CN108103195A

CN108103195A - 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用

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Publication number: CN108103195A
Application number: CN201810061125.3A
Authority: CN
Inventors: 徐赛涛; 李杨; 刘荣兵
Original assignee: Shanghai Cool Biology Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Cool Biology Technology Co Ltd
Priority date: 2018-01-22
Filing date: 2018-01-22
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2038-01-22
Also published as: CN108103195B

Abstract

本发明涉及一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针，其包括用于检测Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2基因甲基化的引物对和探针以及内参ACTB的引物对和探针，所述引物对和探针的序列如SEQ ID No：1‑SEQ ID No：18所示。本发明还提供了一种含有上述引物对和探针的试剂盒及其应用，该应用方法包括血浆标本游离DNA提取、亚硫酸盐转化、PCR扩增反应及荧光信号检测和结果判定。本发明所述的试剂盒及方法适用于定性检测人外周血中Spetin9、THBD、SDC2、NDRG4和BMP3五个基因的甲基化检测，其与常规的结直肠癌诊断方法相比，本发明充分利用了血浆游离DNA提取、DNA甲基化处理和QPCR相关联技术，开发出具有高灵敏度性、高特异性的试剂盒，对人结直肠癌进行早期无创筛查。

Description

一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，尤其涉及一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用。

背景技术

结直肠癌是人类消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，据统计，结直肠癌的发病率居全球恶性肿瘤第3位，随着人们生活习惯的改变，结直肠癌的发病率和死亡率均明显上升，严重威胁人类的健康。结直肠癌发生的病因尚不明确，一般认为是多因素、多步骤的过程。因此，深入研究结直肠癌发生发展的分子机制，对揭示结直肠癌的发病机制、疾病预防、明确诊断、药物合理应用和判断预后有重要意义，有助于提高我国结直肠癌诊治水平和降低发肠癌的发病率和死亡率。现如今DNA甲基化已成为公认的肿瘤发生的机制之一，DNA甲基化是在未改变DNA序列的情况下在CpG岛5'端胞嘧啶加上甲基基团，从而使该DNA的表达沉默，导致病变的发生。在离体实验中，用某些药物可以使甲基化的基因去甲基化，从而使该基因重新活化，因此，研究基因启动子区的甲基化，将为恶性肿瘤的治疗提供有意义的靶点，另外，DNA异常甲基化要早于细胞恶变的发生，可以预测肿瘤的发生，从而为结直肠癌的诊断和治疗提供重要依据。

在正常基因组上，70％～80％的CpG均发生甲基化，而CpG岛(启动子上富含CpG的区域)通常未发生甲基化。在肿瘤组织上则相反，表现为全基因组的低甲基化和启动子区域，特别是抑癌基因启动子的过度甲基化。全基因组的低甲基化可引起基因组的不稳定及可激活正常情况下沉默的基因区域如原癌基因，启动子区域的过度甲基化则使抑癌基因、DNA修复基因、细胞周期控制基因、调亡基因等发生异常沉默。研究表明，结直肠癌可有多种基因的异常甲基化，这些基因的启动子发生高甲基化后被沉默，进而促进结直肠癌的形成与发展。肿瘤组织的多启动子甲基化可形成CpG岛甲基化表型(CpG island methylatorphenotype，CIMP)，CIMP与老年、女性、结直肠癌家庭史、近端结肠、黏液性细胞的分化、特异性癌前病变、吸烟、MSI及KRAS和BRAF突变相关。结直肠癌的发生和发展是一个多步骤的过程，DNA异常甲基化可贯穿于肿瘤发展的所有阶段。研究显示，至少有6种甲基化基因(SLC5A8、SFRP1、SFRP2、CDH13、CRBP1和RUNX3)和2个甲基化位点(MINT1和MINT31)存在于正常结肠上皮组织到异常肠隐窝病灶阶段；其他一些基因(p14、HLTF、ITGA4、CDKN2A/p16、CDH1和ESR1)常发现于从异常肠隐窝病灶到息肉或腺瘤的阶段；而TIMP3、CXCL12、ID4和IRF8基因可出现在息肉到癌变组织的阶段；DNA修复基因MGMT和hMLH1甲基化在从息肉到癌变的过程亦起着重要的作用。基质细胞中编码SPARC基因的甲基化与结直肠癌的淋巴管浸润转移相关。

目前临床主要运用两种方法进行CRC筛查：粪便潜血试验(FOBT)和结肠镜检查。FOBT主要包括gFOBT(愈创木脂粪便潜血试验)、iFOBT(免疫粪便潜血试验)和FIT(人体血红蛋白特异性粪便免疫化学试验)。作为常规使用的筛查方法，gFOBT易受食物、药物和其他因素的影响，可导致假阳性结果，且稳定性较差；IFOBT的敏感度和特异性明显优于gFOBT，但此检测仍然是定性试验，如果样品采集后放置过久(超过5d)，其检出率明显下降；FIT与IFOBT检测相似，其敏感度较高，但价格更昂贵。相比之下，结肠镜检查是侵入性的，需要肠道准备，以确保大肠管腔视野良好。另外，肠镜检查有一系列并发症，如肠活检部位出血、肠穿孔和感染；该检查有多种禁忌证，如严重的心脏疾病、心肺功能不全、急性腹泻、严重溃疡性结肠炎、结肠克罗恩病、腹膜炎和妊娠等。因此，无论是FIT还是结肠镜检查，患者依从性均较差。上海市疾病预防控制中心监测显示，仅有不到5％的上海市民做过粪便隐血试验检查，3％做过肠镜检查。目前，亟待更方便、更准确的CRC检查方法以提高筛查率。

糖蛋白类肿瘤标记物的主要缺点是任何单一标志物的灵敏度和特异性都不高，不足以成为癌症的可靠诊断指标。近5年来，以血浆检测为基础的基因甲基化测试为CRC的早期诊断提供了较有前景的筛查方法。迄今为止的临床筛查试验证明，基因甲基化是肿瘤发生过程中早期的特异性生物标志物。在CRC的早期阶段，Septin9基因和NDRG4基因甲基化的DNA从坏死或凋亡的肿瘤细胞被释放到外周循环血液，通过检测外周血基因的甲基化水平可以判定CRC的患病风险。

SEPT9基因位于染色体17q25.3，Septin家族是一组高度保守的GTP结合蛋白，广泛存在于人类细胞，它们在细胞分裂过程中提供结构支撑。CRC的早期诊断检测试剂盒EpiProColon(EpigenomicsAG，德国)，其检测的靶片段就是SEPT9_V2的这一信息最丰富的区域。虽然在结直肠癌组织及患者外周血中检测到的SEPT9基因发生异常甲基化，但SEPT9基因异常甲基化不仅发生在结直肠癌，也发生在乳腺癌、卵巢癌、头颈部癌症、白血病和淋巴瘤。然而，这些癌症患者血浆中的SEPT9基因异常甲基化的检出率远不如结直肠癌。Grutzmann等对SEPT9基因在各种肿瘤及非肿瘤疾病患者血浆的甲基化水平进行了系统研究，结果显示，结直肠癌患者血浆SEPT9甲基化的检出率(72％，90/125)远高于非结直肠癌的其他癌症患者(11.5％，11/96)、非癌症疾病患者(13％，41/315)及正常人(10％，19/183)。这一结果说明血浆中SEPT9甲基化对结直肠癌有较高的灵敏度和特异性，与其他癌症、非癌症疾病和正常人有显著性的差异，这为SEPT9甲基化作为结直肠癌特有诊断指标提供了依据。

2013年结束的PRESEPT研究是迄今为止唯一一个利用SEPT9检测了7941人所进行的前瞻性筛查，结果发现，SEPT9检测对CRC筛查的敏感度为48％，此敏感性相对之前的回顾性验证试验的敏感度偏低。这是因为在这个特定的研究中，作者研究SEPT9检测对早期无症状大肠癌患者的敏感度，而此前公布的临床验证数据来源于已经诊断为CRC和为方便抽样选择的患者或正常人，这不代表无症状人群的状况，因而其参考意义有限。这项前瞻性研究所代表的情况是在现实生活中大肠癌筛查遇到的实际情况，因此比病例对照研究具有更好的临床指导意义。

这些数据表明，由于敏感度较低，单独使用SEPT9检测对CRC的早期诊断有限。

NDRG4是一个大肠癌的抑癌基因，NDRG4启动子的甲基化，导致抑癌功能丧失，癌细胞恶性增殖，可作为大肠癌早期诊断的生物标志物。在针对多名大肠癌病人(CRC)经肠镜确诊的CRC病例和阴性对照的研究报道中，都表明可以在CRC病人的血浆中检测到Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2基因的甲基化DNA。

因此若实现Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2五个基因的联合诊断，将大大提高大肠癌早期诊断灵敏度和特异性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用，本发明提供的试剂盒敏感性好、特异性高、准确可靠和快速方便，适用于结直肠癌的早期诊断。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针，其包括分别用于检测Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2基因甲基化的引物对和探针；其中

用于检测Spetin9基因甲基化的引物对为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示序列，探针为SEQ ID No：3所示序列；

用于检测NDRG4基因甲基化的引物对为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5所示序列，探针为SEQ ID No：6所示序列；

用于检测BMP3基因甲基化的引物对为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8所示序列，探针为SEQ ID No：9所示序列；

用于检测THBD基因甲基化的引物对为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11所示序列，探针为SEQ ID No：12所示序列；

用于检测SDC2基因甲基化的引物对为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14所示序列，探针为SEQ ID No：15所示序列。

进一步地，上述用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针还包括内参ACTB的引物对和探针，其中内参ACTB的引物对为SEQ ID No：16和SEQ ID No：17所示序列，探针为SEQ ID No：18所示序列。

上述引物及探针的核苷酸序列如下表所示：

表1引物和探针序列表

进一步地，各所述探针的5'端标记有荧光报告染料，3'端标记有淬灭荧光染料，所述荧光报告染料选自FAM、ROX、CY5、VIC、HEX、JOE等，所述淬灭荧光染料选自BHQ、TAMRA等。

本发明的第二个目的是提供一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的试剂盒引物对和探针，其包括游离DNA提取试剂、亚硫酸盐转化试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂、阳性对照品、阴性对照品；其中，所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂如上所述的用于检测Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2基因甲基化的引物对和探针和/或内参ACTB的引物对和探针。

为了进一步优化上述试剂盒，本发明所采取的技术措施还包括：

进一步地，所述游离DNA提取试剂包括裂解液、蛋白酶混合液、磁珠、洗涤液和洗脱液；所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂还包括PCR扩增缓冲液、UNG酶和DNA聚合酶；阳性对照品采用牛血清白蛋白、人基因组DNA，阴性对照品采用DEPC H₂O。

进一步地，每一对应的引物对与探针的摩尔比为2：1。

进一步地，每一引物对中的各引物的终浓度均为200nM，各探针的终浓度均为100nM。

进一步地，所述游离DNA提取试剂以及亚硫酸盐转化试剂均采用市售的试剂盒。

本发明的第三个目的是提供一种上述试剂盒基于非诊断和非治疗目的在早期结直肠癌检测中的应用。

为了进一步优化上述应用，本发明所采取的技术措施还包括：

进一步地，上述应用包括如下的早期结直肠癌的检测步骤(非诊断和非治疗的目的)：

步骤1)收集样本，并将样本混匀后进行游离DNA的提取；

步骤2)对步骤1)提取的DNA样本进行亚硫酸盐转化；

步骤3)采用用于检测Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2基因甲基化的引物对和探针和/或内参ACTB的引物对和探针的引物对和探针对步骤2)亚硫酸盐转化后的DNA样本进行实时荧光定量PCR扩增反应(QPCR)；

步骤4)对步骤3)PCR扩增完成的DNA样本进行荧光信号检测和结果判定。

进一步地，所述步骤1)中的样本为全血样本，其采用市售的游离DNA提取试剂盒提取，取15ml全血标本，按照试剂盒说明书中的操作步骤提取游离DNA，最后用60ul洗脱液洗脱DNA。

进一步地，所述步骤1)中游离DNA的提取包括DNA裂解及结合、DNA洗涤以及洗脱。

进一步地，所述亚硫酸盐转化步骤包括亚硫酸盐转化、结合步骤、第一次洗涤、脱磺基、第二次洗涤、第三次洗涤、第四次洗涤、干燥以及洗脱。

进一步地，所述步骤3)中PCR扩增反应体系为35.0μl，DNA样本为15.0μl。

进一步地，所述步骤3)中PCR扩增反应体系包括PCR反应液，六条特异性正、反向引物和六条特异性探针混合液(SEQ ID No.1-SEQ ID No.18)，DNA聚合酶，DEPC水，PCR质控品，样本游离DNA核酸；其中，所述特异性引物和探针是针对Spetin9、THBD、SDC2、NDRG4和BMP3五个靶标的特异性引物扩增区内设计，能够区别其他序列。

进一步地，每一对应的引物对和探针的摩尔比为2：1。

进一步地，每一引物对中的各引物的终浓度为200nM，各探针的终浓度均为100nM。

进一步地，所述步骤3)中PCR扩增的反应条件是：50℃UNG酶反应2min；95℃变性5min；95℃变性5s，55℃退火和延伸35s，45个循环。

进一步地，所述Spetin9探针5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；所述NDRG4探针5'端标记有报告荧光染料ROX，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；所述BMP3探针5'端标记有报告荧光染料CY5，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；所述THBD探针5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；所述SDC2探针5'端标记有报告荧光染料ROX，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ。

进一步地，步骤4)中DNA样本的结果判定步骤如下：如果单次PCR扩增中Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2五个基因中的至少两个基因为阳性，则样本的测试结果为“阳性”；如果单次PCR扩增中Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2五个基因中的任意一个基因为阳性，则需要重复检测三次，三次结果中至少两次为阳性时，则样本的测试结果为“阳性”；如果结果为其它情况，视为无效。

进一步地，所述DNA样本的结果判定具有如下前提：内参ACTB显示单个反应中加入DNA的量是足够的。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明基于荧光PCR方法，采用Taqman探针法定性检测人外周血中Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2五个基因的甲基化，对大肠癌的早期诊断提供参考，这对于那些由于害怕肠镜检查的痛苦而拒绝进行肠镜筛查的人，多了一种非创性结直肠癌诊断方法的选择。

与市面上商业化试剂盒相比，本试剂盒具有如下优势：

1)本发明试剂盒临床样本为患者外周血，取样方便、无创。

2)本发明试剂盒检测结果准确，兼有QPCR高灵敏度和特异性的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化。

3)本发明试剂盒采用多色荧光PCR检测技术，5个基因检测只用两个管子检测即可，完全闭管操作，同时在反应体系里面增加了UNG酶防污染系统，有效地降低了污染。

4)本发明试剂盒对整个检测过程进行了优化，检测速度快，步骤简单。

5)本发明试剂盒采用多基因联合检测技术，避免了市场上常用的单基因检测的灵敏度和特异性低的缺点，更适合用于结直肠癌早筛。

附图说明

图1是结直肠癌QPCR特异性检测结果示意图；其中，纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量QPCR扩增的循环数，Ct值为达到阈值线所需要的循环数；Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2A分别表示结直肠癌阳性样本五个甲基化核酸检测结果；正常样本无扩增曲线。

图2至图6是结直肠癌Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2A五个甲基化基因检测灵敏度结果示意图；其中，纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量QPCR扩增的循环数，Ct值为达到阈值线所需要的循环数，图中从高到低浓度的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²质粒浓度进行扩增检测的结果。

具体实施方式

本发明提供了一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针，其包括分别用于检测Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2基因甲基化的引物对和探针，所述引物对和探针的序列如SEQ ID No：1-SEQ ID No：15所示，其还可包括如SEQ ID No：16-18所示的内参ACTB的引物对和探针。本发明还提供了一种含有上述引物对和探针的用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的试剂盒及其应用。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例为用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针，其包括包括分别用于检测Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2基因甲基化的引物对和探针以及内参ACTB的引物对和探针；其中

用于检测SDC2基因甲基化的引物对为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14所示序列，探针为SEQ ID No：15所示序列；

内参ACTB的引物对为SEQ ID No：16和SEQ ID No：17所示序列，探针为SEQ ID No：18所示序列；

其中，所述Spetin9探针5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；所述NDRG4探针5'端标记有报告荧光染料ROX，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；所述BMP3探针5'端标记有报告荧光染料CY5，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；所述THBD探针5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；所述SDC2探针5'端标记有报告荧光染料ROX，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；所述内参ACTB探针5'端标记有报告荧光染料VIC，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ

实施例2

本实施例为含有实施例1所述的引物对和探针的用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的试剂盒。

上述试剂盒包括游离DNA提取试剂、亚硫酸盐转化试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂、阳性对照品、阴性对照品；其中，游离DNA提取试剂、亚硫酸盐转化试剂均采用市售的试剂盒，所述游离DNA提取试剂具体包括裂解液、蛋白酶混合液、磁珠、洗涤液一、洗涤液二和洗脱液，所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂包括PCR扩增缓冲液、如SEQ ID No：1-SEQID No：18所述的引物和探针、UNG酶和DNA聚合酶，引物和探针的对应关系具体如表1所示；所述阳性对照品采用牛血清白蛋白、人基因组DNA，阴性对照品采用DEPC H₂O。

实施例3

本实施例为采用实施例2所述的试剂盒来检测早期结直肠癌的方法。

1.材料、试剂、仪器

游离DNA提取试剂盒、亚硫酸盐转化试剂盒、荧光定量PCR仪为ABI7500。

2.样本准备

阳性对照采用牛血清蛋白和人基因组DNA，然后用DEPC水进行不同倍数的稀释，阴性对照标本为DEPC H₂O；待处理样本为患者的外周血。

3.游离DNA的提取和亚硫酸盐转化

按照游离DNA提取试剂盒的说明书对15ml样本进行游离DNA提取，其包括DNA裂解及结合、DNA洗涤和洗脱，其中最后用60μl洗脱液洗脱得到的DNA即为所要提取的DNA；按照亚硫酸盐转化试剂盒进行DNA样本的亚硫酸盐转化，其包括亚硫酸盐转化、结合步骤、第一次洗涤、脱磺基、第二次洗涤、第三次洗涤、第四次洗涤、干燥以及洗脱。

4.样本PCR扩增反应

4.1样本加样：在准备好试剂(引物、标记报告荧光染料和淬灭荧光染料的探针、PCR扩增缓冲液、UNG酶和DNA聚合酶)的PCR反应管中分别加入待测样本DNA、阴性质控品、阳性质控品，每管35μL PCR反应液中各加15μL样本DNA，盖紧管盖后，瞬时低速离心；其中，引物和探针的摩尔比为2:1，各引物的终浓度均为200nM，探针的终浓度均为100nM。注意：密封后的PCR板可在2-8℃最多放置4小时。

4.2QPCR反应平台：

QPCR扩增的反应条件是：50℃UNG酶反应2min；95℃变性5min；95℃变性5s，55℃退火和延伸35s，45个循环。

5.样本检测及结果判定

对PCR扩增完成的DNA样本进行荧光信号检测和结果判定，其结果判定步骤如下：如果内参ACTB显示单个反应中加入DNA的量足够的话，那么在单次PCR扩增中Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2五个基因，至少有两个基因为阳性，则病人样本的测试结果为“阳性”；如果有任意一个基因为阳性，则需要重复检测三次，三次结果中至少两次为阳性，则样本的测试结果为“阳性”，如果结果为其它情况，视为无效。

实施例4

本实施例采用实施例3所示的试剂盒进行特异性试验、灵敏性试验以及临床样本的检测。各实验结果如下所示：

1.特异性试验结果：如图1所示，依据本发明建立的QPCR方法对结直肠癌具有较好的特异性，对正常样本和空白对照流感病毒等均无交叉反应。

2.灵敏性试验结果：对Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2五个甲基化基因，使用质粒样本按照10⁶copies/ul、10⁵copies/ul、10⁴copies/ul、10³copies/ul、10²copies/ul的质粒浓度进行扩增，如图2-6所示结果表明QPCR方法检测敏感性达到10²copies/ul。

3.临床样本的检测结果：在100例正常人血液样本中均未检出，在30例结直肠癌患者样本中检出30例，与正常组相比P＜0.001，结果显示，多基因联合甲基化检测试剂盒其灵敏度和特异性均高于单一基因甲基化检测。

由上述实施例可知，本发明所述的试剂盒及方法适用于定性检测人外周血中Spetin9、THBD、SDC2、NDRG4和BMP3五个基因的甲基化检测，为大肠癌的早期诊断提供参考。与常规的结直肠癌诊断方法相比，本发明充分利用了血浆游离DNA提取、DNA甲基化处理和QPCR相关联技术，开发出具有高灵敏度性、高特异性的试剂盒，对人结直肠癌进行早期无创筛查。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海酷乐生物科技有限公司

<120> 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Spetin9 正向引物(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgattcgtt gtttattagt t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Spetin9 反向引物(Artificial Sequence)

<400> 2

ccttcgaaat ccgaaataat 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Spetin9 探针(Artificial Sequence)

<400> 3

atttcgcggt taacgcgtag ttg 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> NDRG4 正向引物(Artificial Sequence)

<400> 4

ctaaataaag attacggtag cgtc 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> NDRG4 反向引物(Artificial Sequence)

<400> 5

cgaactatac taaatacgct acg 23

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> NDRG4 探针(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcgggaatt cgacgtcgc 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> BMP3 正向引物(Artificial Sequence)

<400> 7

ttggaaaagg taatcgagc 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> BMP3 反向引物(Artificial Sequence)

<400> 8

ctattttaaa cgccaaatcg 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> BMP3 探针(Artificial Sequence)

<400> 9

ttcggatcgt tgcgtatagt ttcg 24

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> THBD 正向引物(Artificial Sequence)

<400> 10

gagttttggt cgattcgtat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> THBD 反向引物(Artificial Sequence)

<400> 11

cccaacccaa acacttctta 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> THBD 探针(Artificial Sequence)

<400> 12

ttcgtagggg ttgcgcgtag 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> SDC2 正向引物(Artificial Sequence)

<400> 13

cgtagtcgcg gagttagt 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> SDC2 反向引物(Artificial Sequence)

<400> 14

cgcgactaaa actccgaa 18

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> SDC2 探针(Artificial Sequence)

<400> 15

tcgtttggac gcgttgtttt ttag 24

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 内参ACTB 正向引物(Artificial Sequence)

<400> 16

aagacctgta cgmcaacac 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 内参ACTB 反向引物(Artificial Sequence)

<400> 17

ggagcaatga tcttgatctt 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 内参ACTB 探针(Artificial Sequence)

<400> 18

tctggcggca ccaccatgta cc 22

Claims

1.一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针，其特征在于，包括分别用于检测Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2基因甲基化的引物对和探针；其中

2.根据权利要求1所述的用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针，其特征在于，还包括内参ACTB的引物对和探针，其中内参ACTB的引物对为SEQ ID No：16和SEQ ID No：17所示序列，探针为SEQ ID No：18所示序列。

3.根据权利要求2所述的用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针，其特征在于，各所述探针的5'端标记有荧光报告染料，3'端标记有淬灭荧光染料，所述荧光报告染料选自FAM、ROX、CY5、VIC、HEX、JOE，所述淬灭荧光染料选自BHQ、TAMRA。

4.一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于，包括游离DNA提取试剂、亚硫酸盐转化试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂、阳性对照品、阴性对照品；其中，所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂包括如权利要求1～3中任一项所述的引物对和探针。

5.根据权利要求4所述的用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于，所述游离DNA提取试剂包括裂解液、蛋白酶混合液、磁珠、洗涤液和洗脱液；所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂还包括PCR扩增缓冲液、UNG酶和DNA聚合酶；阳性对照品采用牛血清白蛋白、人基因组DNA，阴性对照品采用DEPC H₂O。

6.根据权利要求5所述的用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于，每一对应的引物对与探针的摩尔比为2：1，每一引物对的各引物的终浓度均为200nM，各探针的终浓度均为100nM。

7.一种如权利要求3所述的试剂盒基在早期结直肠癌检测中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括如下检测步骤：

步骤1)收集样本，并将样本混匀后进行游离DNA的提取；

步骤2)对步骤1)提取的DNA样本进行亚硫酸盐转化；

步骤3)采用权利要求1～3中任一项所述的引物对和探针对步骤2)亚硫酸盐转化后的DNA样本进行实时荧光定量PCR扩增反应，；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤3)中PCR扩增的反应条件是：50℃UNG酶反应2min；95℃变性5min；95℃变性5s，55℃退火和延伸35s，45个循环。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，DNA样本的结果判定步骤如下：如果单次PCR扩增中Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2五个基因中的至少两个基因为阳性，则样本的测试结果为“阳性”；如果单次PCR扩增中Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2五个基因中的任意一个基因为阳性，则需要重复检测三次，三次结果中至少两次为阳性时，则样本的测试结果为“阳性”；如果结果为其它情况，视为无效。