CN116987786A - 用于结直肠癌检测的靶基因组合、引物和探针以及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于结直肠癌检测的靶基因组合、引物和探针以及试剂盒。其中，靶基因组合包括以下靶基因中的至少两种：SDC2、BMP3、NDRG4、SFRP2。针对SDC2检测的引物如Seq_1～Seq_4所示，探针如Seq_5～Seq_6所示；针对BMP3检测的引物如Seq_7～Seq_8所示，探针如Seq_9所示；针对NDRG4检测的引物如Seq_10～Seq_11所示，探针如Seq_12所示；针对SFRP2检测的引物如Seq_13～Seq_14所示，探针如Seq_15所示。本发明的检测试剂盒与其它基于基因突变的PRC检测技术相比，表观遗传变化更适合作为疾病的分子标志物，避免了某些发病情况下没有受检基因发生突变而造成无检出可能的情况，检测效率、灵敏度及准确度更高。

Description

用于结直肠癌检测的靶基因组合、引物和探针以及试剂盒

技术领域

本发明涉及医学基因检测技术领域，尤其涉及用于结直肠癌检测的靶基因组合、引物和探针以及试剂盒。

背景技术

大肠癌(Colorectal Cancer，CRC)是常见的一种恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌。过去60年中许多风险因素导致CRC发病率上升，其发病与生活方式、遗传、环境因素等关系密切，如酒精和红肉摄入、肥胖、吸烟及人口老龄化，且发病年龄趋老年化，男女之比为1.65：1。CRC是中国第四大最常见癌症类型。据国家癌症中心报告，2015年CRC发病率位列所有癌症第三。最发达地区的东部与中西部相比，CRC是第二种常见癌症，且中国的发病率接近美国，尤其男性更甚。据估计，2020年中国CRC死亡率已超过美国。

通常情况下，大多数CRC非遗传性散发，但一级亲属患有该病的个体风险几乎翻一番，一级以上亲属患病的个体风险进一步增加。从个体发育早期(产前)到青春期直至成年的任何阶段都会有促成结直肠癌发生发展的因素。由于肉眼可见的肠道病变通常需10年才能发展为CRC，从而为早期诊断留下了很宽的时间窗口，使CRC成为筛查最能获益的癌症之一，因此高人类发展指数国家，如美国、澳大利亚和日本CRC发病率和死亡率呈下降趋势。在通常情况下，结肠镜被称为筛查和诊断金标准，灵敏度高，可对癌前病变进行切除，但成本较高，接受度较差。粪便隐血(FOBT)或粪便免疫化学(FIT)最经济且容易实施，但准确度相对较低，结果仍须结肠镜确认。

从生物学微观层面分析，CRC的发生通常涉及两大主要途径：一是“经典”途径，涉及管状腺瘤发展而来腺癌；另一途径是锯齿状息肉及其发展成的锯齿状结直肠癌。在CRC发生发展过程中，随正常细胞癌变，更多基因突变和表观遗传学改变逐渐出现，如WNT基因突变信号通路在该过程早期很常见，而TP53突变较晚发生。

综上所述，现有检测结直肠癌的方法存在以下不可避免的缺陷：

缺点一：肠镜检查前需要口服泻药，来清洗肠道。泻药分为很多种，通常都是喝大量的水分，帮助肠道内容物的排出，来达到清洁肠道的目的，以利于发现和观察各种病变。限于技术本身要求，肠镜需经由肛门进镜，并约深入进镜一米左右方可到达末段的回肠，完成整个结肠的检查。在做肠镜的过程中会有一定痛苦，尤其对于过度肥胖、体质过瘦以及既往腹腔做过手术的病人，其痛苦性相对更大。

缺点二：粪便隐血试验(FOBT)是一种非侵入性的方法，用于检测粪便中肉眼不可见的血液，称为隐血，以确定是否有潜在的疾病，如结肠息肉、憩室病、痔疮、溃疡、炎症性肠病、结肠炎或大肠癌等会导致消化道出血的症状，如果粪便里有血，则表明消化道可能出血，即存在上述几种疾病的状况，其中就包括结直肠癌的早期征兆。大多数病例始于良性或无害的结肠息肉，其中一些有癌前病变或癌变，导致粪便经过时出血。FBOT存在的缺陷是，一些癌症和结肠息肉不出血，或者有贫血的症状，都可导致假阴性检测结果。而轻微的胃肠道感染，痔疮等非息肉或癌症情况，而不是息肉或癌症，可能导致假阳性结果。因此粪便隐血测试虽然具有无创、非侵入的优点，但灵敏度较低。

缺点三：部分基因检测的方法(如TP53基因)基于某些CRC相关基因的突变，但基因突变的发生并非导致CRC发生的直接原因，某些CRC发病阶段并未出现所要检测的基因突变情况。

缺点四：CRC发病及病程相关的信号通路有多元性，部分基于基因甲基化的CRC检测试剂盒所涉及的基因仅参与CRC病程发展1～2个信号通路(如WNT基因)。

发明内容

本发明的目的是提供用于结直肠癌检测的靶基因组合、引物和探针以及试剂盒，以提供一种大众化的无创检测技术，并进一步提升无创检测的效率、灵敏度及准确度。本发明是基于SDC2、BMP3、SFRP2、NDRG4基因序列甲基化变化情况对结直肠癌甲基化情况进行检测，将从粪便样本中提取的DNA进行重亚硫酸氢盐处理，再进行实时荧光定量PCR，经由信号参数进行判断，过程简化的同时为无创检测，便捷性高，对样本要求低，且检测效率、灵敏度及准确度更高。

为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种用于结直肠癌甲基化检测的靶基因组合，包括以下靶基因中的至少两种：SDC2、BMP3、NDRG4、SFRP2。

优选地，所述靶基因组合包括以下靶基因中的三种：SDC2、BMP3、NDRG4、SFRP2；更加优选地，所述靶基因组合包括：SDC2、BMP3、NDRG4和SFRP2。

进一步地，所述靶基因组合还包括内参基因：ACTB。

第二方面，本发明提供上述靶基因组合中各基因甲基化检测的引物和探针组合，其中，针对SDC2检测的引物如Seq_1～Seq_4所示，探针如Seq_5～Seq_6所示；针对BMP3检测的引物如Seq_7～Seq_8所示，探针如Seq_9所示；针对NDRG4检测的引物如Seq_10～Seq_11所示，探针如Seq_12所示；针对SFRP2检测的引物如Seq_13～Seq_14所示，探针如Seq_15所示。

进一步地，所述靶基因组合还包括内参基因：ACTB，针对ACTB检测的引物如Seq_16～Seq_17所示，探针如Seq_18所示。

第三方面，本发明提供上述靶基因组合和/或权利要求4或5所述的引物和探针组合在制备用于结直肠癌甲基化检测的试剂盒上的应用。

第四方面，本发明提供一种用于结直肠癌甲基化检测的试剂盒，包括：诊断标记物，以及上述引物和探针组合；所述诊断标记物包括上述靶基因组合，所述引物和探针组合用于对上述靶基因组合进行甲基化检测。

进一步地，所述诊断标记物还包括内参基因：ACTB。

进一步地，所述试剂盒还包括：阴性质控品、阳性质控品、qPCR反应预混液、引物探针预混液。

第五方面，本发明提供上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

步骤1，采用所述试剂盒，获得提取好并进行重亚硫酸盐转化处理的待检样本DNA；

步骤2，将处理后的待检样本DNA进行qPCR扩增；

步骤3，根据qPCR扩增结果进行数据分析。

优选地，所述步骤3中数据分析包括实验体系合格性判定和检测样本结果分析判定，实验体系合格性判定标准为：

针对HEX标记的ACTB基因，阳性质控品的Ct结果为：28≤Ct≤33；阴性质控品的Ct结果为：28≤Ct≤33；

针对ROX标记的SDC2基因，阳性质控品的Ct结果为：28≤Ct≤33；阴性质控品的Ct结果为：＞38或无Ct；

针对FAM标记的BMP3基因，阳性质控品的Ct结果为：28≤Ct≤33；阴性质控品的Ct结果为：＞38或无Ct；

针对Cy5标记的NDRG4基因，阳性质控品的Ct结果为：28≤Ct≤33；阴性质控品的Ct结果为：＞38或无Ct；

检测样本结果分析判定标准为：

针对ROX标记的SDC2基因，该基因检测阴性：＞38或无Ct；该基因检测阳性：Ct≤38；样本合格判定：HEX(ACTB)Ct≤36，则判定样本内参检测合格，本次检测有效；样本判定阳性：三个待检基因存在一个或多个检测为阳性；样本判定阴性：三个待检基因均检测为阴性；

针对FAM标记的BMP3基因，该基因检测阴性：＞38或无Ct；该基因检测阳性：Ct≤38；样本合格判定：HEX(ACTB)Ct≤36，则判定样本内参检测合格，本次检测有效；样本判定阳性：三个待检基因存在一个或多个检测为阳性；样本判定阴性：三个待检基因均检测为阴性；

针对Cy5标记的NDRG4基因，该基因检测阴性：＞38或无Ct；该基因检测阳性：Ct≤38；样本合格判定：HEX(ACTB)Ct≤36，则判定样本内参检测合格，本次检测有效；样本判定阳性：三个待检基因存在一个或多个检测为阳性；样本判定阴性：三个待检基因均检测为阴性。

相比于现有技术，本发明的技术效果为：

1.本发明的检测试剂盒对样本的要求低，适用于更便捷的无创采样方式，针对自然排出的日常粪便样本也可以作为检测材料，一方面可以不需要专业技术人员实施采样，受检人自行完成采样后即可通过普通快递进行寄送，免去了冷链运输的不变和过高的费用成本，且样本易于室温保存和运输；另一方面整个操作过程以无创方式进行，与肠镜检查相比提高了受检人的采样接受程度和便捷性；

2.本发明的检测试剂盒技术原理是基于DNA甲基化及荧光定量qPCR技术，因此可避免出血和不出血等差异性息肉或肿瘤病症情况对实验结果的影响。此外，在疾病发生发展过程中表观遗传学的改变通常早于疾病相关基因的突变情况，因此本发明的检测试剂盒与其它基于基因突变的PRC检测技术相比，表观遗传变化更适合作为疾病的分子标志物，避免了某些发病情况下没有受检基因发生突变而造成无检出可能的情况，检测效率、灵敏度及准确度更高。

附图说明

图1为本发明的试剂盒涉及的甲基化特异性PCR的技术原理图。

图2为实施例1中样本1的四种靶基因组合甲基化特异性PCR结果，其中，图A表示对样本1核酸成分进行质控结果图，图B表示四种靶基因和内参基因的甲基化特异性PCR扩增信号曲线。

图3为实施例2中样本2的四种靶基因组合甲基化特异性PCR结果，其中，图A表示对样本2核酸成分进行质控结果图，图B表示四种靶基因和内参基因的甲基化特异性PCR扩增信号曲线。

图4为实施例3中样本3的四种靶基因组合甲基化特异性PCR结果，其中，图A表示对样本3核酸成分进行质控结果图，图B表示四种靶基因和内参基因的甲基化特异性PCR扩增信号曲线。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供一种用于结直肠癌甲基化检测的靶基因组合，包括以下靶基因中的至少两种：SDC2、BMP3、NDRG4、SFRP2，还包括内参基因：ACTB。如果靶基因组合中低于2个靶基因，那么检测灵敏度及准确度则无法保证。目前在一些癌症相关研究中所选择的靶基因通常覆盖1～2个相关基因，存在较高的漏检率，所选择的靶基因类型也存在较大影响。本发明优选地靶基因组合包括以下靶基因中的三种：SDC2、BMP3、NDRG4、SFRP2；更加优选地，靶基因组合包括：SDC2、BMP3、NDRG4和SFRP2。本发明具体实施例中将SDC2、BMP3、NDRG4、SFRP2这4种基因组合形成用于结直肠癌甲基化检测的诊断标记物，可以获得对结直肠癌更精准的检测结果。这4个靶基因和1个内参基因的名称及探针荧光基团如表1所示。

表1靶基因名称及探针荧光基团

靶基因	探针荧光基团
		SDC2	ROX
BMP3	FAM
		NDRG4	Cy5.5
SFRP2	Cy5
		ACTB	HEX

进一步地，本发明还提供SDC2、BMP3、NDRG4、SFRP2这4种靶基因组合中各基因甲基化检测的引物和探针组合，其中，针对SDC2检测的引物如Seq_1～Seq_4所示，探针如Seq_5～Seq_6所示，其中Seq_1～Seq_2所示的引物用于扩增SCD2第1段的碱基，Seq_3～Seq_4所示的引物用于扩增SCD2第2段的碱基，Seq_5所示的探针用于SCD2第1段的碱基序列扩增信号指示，Seq_6所示的探针用于SCD2第2段的碱基序列扩增信号指示；针对BMP3检测的引物如Seq_7～Seq_8所示，探针如Seq_9所示；针对NDRG4检测的引物如Seq_10～Seq_11所示，探针如Seq_12所示；针对SFRP2检测的引物如Seq_13～Seq_14所示，探针如Seq_15所示；针对ACTB检测的引物如Seq_16～Seq_17所示，探针如Seq_18所示。具体的引物和探针序列如表2和表3所示：

表2引物序列

ACTB F	AATTTTGTAGGTTTTATT(Seq_16)
		ACTB R	TTACACCAACCTCATAAC(Seq_17)
SDC2(位点一)F	GAAGCGAGCGTTTTCGAGT(Seq_1)
		SDC2(位点一)R	CGAAACAAAATACCGCAA(Seq_2)
SDC2(位点二)F	TAGAGTCGGCGTAGTTATA(Seq_3)
		SDC2(位点二)R	TACACGCCGATTAACAAC(Seq_4)
BMP3 F	TGTATTCGGTCGCGTTT(Seq_7)
		BMP3 R	TCGCTACGAAACACTCG(Seq_8)
NDRG4 F	GTGTTTTTTAGGTTTCGC(Seq_10)
		NDRG4 R	CTACGCGACTAAAATACCC(Seq_11)
SFRP2 F	GTTTTAGTCGTCGGTTGT(Seq_13)
		SFRP2 R	GAAATTCGAACTTATCCC(Seq_14)

表3探针序列

ACTB	HEX-TACACCCACAACACTATCTTAAACA-BHQ1(Seq_18)
		SDC2(位点一)	ROX-TACGACTCAAACTCGAAAACTCGA-BHQ2(Seq_5)
SDC2(位点二)	ROX-AACCAATAAACGCCGCGACTCC-BHQ2(Seq_6)
		BMP3	FAM-TTCGTGCGTTTTCGTTTTAGTTG-BHQ1(Seq_9)
NDRG4	Cy5.5-GGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTT-BHQ3(Seq_12)
		SFRP2	Cy5-CCGCTCTCTTCGCTAAATACGA-BHQ2(Seq_15)

本发明还提供上述靶基因组合和/或上述引物和探针组合在制备用于结直肠癌甲基化检测的试剂盒上的应用。

本发明还提供一种用于结直肠癌甲基化检测的试剂盒，包括：上述引物和探针组合，所述引物和探针组合用于对上述靶基因组合进行甲基化检测。所涉及的检测原理如图1所示，由于甲基化DNA在CpG岛的胞嘧啶被甲基修饰，而非甲基化的DNA胞嘧啶则无甲基修饰，因此通过重亚硫酸盐转化处理后，甲基化的胞嘧啶将保持不变，仍为C碱基，而非甲基化的胞嘧啶将转变为尿嘧啶，即U碱基，从而使原始序列相同的甲基化与非甲基化的序列产生差异，前者将通过序列特异性引物和探针在PCR体系内下获得扩增，从而使含有甲基化靶序列的样品在最终的扩增体系内产生荧光信号。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

以下实施例中，qPCR扩增结果进行数据分析的实验体系合格性判定和检测样本结果分析判定标准分别如表4和表5所示：

表4实验体系合格性判定

表5检测样本结果分析判定

实施例1

本实施例将SDC2、BMP3、NDRG4、SFRP2这4种基因组合用于结直肠癌甲基化检测的诊断标记物，所采用的样本1(MH008)：粪便，患者信息：男，49岁，中段直肠癌cT3N+M0，采用XELOX化疗，2021年放疗第1化，第2化当天采样。具体如下：

I.样本要求

1.采用活塞式采样管戳取足量的5～10g粪便样本，并推动推杆使粪便样本掉入内含粪便保存液的收集管内，取样后样本管内的液面不多于25mL刻度标注。具体步骤参见采样盒使用说明书。

2.样本保存：上述采集后的粪便样本在4天内送达检测实验室。样本可在-20℃±5℃储存12个月，最长可存储12个月；如果超过12个月，需重新采样。

3.提取后的DNA在-20℃±5℃保存时间不超过2个月，转化后的DNA在-20±5℃可保存至多2个月。无论粪便样本、提取好的DNA及转化后的DNA，均不应反复冻融超过3次，以免影响检测效果。

II.检验方法

一、样本DNA提取及纯化(样本制备区)

1.按照核酸提取试剂盒(广州奇辉生物科技有限公司，粤穗械备20230003和粤穗械备20230004)说明书进行操作。

2.在进行DNA提取及纯化时，设置一管NTC对照，具体参照核酸提取纯化试剂盒内说明书。

二、扩增体系准备(试剂准备区)

1.将PCR反应液A以及PCR反应液B插入冰盒中，自然融化，并计算需准备的扩增试剂反应个数，即：

反应个数(N)＝待检样本数(n)+阴性质控品+阳性质控品

其中，PCR反应液A为：DNA聚合酶、dNTPs、PCR buffer的混合液；PCR反应液B为：引物、探针的混合液。

2.在一个无DNA酶的EP管中，加入1.1倍N的PCR反应液A和PCR反应液B，即扩增试剂配制，如表6所示：

表6反应液配制

反应组分	待测样本反应管	阳性质控管	阴性质控管
				PCR反应液A	12.5μL	12.5μL	12.5μL
PCR反应液B	9.5μL	9.5μL	9.5μL

扩增试剂配制＝1.1×N×12.5μL(PCR反应液A)+1.1×N×9.5μL(PCR反应液B)。

3.试剂配制完成后，涡旋振荡器混匀并瞬时离心。

4.按照每个扩增反应用量22μL将配制好的扩增试剂分装到PCR八联管。

三、加样(样本制备区)

1.按照表7加入对应反应体系的模板成分。

表7PCR反应加样方式

2.体系配制完成后，涡旋振荡器混匀并瞬时离心。

四、PCR扩增(基因扩增区)

按照表8所示的程序设置PCR的反应条件，将PCR管(板)放入PCR仪中开始扩增反应。

表8PCR荧光通道及程序设置

参照表1和表2进行实验体系合格性判定和检测样本结果分析判定。测试结果：样本1的四靶基因甲基化均为阳性；结果如图2所示，其中，图A为对所提取的临床样本核酸成分进行质控，将人源ACTB基因作为内参基因，通过普通PCR扩增ACTB条带，基于ACTB条带在电泳凝胶上的预期位置出现与否及条带强度作为样本质控判断依据，Lane 1NC为阴性对照样本(无模板对照)，Lane 1PC为WBC gDNA样本(白细胞基因组DNA)，Lane 3-4为2名非结直肠癌受试者的粪便样品(随机样品)，Lane 5为样本1；图B为从样本1中提取的核酸作为检测材料，通过重亚硫酸盐作用获得转化后的核酸样本，经位点甲基化特异性的荧光探针多重qPCR对四个靶基因和一个内参基因进行检测获得的荧光定量qPCR扩增信号曲线，表明样本1的四靶基因甲基化均为阳性。

同时，对样本1的患者采用常规结直肠镜检测，同样确认为结直肠癌病症个体，本试剂盒检测结果与肠镜检查结果一致。

实施例2

本实施例将SDC2、BMP3、NDRG4、SFRP2这4种基因组合用于结直肠癌甲基化检测的诊断标记物，所采用的样本2(MH034)：粪便，患者信息：男，76岁，中段直肠癌cT3N×M0，未手术，采用卡培他滨+PD-1结合治疗，2022年第1化，3周后开始放疗，再3周后第3化，当天采样。具体过程同实施例1。

参照表1和表2进行实验体系合格性判定和检测样本结果分析判定。测试结果：SDC2与NDRG4两个靶基因甲基化阳性；结果如图3所示，其中，图A为对所提取的临床样本核酸成分进行质控，将人源ACTB基因作为内参基因，通过普通PCR扩增ACTB条带，基于ACTB条带在电泳凝胶上的预期位置出现与否及条带强度作为样本质控判断依据，Lane 1NC为阴性对照样本，Lane 1PC为WBC gDNA样本，Lane 3-4为2名非结直肠癌受试者的粪便样品(随机样品)，Lane 5为样本2；图B为从样本1中提取的核酸作为检测材料，通过重亚硫酸盐作用获得转化后的核酸样本，经位点甲基化特异性的荧光探针多重qPCR对四个靶基因和一个内参基因进行检测获得的荧光定量qPCR扩增信号曲线，表明样本2的SDC2与NDRG4两个靶基因甲基化为阳性。

同时，对样本2的患者采用常规结直肠镜检测，同样确认为结直肠癌病症个体，本试剂盒检测结果与肠镜检查结果一致。

实施例3

本实施例将SDC2、BMP3、NDRG4、SFRP2这4种基因组合用于结直肠癌甲基化检测的诊断标记物，所采用的样本3(MH014)：粪便，患者信息：男，76岁，中段直肠癌cT3N×M0，未手术，采用卡培他滨+PD-1结合治疗，2022年第1化，第2天采样。具体过程同实施例1。

参照表1和表2进行实验体系合格性判定和检测样本结果分析判定。测试结果：SDC2、BMP3、NDRG4三基因甲基化阳性。结果如图4所示，其中，图A为对所提取的临床样本核酸成分进行质控，将人源ACTB基因作为内参基因，通过普通PCR扩增ACTB条带，基于ACTB条带在电泳凝胶上的预期位置出现与否及条带强度作为样本质控判断依据，Lane 1NC为阴性对照样本，Lane 1PC为WBC gDNA样本，Lane 3-4为2名非结直肠癌受试者的粪便样品(随机样品)，Lane 5为样本2；图B为从样本1中提取的核酸作为检测材料，通过重亚硫酸盐作用获得转化后的核酸样本，经位点甲基化特异性的荧光探针多重qPCR对四个靶基因和一个内参基因进行检测获得的荧光定量qPCR扩增信号曲线，表明样本3的SDC2、BMP3、NDRG4三个靶基因甲基化为阳性。

同时，对样本3的患者采用常规结直肠镜检测，同样确认为结直肠癌病症个体，本试剂盒检测结果与肠镜检查结果一致。

本发明的优点具体为：

1.本发明检测试剂盒中的诊断标记物对结直肠癌检测的准确度更高，目前已有的基于基因甲基化进行CRC检测的试剂盒通常覆盖1～2个疾病相关基因的甲基化变化情况，本发明试剂盒优选应用了CRC发病过程中涉及的四个不同基因的甲基化变化情况，覆盖更多信号通路。

2.本发明的检测试剂盒对样本的要求低，适用于更便捷的无创采样方式：本发明可适用自然排出的日常粪便样本作为检测材料，一方面不需要专业技术人员实施采样，另一方面整个操作过程以无创方式进行，与肠镜检查相比提高了受检人的采样接受程度和便捷性；

3.本发明的检测试剂盒避免了出血和不出血等差异性息肉或肿瘤病症情况对实验结果的影响：技术原理基于DNA甲基化及荧光定量qPCR技术，与粪便隐血试验(FOBT)相比，对样本的要求相对更低；

4.检测样本易于室温保存和运输，与血液样本相比，不需要昂贵的冷链运输，受检人自行完成采样后即可通过普通快递进行寄送，免去了冷链运输的不变和过高的费用成本；

5.避免了某些发病情况下没有受检基因发生突变而造成无检出可能的情况，在疾病发生发展过程中表观遗传学的改变通常早于疾病相关基因的突变情况，因此与其它基于基因突变的PRC检测技术相比，表观遗传变化更适合作为疾病的分子标志物。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于结直肠癌甲基化检测的靶基因组合，其特征在于，所述靶基因组合包括以下靶基因中的至少两种：SDC2、BMP3、NDRG4、SFRP2。

2.根据权利要求1所述的一种用于结直肠癌甲基化检测的靶基因组合，其特征在于，优选地，所述靶基因组合包括以下靶基因中的三种：SDC2、BMP3、NDRG4、SFRP2；更加优选地，所述靶基因组合包括：SDC2、BMP3、NDRG4和SFRP2。

3.根据权利要求1或2所述的一种用于结直肠癌甲基化检测的靶基因组合，其特征在于，所述靶基因组合还包括内参基因：ACTB。

4.权利要求1～3任意一项所述的靶基因组合中各基因甲基化检测的引物和探针组合，其特征在于，针对SDC2检测的引物如Seq_1～Seq_4所示，探针如Seq_5～Seq_6所示；针对BMP3检测的引物如Seq_7～Seq_8所示，探针如Seq_9所示；针对NDRG4检测的引物如Seq_10～Seq_11所示，探针如Seq_12所示；针对SFRP2检测的引物如Seq_13～Seq_14所示，探针如Seq_15所示。

5.根据权利要求4所述的引物和探针组合，其特征在于，所述靶基因组合还包括内参基因：ACTB，针对ACTB检测的引物如Seq_16～Seq_17所示，探针如Seq_18所示。

6.权利要求1～3任意一项所述的靶基因组合和/或权利要求4或5所述的引物和探针组合在制备用于结直肠癌甲基化检测的试剂盒上的应用。

7.一种用于结直肠癌甲基化检测的试剂盒，其特征在于，包括：诊断标记物，以及权利要求4或5所述的引物和探针组合；所述诊断标记物包括权利要求1～3任意一项所述的靶基因组合，所述引物和探针组合用于对所述靶基因组合进行甲基化检测。

8.根据权利要求7所述的用于结直肠癌甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述诊断标记物还包括内参基因：ACTB。

9.根据权利要求7或8所述的用于结直肠癌甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阴性质控品、阳性质控品、qPCR反应预混液、引物探针预混液。

10.权利要求7～9任意一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，采用所述试剂盒，获得提取好并进行重亚硫酸盐转化处理的待检样本DNA；

步骤2，将处理后的待检样本DNA进行qPCR扩增；

步骤3，根据qPCR扩增结果进行数据分析；

优选地，所述步骤3中数据分析包括实验体系合格性判定和检测样本结果分析判定，实验体系合格性判定标准为：

针对HEX标记的ACTB基因，阳性质控品的Ct结果为：28≤Ct≤33；阴性质控品的Ct结果为：28≤Ct≤33；

针对ROX标记的SDC2基因，阳性质控品的Ct结果为：28≤Ct≤33；阴性质控品的Ct结果为：＞38或无Ct；

针对FAM标记的BMP3基因，阳性质控品的Ct结果为：28≤Ct≤33；阴性质控品的Ct结果为：＞38或无Ct；

针对Cy5标记的NDRG4基因，阳性质控品的Ct结果为：28≤Ct≤33；阴性质控品的Ct结果为：＞38或无Ct；

检测样本结果分析判定标准为：

针对ROX标记的SDC2基因，该基因检测阴性：＞38或无Ct；该基因检测阳性：Ct≤38；样本合格判定：HEX(ACTB)Ct≤36，则判定样本内参检测合格，本次检测有效；样本判定阳性：三个待检基因存在一个或多个检测为阳性；样本判定阴性：三个待检基因均检测为阴性；

针对FAM标记的BMP3基因，该基因检测阴性：＞38或无Ct；该基因检测阳性：Ct≤38；样本合格判定：HEX(ACTB)Ct≤36，则判定样本内参检测合格，本次检测有效；样本判定阳性：三个待检基因存在一个或多个检测为阳性；样本判定阴性：三个待检基因均检测为阴性；

针对Cy5标记的NDRG4基因，该基因检测阴性：＞38或无Ct；该基因检测阳性：Ct≤38；样本合格判定：HEX(ACTB)Ct≤36，则判定样本内参检测合格，本次检测有效；样本判定阳性：三个待检基因存在一个或多个检测为阳性；样本判定阴性：三个待检基因均检测为阴性。