发明内容
本发明的目的在于提供一种用于结直肠癌基因甲基化检测的核酸组合、试剂盒,可以应用于结直肠癌相关基因甲基化的检测中,提高检测特异性。
本发明提供的技术方案如下:
在一个方面,本发明提供了一种用于结直肠癌基因甲基化检测的核酸组合,所述核酸组合包括用于检测Septin9基因甲基化的第一特异性引物对和第一特异性探针、用于检测SDC2基因甲基化的第二特异性引物对和第二特异性探针以及用于检测NDRG4基因甲基化的第三特异性引物对和第三特异性探针;其中,
所述第一特异性引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1~2所示;所述第一特异性探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示;
所述第二特异性引物对的碱基序列如SEQ ID NO.7~8所示;所述第二特异性探针的碱基序列如SEQ ID NO.9所示;
所述第三特异性引物对的碱基序列如SEQ ID NO.13~14所示;所述第三特异性探针的碱基序列如SEQ ID NO.15所示;
所述第一特异性引物对、所述第二特异性引物对、所述第三特异性引物对、所述第一特异性探针、所述第二特异性探针以及所述第三特异性探针的碱基序列经锁核苷酸修饰。
Septin9基因是septin家族中的一员,定为与染色体17q25.3,该染色体区段是散发性卵巢癌和乳腺癌的常见杂合性丢失部位,在子细胞的胞质分裂过程中起着至关重要的作用。已经有很多文献研究表明septin9基因甲基化在CRC早期筛查中的敏感性和特异性均较高,FDA和cFDA也已经批准了以此基因为标志物的多款产品。SDC2基因位于人类8号染色体的长臂上,编码Syndecan-2蛋白。研究发现Syndecan-2蛋白可介导结直肠癌细胞的粘附等功能,与结直肠癌细胞增殖密切相关。研究证实,相对于正常结直肠组织,SDC2基因在不同分期的结直肠癌和部分肠进展期腺瘤组织中呈现高水平的甲基化现象,提示其具有结直肠癌和肠进展性腺瘤检测的临床价值。NDRG4(N-mycdownstream-reguiatedgene4)为抑癌基因NDRG基因家族成员之一,NDRG4基因长32kb,由17个外显子及16个内含子组成,大量研究表明该基因与肿瘤细胞的生长、分化和转移有一定关系,其基因5’端调控区域含有CpG岛,在结直肠癌发生发展过程中常常被甲基化,NDRG4基因甲基化被认为是结直肠癌的重要生物学特征。因此,NDRG4基因是候选肿瘤抑制基因和直肠癌的潜在生物标志物,NDRG4启动子的甲基化可作为生物标志物,用于早期诊断结直肠癌。
本发明针对结直肠癌三个相关基因septin9、SDC2和NDRG4的启动子区域的甲基化状态,设计针对不同候选甲基化区域的引物对和探针序列,从中筛选出具有更好的灵敏度和特异性的引物对和探针。
为了进一步提高特异性,对筛选得到的引物对和探针进行锁核酸修饰,每个基因的正、反向引物各设计三种不同的锁核酸修饰,共有9中不同的引物探针组合,评估上述三个基因的各9种锁核酸修饰的引物探针组合的灵敏度和特异性,从中得到具有最佳检测效果的核酸组合。
在一个实施方案中,所述第一特异性引物对的正向引物的碱基序列选自SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.33中的任一种;所述第一特异性引物对的反向引物的碱基序列选自SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.34中的任一种;
进一步地,所述第一特异性探针的碱基序列如SEQ ID NO.24所示;
其中,碱基下方设有下划线的为锁核酸修饰的碱基。
在一个实施方案中,所述第二特异性引物对的正向引物的碱基序列选自SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.35或SEQ ID NO.37中的任一种;所述第二特异性引物对的反向引物的碱基序列选自SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.38中的任一种;
进一步地,所述第二特异性探针的碱基序列如SEQ ID NO.27所示;
其中,碱基下方设有下划线的为锁核酸修饰的碱基。
在一个实施方案中,所述第三特异性引物对的正向引物的碱基序列选自SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.41中的任一种;所述第三特异性引物对的反向引物的碱基序列选自SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.40或SEQ ID NO.42中的任一种;
进一步地,所述第三特异性探针的碱基序列如SEQ ID NO.30所示;
其中,碱基下方设有下划线的为锁核酸修饰的碱基。
锁核酸修饰可以提高检测的特异性,有效避免由于非特异扩增造成的假阳性。
以不同甲基化率的细胞系DNA为甲基化阳性模板,以甲基化阴性细胞系DNA作为甲基化阴性模板,评估三个基因的各9种锁核酸修饰的引物探针组合的灵敏度和特异性。通过分析,相比于非锁核酸修饰的引物对和探针,甲基化检测的灵敏度在细胞系DNA上没有明显差异,甲基化检测的特异性在阴性细胞系DNA上,三个基因的各9种锁核酸修饰的引物探针组合均可以明显能耐受更高浓度的阴性细胞系DNA。
在一个优选的实施方案中,所述第一特异性引物对的正向引物的碱基序列为SEQID NO.22;所述第一特异性引物对的反向引物的碱基序列为SEQ ID NO.23;所述第一特异性探针的碱基序列如SEQ ID NO.24所示;所述第二特异性引物对的正向引物的碱基序列为SEQ ID NO.25;所述第二特异性引物对的反向引物的碱基序列为SEQ ID NO.26;所述第二特异性探针的碱基序列如SEQ ID NO.27所示;所述第三特异性引物对的正向引物的碱基序列为SEQ ID NO.28;所述第三特异性引物对的反向引物的碱基序列为SEQ ID NO.29;所述第三特异性探针的碱基序列如SEQ ID NO.30所示。
在一个实施方案中,所述特异性探针的5’端标记有荧光基团,3’端标记有淬灭基团;优选地,所述荧光基团选自FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX中的任一种;所述淬灭选自选自6-TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3中的任一种。
再另一个方面,本发明提供了一种检测结直肠癌基因甲基化的试剂盒,其包括前述的核酸组合。
在一个实施方案中,所述试剂盒还包括用于检测ACTB内参基因甲基化的第四特异性引物对和第四特异性探针;优选的,所述用于检测ACTB内参基因甲基化的第四特异性引物对的碱基序列如SEQ ID NO.19~20所示;优选的,所述用于检测ACTB内参基因甲基化的第四特异性探针的序列如SEQ IDNO:.21所示。ACTB基因的引物对和探针用于对样本质量的控制。
在一个实施方案中,所述试剂盒还包括核酸提取液、PCR反应缓冲液和PCR反应液中的一种或多种。
在一个实施方案中,,所述PCR反应液包含Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+的一种或多种。
在一个实施方案中,所述试剂盒还包括甲基化检测阴性对照品和甲基化检测阳性对照品。
在一个实施方案中,保护上述用于检测结直肠癌基因甲基化的核酸组合在制备结直肠癌甲基化的试剂盒中的应用。所述的结直肠癌筛查用的试剂使用方法如下:将样品DNA、阳性质控品以及阴性质控品加入用于检测结直肠癌基因(Septin 9,SDC2,NDRG4)甲基化的特异性引物和特异性探针以及用于检测ACTB内参基因甲基化的特异性引物和特异性探针混合后,再进行荧光定量PCR反应。其中,针对每个基因的探针均连接有荧光基团。
有益效果:
(1)本发明提供的核酸组合通过将引物探针中的甲基化位点进行锁核酸修饰,大大提高了检测的特异性,而灵敏度相比于非锁核酸修饰基本一致;
(2)相比于单基因检测基因甲基化,多基因联合检测具有很好的综合检测效果,可以有效的互补,达到最好的检测效果;单一标志物的检测效果无法达到三个标志物联合检测效果,对结直肠癌检测的灵敏度96.97%,对进展期腺瘤检测的灵敏度68.4%,检测的特异性97.51%;
(3)利用本发明试剂盒对临床粪便样本进行检测,可以有效的检测到结直肠癌,进展期腺瘤,对息肉,腺瘤和健康人的检测特异性高。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1.粪便采集保存、粪便DNA提取
1.粪便采集保存
粪便样本采集步骤如下:
(1)排便:将粪便排至蹲便器或废弃盒子中,然后立即取样;
(2)挖取粪便:打开粪便DNA样本保存管,用盖子上的取样勺挖取一勺粪便(约红枣大小);
(3)旋紧管盖:将勺子连同粪便样本放回管内,并旋紧管盖,摇晃混匀约30秒。
该步骤中使用的粪便DNA样本保存管可使用本领域常规的保存管,但建议采用江苏康为世纪生物科技股份有限公司的粪便样本采集管,产品货号为CWY041,使用该产品采集粪便后,可在2~37℃下保存至少60天,-20℃和-80℃下可长期保存,在保存和运输过程中应避免样本反复冻融。
2.粪便DNA提取
建议采用江苏康为世纪生物科技股份有限公司的粪便提取试剂盒,产品货号为CW2092S。
粪便样本DNA提取步骤如下:
(1)取1~10g粪便样本,置于离心管中;
(2)加入1mL Buffer SW,涡旋振荡3~5分钟,使样本均匀分散于溶液中;12,000rpm(~13,400×g)离心1分钟,弃上清;
(3)加入1ml Buffer SL,涡旋振荡3~5分钟,使样本均匀分散于溶液中,65℃水浴20分钟,期间可每隔5分钟涡旋振荡15秒;
(4)12,000rpm离心3分钟,将上清移至新的离心管中;
(5)向上清液中加等体积Buffer GL,颠倒混匀15~25次,冰上放置5分钟;12,000rpm离心5分钟(注意:此时液体可能为透明或浑浊状态,均不影响实验);
(6)将步骤(5)中所得上清加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns DM)中,若一次不能加完溶液,可分多次转入;12,000rpm(~13,400×g)离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;
(7)向吸附柱中加入500μL Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;
(8)重复步骤(7);
(9)向吸附柱中加入500μL Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;
(10)12,000rpm离心2分钟,倒掉收集管中的废液;将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干;注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等);
(11)将吸附柱置于一个新的离心管中,向吸附柱的中间部位悬空滴加50~100μLBuffer GE或灭菌水,室温放置2~5分钟,12,000rpm离心1分钟,收集DNA溶液,-20℃保存DNA。
实施例2.DNA甲基化转化
粪便样本DNA甲基化转化可使用本领域常规的商品化试剂盒;建议采用江苏康为世纪生物科技股份有限公司的DNA甲基化转化试剂盒,产品货号为CWY105。粪便样本DNA甲基化转化步骤如下:
(1)将需要进行甲基化的DNA样本,提前平衡至室温;取20μL样本加入至一个新的PCR管;
(2)向样本中加入转化液180μL,总体积200μL,混匀以后放入PCR仪器,开始转化;转化程序如下:98℃ 10min;54℃ 1h;4℃ hold;
(3)取新的离心管,加入600μL缓冲液MB,将步骤(2)中反应得到的转化液转移到缓冲液MB中,震荡混匀;
(4)将磁珠20μL加入到步骤(3)中的混合液,涡旋震荡混匀后,在恒温混匀仪上1300rpm震荡10min;
(5)将(4)的离心管放在磁力架上30s,去除废液,留下磁珠备用;
(6)加入500μL漂洗液,用移液枪与磁珠吹打混匀后,放在磁力架上30s,去除废液;
(7)加入200μL的缓冲液DB,用恒温混匀仪震荡混匀15~20min,磁力架上30s后去除废液;
(8)加入500μL漂洗液漂洗1次,磁力架上30s后去掉废液,干燥5~10min(肉眼观察磁珠表面变成哑光);
(9)加入30μL洗脱液,在恒温混匀仪上65℃ 1300rpm震荡10min,放在磁力架上30s后,将洗脱液转移到新的离心管中,如不立即进行下游检测,请将转化后的样本放入-15℃以下保存。
实施例3.甲基化基因检测的引物、探针设计和性能评估
基因的甲基化主要发生在启动子区域,基因启动子区域往往含有多个CpG岛,选择那个CpG岛作为检测的区域具有更好的诊断性能没有一个明确的理论。本研究通过对3个基因启动子区域进行分析,每个基因分别获得了两个不同的甲基化区域,命名为a,b区域。
1.设计特异的引物对、探针
通过查阅文献、参考国内外相关甲基化检测产品、搜索TCGA(The cancer genomeatlas)数据库后生物信息学挖掘标志物等,获得结直肠癌特异性的甲基化标志物septin9、SDC2和NDRG4作为检测标志物,通过NCBI获得三个标志物的启动子区,每个基因获得两个CpG岛a和b后,设计特异性的引物对和探针。引物对和探针序列如下所示。
针对septin9的两个CpG岛设计的引物对和探针分别如SEQ ID NO.1-2和SEQ IDNO.3、SEQ IDNO.4-5和SEQ ID NO.6所示;
针对SDC2的两个CpG岛设计的引物对和探针如SEQ ID NO.7-8和SEQ ID NO.9、SEQID NO.10-11和SEQ ID NO.12所示;
针对NDRG4的两个CpG岛设计的引物对和探针如SEQ ID NO.13-14和SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16-17和SEQ ID NO.18所示;
内参ACTB的引物对和探针的序列如SEQ ID NO.19-20和SEQ ID NO.21所示。
2.qPCR反应体系
以江苏康为世纪生物科技股份有限公司的qPCR预混反应液GoldStar ProbeMixture为反应液,货号为CW0932。qPCR体系如下表所示:
组分 |
用量 |
GoldStar Probe Mixture |
12.5μL |
上游引物(100μM) |
2.5μL |
下游引物(100μM) |
2.5μL |
荧光探针(100μM) |
1.25μL |
H2O |
1.25μL |
模板 |
5μL |
3.qPCR反应程序
模板选择经过甲基化测序验证的阴性细胞系293T DNA(200ng/μL,20ng/μL,5ng/μL,2ng/μL,0.2ng/μL)和经过甲基化测序验证的阳性细胞系DNA与阴性细胞系293T DNA混合而成的浓度为5ng/μL的不同甲基化比例的阳性模板(100%,20%,2%,0.5%,0.1%),以及经过甲基化测序验证的甲基化阳性粪便DNA和甲基化阴性粪便DNA各两例。
上述甲基化模板阴性细胞系293T DNA(200ng/μL,20ng/μL,5ng/μL,2ng/μL,0.2ng/μL),阳性模板(100%,20%,2%,0.5%,0.1%),以及经过甲基化测序验证的甲基化阳性粪便DNA和甲基化阴性粪便DNA,按照实施例2的方法进行甲基化转化获得甲基化转化后的DNA。
进行qPCR反应体系配制:
组分 |
用量 |
GoldStarProbe Mixture |
12.5μL |
上游引物(100μM) |
2.5μL |
下游引物(100μM) |
2.5μL |
荧光探针(100μM) |
1.25μL |
H2O |
1.25μL |
配制完成后每管20μL分装到qPCR八连排或96孔板中,加入5μL上述转化后的模板,总反应体积为25μL。封严封口膜或盖紧PCR反应管盖,3000rpm,离心1min(PCR管瞬时离心),排除管底气泡,记录样本加样情况。将PCR反应管转移到核酸扩增区进行上机检测。
扩增程序:
检测通道分别设置FAM、VIC、ROX和CY5,FAM对应Septin9,VIC对应SDC2,ROX对应NDRG4,CY5对应ACTB;对于ABI 7500,则仪器中“Quencher Dye“和“Passive Reference”均设置为None。按照样本对应顺序设置阳性对照、阴性对照和样本,并在“样本名称”一栏中设置样本名称。
PCR反应程序结束后,使用2层PE手套包好PCR反应条或96孔板,避免PCR管盖打开或膜破裂造成污染,并按生物垃圾处理,严禁打开PCR管盖,以免造成污染。
根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值(基线设定原则为start值为3到15,end值为5到20,阈值设置原则为在荧光曲线的拐点处略高于阴性对照),点击Analysis自动获得分析结果。
获得的Ct值进行数据分析如下表所示:
以不同甲基化率的细胞系DNA为甲基化阳性模板,以甲基化阴性细胞系DNA作为甲基化阴性模板,评估上述三个基因的不同区域的引物对和探针的灵敏度和特异性。通过分析,相同基因的不同区域的引物对和探针的灵敏度在细胞系DNA上没有明显差异,相同基因的不同区域的引物对和探针的特异性在阴性细胞系DNA上也无明显差异。
接着利用上述三个基因的各两对引物探针组合对临床样本进行检测。共从医院获取301例粪便样本(100例结直肠癌,100例进展期腺瘤和101例健康人)进行甲基化检测,利用上述检测方法,获得各个样本三个目的基因和内参的检测Ct值。
单个靶基因的结果判断如下表所示。
表1.单个靶基因的结果判断
多个靶基因联合检测的结果判断标准为,只要有一个基因的甲基化判定为阳性,样本就判定为阳性,只有三个靶基因均为甲基化阴性,样本才会判断为阴性。
将每单个基因和多个基因组合的灵敏度和特异性汇总如下表所示。
通过分析获得,Septin9的甲基化区域a,SDC2的甲基化区域a和NDRG4的甲基化区域a相比于另外一个区域具有更好的灵敏度和特异性。因此,优选的Septin9的Septin9-a区域,SDC2的SDC2-a,NDRG4的NDRG4-a区域用于进一步研究。更进一步分析,将三个单基因两两组合或者三个基因组合性能可知,三个基因组合可以达到最好的诊断性能。因此,优选的Septin9的Septin9-a区域,SDC2的SDC2-a区域,NDRG4的NDRG4-a区域的三基因组合用于进一步研究。
实施例4.甲基化基因检测的引物、探针锁核酸修饰
三基因组合(Septin9、SDC2和NDRG4的区域a)虽然相比于单基因具有更高的灵敏度,但特异性无法满足临床性能的需求,需要进一步改进,因此对上述引物探针进行锁核酸修饰,这样可以增加引物的结合能力,提高检测的特异性,有效避免由于非特异扩增造成的假阳性。
三个基因各设计多个锁核酸修饰的不同位点的引物,测试不同修饰位点对检测灵敏度和特异性的差异。septin9启动子的septin9-a区域锁核酸修饰的引物对的碱基序列如SEQ ID NO.22-23,SEQ ID NO.31-32,SEQ ID NO.33-34所示,锁核酸修饰的探针的碱基序列如SEQ ID NO.24所示;SDC2启动子SDC2-a区域锁核酸修饰的引物对的碱基序列如SEQ IDNO.25-26,SEQ ID NO.35-36,SEQ ID NO.37-38所示,锁核酸修饰的探针的碱基序列如SEQID NO.27所示;NDRG4启动子的NDRG4-a区域锁核酸修饰的引物对的碱基序列如SEQ IDNO.28-29,SEQ ID NO.39-40,SEQ ID NO.41-42所示,锁核酸修饰的探针的碱基序列如SEQID NO.30所示。
下表为对应的引物探针序列,有下划线的碱基为锁核酸修饰的碱基。
模板选择经过甲基化测序验证的阴性细胞系293T DNA(200ng/μL,20ng/μL,5ng/μL,2ng/μL,0.2ng/μL)和经过甲基化测序验证的阳性细胞系DNA与阴性细胞系293T DNA混合而成的浓度为5ng/μL的不同甲基化比例的阳性模板(20%,2%,0.5%,0.1%)。
上述三个甲基化基因的引物探针组合,各有三个正向引物和三个反向引物,每个甲基化基因相互组合可以得到9种不同的引物探针组合。利用实施例3的检测方法,比较锁核酸修饰的引物探针组合和非锁核酸修饰的引物探针组合的灵敏度和特异性。
获得的Ct值进行数据分析如下表所示,Septin9锁核酸修饰的9个引物探针组合和未经锁核酸修饰的引物探针组合检测结果如下:
其中,Septin 9修饰组合-1是指引物对SEQ ID NO.22,SEQ ID NO.23与探针SEQID NO.24的组合;Septin 9修饰组合-2是指引物对SEQ ID NO.22,SEQ ID NO.32与探针SEQID NO.24的组合;Septin 9修饰组合-3是指引物对SEQ ID NO.22,SEQ ID NO.34与探针SEQID NO.24的组合;Septin 9修饰组合-4是指引物对SEQ ID NO.31,SEQ ID NO.23与探针SEQID NO.24的组合;Septin 9修饰组合-5是指引物对SEQ ID NO.31,SEQ ID NO.32与探针SEQID NO.24的组合;Septin 9修饰组合-6是指引物对SEQ ID NO.31,SEQ ID NO.34与探针SEQID NO.24的组合;Septin 9修饰组合-7是指引物对SEQ ID NO.33,SEQ ID NO.23与探针SEQID NO.24的组合;Septin 9修饰组合-8是指引物对SEQ ID NO.33,SEQ ID NO.32与探针SEQID NO.24的组合;Septin 9修饰组合-9是指引物对SEQ ID NO.33,SEQ ID NO.34与探针SEQID NO.24的组合。
SDC2锁核酸修饰的9个引物探针组合和未经锁核酸修饰的引物探针组合检测结果如下:
其中,SDC2修饰组合-1是指引物对SEQ ID NO.25,SEQ ID NO.26与探针SEQ IDNO.27的组合;SDC2修饰组合-2是指引物对SEQ ID NO.25,SEQ ID NO.36与探针SEQ IDNO.27的组合;SDC2修饰组合-3是指引物对SEQ ID NO.25,SEQ ID NO.38与探针SEQ IDNO.27的组合;SDC2修饰组合-4是指引物对SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.26与探针SEQ IDNO.27的组合;SDC2修饰组合-5是指引物对SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.36与探针SEQ IDNO.27的组合;SDC2修饰组合-6是指引物对SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.38与探针SEQ IDNO.27的组合;SDC2修饰组合-7是指引物对SEQ ID NO.37,SEQ ID NO.26与探针SEQ IDNO.27的组合;SDC2修饰组合-8是指引物对SEQ ID NO.37,SEQ ID NO.36与探针SEQ IDNO.27的组合;SDC2修饰组合-9是指引物对SEQ ID NO.37,SEQ ID NO.38与探针SEQ IDNO.27的组合。
NDRG4锁核酸修饰的9个引物探针组合和未经锁核酸修饰的引物探针组合检测结果如下:
其中,NDRG4修饰组合-1是指引物对SEQ ID NO.28,SEQ ID NO.29与探针SEQ IDNO.30的组合;NDRG4修饰组合-2是指引物对SEQ ID NO.28,SEQ ID NO.40与探针SEQ IDNO.30的组合;NDRG4修饰组合-3是指引物对SEQ ID NO.28,SEQ ID NO.42与探针SEQ IDNO.30的组合;NDRG4修饰组合-4是指引物对SEQ ID NO.39,SEQ ID NO.29与探针SEQ IDNO.30的组合;NDRG4修饰组合-5是指引物对SEQ ID NO.39,SEQ ID NO.40与探针SEQ IDNO.30的组合;NDRG4修饰组合-6是指引物对SEQ ID NO.39,SEQ ID NO.42与探针SEQ IDNO.30的组合;NDRG4修饰组合-7是指引物对SEQ IDNO.41,SEQ ID NO.29与探针SEQ IDNO.30的组合;NDRG4修饰组合-8是指引物对SEQ ID NO.41,SEQ ID NO.40与探针SEQ IDNO.30的组合;NDRG4修饰组合-9是指引物对SEQ ID NO.41,SEQ ID NO.42与探针SEQ IDNO.30的组合。
通过分析得出,相比于非锁核酸修饰的引物对和探针,锁核酸修饰的引物对和探针的甲基化检测的灵敏度在细胞系DNA上没有明显差异,甲基化检测的特异性在阴性细胞系DNA上锁核酸修饰的引物对和探针明显能耐受更高浓度的阴性细胞系DNA,且不同位点锁核酸修饰位点的不同引物探针组合均可以提高特异性且相差不大。
接着利用上述三个基因的各9个引物探针组合和未经锁核酸修饰的引物探针组合对临床样本进行检测。共从医院获取180例粪便样本(50例结直肠癌,30例进展期腺瘤,腺瘤20例和80例健康人)进行甲基化检测,检测方法和阳性结果的判断标准参照实施例1~3,获得各个基因的各9个引物探针组合的检测灵敏度和特异性,如下所示。
Septin9基因锁核酸修饰的9个引物探针组合和未修饰的引物探针组合的检测灵敏度和特异性如下表所示:
SDC2基因锁核酸修饰的9个引物探针组合和未修饰的引物探针组合的检测灵敏度和特异性如下表所示:
NDRG4基因锁核酸修饰的9个引物探针组合和未修饰的引物探针组合的检测灵敏度和特异性如下表所示:
上述数据可以看出,在粪便样本中,锁核酸修饰后不同组合的检测特异性相差不大且都明显高于未修饰的引物探针组合。锁核酸修饰后不同组合的检测灵敏度会具有很大的波动性,有几个的核酸组合的灵敏度低于未修饰的核酸组合。
不同位置的锁核酸修饰确实可以提高检测的特异性,但有些位置修饰会影响检测的灵敏度,所以选择锁核酸修饰的过程并非随意的简单常规选择。
将三个基因的各9个锁核酸修饰的最好的核酸组合,即septin9启动子的septin9-a区域锁核酸修饰的引物对和探针的碱基序列如SEQ ID NO.22-24;SDC2启动子SDC2-a区域锁核酸修饰的引物对和探针的碱基序列如SEQ ID NO.25-27;NDRG4启动子的NDRG4-a区域锁核酸修饰的引物对和探针的碱基序列如SEQ ID NO.28-30,对上述样本进行联合检测后分析,检测结果如下表所示:
|
正常人 |
腺瘤 |
进展期腺瘤 |
CRC |
粪便样本数目 |
80 |
20 |
30 |
50 |
结直肠癌阳性检出数目 |
1 |
3 |
18 |
49 |
由此,可以计算得出,本试剂盒的特异性为96%(96/100),进展期腺瘤的检测灵敏度为60%(18/30),结直肠癌的检测灵敏度为98%(49/50)。
实施例5.本发明甲基化基因检测试剂盒及应用
本发明试剂盒包括了上述获得的经过锁核酸修饰的Septin 9,SDC2,NDRG4的三基因联合的引物探针组合,还包括PCR扩增的Taq酶、dNTPs、PCR buffer,甲基化阴性对照和甲基化检测阳性对照。
利用本发明试剂盒对临床粪便样本进行检测,可以有效的检测到结直肠癌、进展期腺瘤;对息肉,腺瘤和健康人的检测特异性高。对临床粪便样本进行了甲基化检测,其中165例结直肠癌样本,76例进展期腺瘤样本,290例腺瘤样本,182例息肉样本,451例健康人样本。
检测方法和阳性结果的判断标准参照实施例1~3,每次检测需同时检测甲基化阴性对照和甲基化检测阳性对照,用于质控检测流程的正确性。
检测结果如下表所示:
|
正常人 |
息肉 |
腺瘤 |
进展期腺瘤 |
CRC |
粪便样本数目 |
451 |
182 |
290 |
76 |
165 |
结直肠癌阳性检出数目 |
7 |
7 |
9 |
52 |
160 |
由此,可以计算得出,本试剂盒的特异性为97.51%(900/923),进展期腺瘤的检测灵敏度为68.4%(52/76),结直肠癌的检测灵敏度为96.97%(160/165)。
三个甲基化基因联合,同时将引物探针组合进行锁核酸修饰,本试剂盒具有了较高的灵敏度和特异性。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 江苏康为世纪生物科技股份有限公司
泰州健为医学检验实验有限公司
北京健为医学检验实验室有限公司
<120> 用于结直肠癌基因甲基化检测的核酸组合、试剂盒
<130> HZ0112110002
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggcgtttgt tatcgcgttc 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgaaacgaa cgaatcacg 19
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagataggg ttttatcgtg ttagttagga 30
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaataatccc atccaactac gcg 23
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gattcgttgt ttattagtta ttatgt 26
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 18
<212> DNA
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<212> DNA
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caaactcgaa aactcgaact cgaaact 27
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
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gtgatggagg aggtttagta agtt 24
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<212> DNA
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ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
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aggcgtttgt tatcgcgttc 20
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agagataggg ttttatcgtg ttagttagga 30
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<400> 25
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gaactccttt cccgtaccg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<211> 19
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<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cgaaatccgc tccaactcg 19