用
CN111197073A (zh) 从粪便中提取dna样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法
CN115287351A (zh) 包括外泌体miR-106b-3p、miR-125a-5p在肺癌诊断中的应用
CN107475443A (zh) 子宫颈癌检测套组
RU2770928C1 (ru) Опухолевый маркер, реагент для выявления метилирования, набор и их применение
CN110512001A (zh) 肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用
CN110511998A (zh) 肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用
CN115537464B (zh) 一种结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断试剂、核酸组合、试剂盒及应用
CN109097468A (zh) Opcml基因启动子甲基化水平的检测试剂盒及其应用
CN104561258B (zh) 一种用于直结肠癌早期诊断的检测试剂盒及其应用
CN108460247B (zh) 基于kras和ndrg4基因确定结直肠肿瘤细胞的方法和系统
CN114150065B (zh) 一种结直肠癌或癌前病变的标记物及其应用
JPWO2021004214A5 (zh)
CN114941028B (zh) 结直肠癌的检测和诊断的试剂及试剂盒
CN110512000A (zh) 肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用
WO2024045162A1 (zh) Adhfe1基因的差异性甲基化区域、试剂盒和用途
RU2775177C1 (ru) Опухолевый маркер, реагент для выявления метилирования, набор и их применение
CN116987786A (zh) 用于结直肠癌检测的靶基因组合、引物和探针以及试剂盒
CN110511999A (zh) 肿瘤标志物、甲基化试剂、试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40008187

Country of ref document: HK

CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 510530 6th floor, building A2, No. 11, Kaiyuan Avenue, Science City, Guangzhou high tech Industrial Development Zone, Guangzhou City, Guangdong Province

Applicant after: Guangzhou kangliming Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 510000 6th floor, building A2, No. 11, Kaiyuan Avenue, Science City, Guangzhou high tech Industrial Development Zone, Guangzhou City, Guangdong Province

Applicant before: Guangzhou Kliming Biotechnology Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant