CN114717305A - Nr1d1、junb、rorc作为药物性-急性肾损伤的诊断标记应用 - Google Patents

Nr1d1、junb、rorc作为药物性-急性肾损伤的诊断标记应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物标记物在药物性‑急性肾损伤(drug‑induced acutekidney injury)诊断中的应用，本申请通过生信挖掘发现与AKI密切相关NR1D1、JUNB、RORC，随后在AKI病人血清中基于蛋白表达进行验证，证实NR1D1、JUNB或RORC与药物性‑急性肾损伤疾病高度相关，可以作为AKI的诊断生物标记物。

Description

NR1D1、JUNB、RORC作为药物性-急性肾损伤的诊断标记应用
技术领域
本申请涉及分子诊断技术领域，具体涉及NR1D1、JUNB或RORC作为药物性-急性肾损伤的诊断标记应用。
背景技术
顺铂为临床上广泛应用治疗卵巢癌、非小细胞肺癌、肾癌、膀胱癌、头颈部鳞癌等多种实体肿瘤的化疗药物,但在正常组织器官中的不良反应,如肾毒性、耳毒性、神经毒性以及恶心呕吐等，尤其是肾毒性限制了其临床应用。应用顺铂治疗后,大约1/3的患者可出现肾功能异常,甚至急性肾损伤，进而导致药物性-急性肾损伤(Drug-induced acutekidney injury，AKI)。
通常AKI泛指≤3个月的肾脏功能或结构方面的异常，包括血、尿、组织检测或影像学方面的肾损伤标志的异常。传统AKI的诊断主要依据Scr或者尿量的改变，但这些指标受影响因素多，不能达到早诊等目的，可能延误最佳治疗AKI时机，因此寻求早期、敏感且可量化的AKI生物标志物是临床诊断治疗的迫切需求。目前已有的AKI标志物包括，例如NGAL、KIM-I、RBP、NAG、IL-18等，但考虑到AKI病因众多，不同病因导致的急性肾损伤和生物标志物不同，在顺铂药物导致的AKI中，目前可用生物标志物较少，有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本申请首要目的是提供一种NR1D1、JUNB或RORC作为药物性-急性肾损伤的诊断标记应用及其方法。
本申请首先提供一种NR1D1、JUNB或RORC检测剂在制备用于诊断或检测药物性-急性肾损伤的试剂盒中的应用。
进一步的，所述检测于包括但不限于核酸水平进行检测、蛋白蛋白水平进行检测。
进一步的，所述检测剂于核酸水平进行检测；
在一些优选方式中，所述检测剂用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。
进一步的，所述检测剂于蛋白水平进行检测；
在一些优选方式中，所述检测剂用于执行以下任一种方法：生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及免疫法进行检测。
进一步的，所述试剂盒中还包括检测其他基因或蛋白的试剂，用于联合检测。
进一步的，所述检测针对的样品选自受试者的血液、血清、血浆、组织或组织裂解液、细胞培养上清中至少一种。
进一步的，所述诊断包括但不限于早期诊断、疾病诊断或伴随诊断等。
本申请还提供一种用于预测、评估或筛查药物性-急性肾损伤的检测试剂盒，所述试剂盒中包含用于NR1D1、JUNB或RORC检测的试剂。
进一步的，所述试剂盒可以为核酸水平检测试剂盒；
在一些优选的方式中，所述试剂盒用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法；
进一步的，所述试剂盒可以为蛋白水平检测试剂盒；
在一些优选的方式中，所述试剂盒用于执行以下任一种方法：生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及免疫法进行检测。
本申请还提供一种诊断药物性-急性肾损伤的方法，所述方法包括检测患者NR1D1的基因或蛋白水平。
本申请还提供一种NR1D1、JUNB或RORC基因或蛋白作为药物性-急性肾损伤的敏感性标志物的应用。
本申请有益技术效果：
1)本申请通过生信挖掘发现NR1D1、JUNB或RORC基因可以作为AKI的诊断生物标记物，同时在AKI病人血清中进一步证实NR1D1、JUNB或RORC与AKI病人高度相关，可作为AKI的诊断生物标记物。
2)本申请拓宽了药物性-AKI诊断策略，血清中检测NR1D1、JUNB、RORC表达，操作简单便捷出结果更快，对病人创伤较小，为诊断试剂盒开发和靶向治疗提供思路和见解，具有显著临床价值。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1、FunRich对四组上调基因和下调基因分别取交集得到共同上调和下调表达基因分析韦恩图；
图2、STRING蛋白互作网络分析图；
图3、顺铂成功诱导c57小鼠发生急性肾损伤结果图；
图4、经顺铂处理后qPCR和western blot检测的NR1D1变化结果图；
图5、NR1D1、JUNB、P21和RORC在急性肾损伤病人的血清中表达统计图；
图6、NR1D1、JUNB、RORC与急性肾损伤生物标记物P21相关性分析图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
以下基本术语或定义仅仅是为了帮助理解本申请而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。除非在下文中另有定义，本申请具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本申请。
如本申请中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本申请中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本申请描述的实施方案能以不同于本申请描述或举例说明的其它顺序实施。
本申请中的术语“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链的核酸。或者，单链核酸可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。
现将详细地提供本申请实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本申请。对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本申请进行多种修改和变化而不背离本申请的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，旨在本申请覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本申请的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本申请更广阔的方面。
本申请涉及针对NR1D1、JUNB或RORC基因检测剂在制备用于诊断或检测药物性-急性肾损伤的试剂盒中的应用，以及在诊断药物性-急性肾损伤疾病中的应用。基于本申请的核心思路可知，本申请发现了NR1D1、JUNB或RORC可作为药物性-急性肾损伤疾病的诊断标记物。因此，但凡基于NR1D1、JUNB或RORC进行的药物性-急性肾损伤诊断相关技术方案都在本申请的保护范围内，包括但不限于产品、方法、应用等。
可以理解的是，不作限制本申请的的诊断或检测并不限制检测水平，比如可以包括核酸水平进行检测或蛋白蛋白水平进行检测。当所述检测剂于核酸水平进行检测时，可以是如下任一种：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法；当所述检测剂于蛋白水平进行检测时，可以是如下任一种：生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及免疫法进行检测。
此外，本申请的检测产品或方法可以联合其他已知标志物进行药物性-急性肾损伤检测，当然还可以包括针对其他疾病的检测，进而通过联合检测实现方便、快捷或成本降低等目的。同样的，本申请所述检测针对的样品选择是任意的，可以选自受试者的血液、血清、血浆、组织或组织裂解液、细胞培养上清中至少一种。本申请所述诊断阶段也可以选择，比如包括但不限于早期诊断、疾病诊断或伴随诊断等。
下面结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。
实施例1顺铂急性肾损伤关键基因的挖掘
1)数据集获取及其特征
数据集的选择：芯片数据源自NCBI-GEO，通过对结果的综合分析得出GSE85957芯片数据。通过GPL1355 platform—“[Rat230_2]Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array”进行深入分析。。
使用R4.0.3软件读取处理GSE85957数据矩阵,根据描述将数据集分为3mg/kg顺铂治疗后第3、5、8、26天，共4组，使用limma3.44.3包进行显著差异富集分析，经过对实验组进行差异分析，筛选得到3mg/kg顺铂治疗后第3、5、8、26天4组的差异表达基因分别有1273、1156、2944、894个。其中升高的差异表达基因数量分别为511、631、1370、417个；降低的差异表达基因数量分别为762、525、1574、477。数据集分组及特征如表1所示。
表1：GSE85957数据集差异表达基因数量和特征
Figure BDA0003612701710000071
2)数据集差异基因的富集分析
数据处理及差异基因的富集：使用R软件摄取GSE85957详细数据。根据实验将数据集分为注射3mg/kg顺铂后第3、5、8和26天四组。通过limma3.44.3包进差异基因筛选。使用dplyr软件对所得结果进行处理，并编辑矩阵。FunRich 3.1.3对各组数据取交集。
3mg/kg顺铂治疗后第3、5、8、26天4组的上调基因数量分别为511、631、1370和417个，下调基因数量分别为762、525、1574、477个。申请人使用FunRich软件对四个组的上调基因取交集得出四组表达升高相同的基因23个(Tgif1，Ier3，PVR，Fas，Gpnmb，Rasd1，Junb，Atf3，Ier2，Isg20，Slfn13，Egr2，Aen，Btg2，Tpm1，Gdf15，Fos，Egr1，Phlda3，Nr1d1，Cdkn1a，Plk2，Havcr1)，对四个组的下调基因取交集得出四组表达降低相同的基因13个(LOC102548146，Rsrp1，Epha4，Pappa2，Alb，Arntl，Slc31a1，Prkg2，Gga2，LOC102550354，Cav2，Cap2，RORC)(具体如图1，韦恩图四个组重叠部分为共同表达基因)。
3)共表达核心基因筛选
为了明确共同表达的核心基因，本申请在GSE85957数据集中36共同表达基因进行通路富集表达分析(FDR为校正后P值，P<0.05)，得到三个有表达意义的通路分别为昼夜节律通路，顺铂耐药通路和TNF通路及其相关基因(表2)。表中Fos是AP-1的亚单位与细胞凋亡显著相关，Arntl也叫BMAL1是时钟家族核心基因，已有研究表明这两个蛋白与AKI显著相关，在AKI病理生理过程中起着重要作用，这也印证了本生信分析结果的可靠性。随后本实施例对共同表达基因进行STRING蛋白互作网络分析(如图2)，由图看出Arntl(BMAL1)与NR1D1和RORC具有蛋白互相作用关系，P21和Arntl、JUNB、Fos具有蛋白互相作用关系。综合以上分析结果，最终确定NR1D1、RORC、JUNB、Cdkn1a(P21)为与AKI显著相关基因，提示其具有潜在诊断应用。对四个核心基因进行后续研究，P21为顺铂-AKI的公认生物标记物，在本申请中起到参照作用。
表2：GSE85957四组共同表达基因通路分析(FDR为校正后P值，P<0.05)
Figure BDA0003612701710000081
实施例2 NR1D1在顺铂-急性肾损伤体外细胞模型和体内小鼠模型中作用验证
本实施例以NR1D1为例，证明NR1D1在顺铂-急性肾损伤体外细胞模型和体内小鼠模型中的诊断价值。
一、建立顺铂-小鼠急性肾损伤模型
C57腹腔注射顺铂20mg/kg(20mg/kg是重度顺铂急性肾损伤的公认剂量)72h后本申请通过ELISA检测了c57血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)的水平，随后通过HE染色对肾小管损伤程度进行评估。经观察发现，生理盐水组(veh)小鼠肾脏组织形态正常。顺铂实验组小鼠肾脏结构缺陷，肾小管刷状缘脱落缺失、显著水肿，严重病变肾小管上皮细胞可观察到空泡形成、少部分肾小管上皮细胞脱落至管腔和出现细胞坏死溶解(图3-AB cis组)。与对照组相比，顺铂组血清生化指标SCr、BUN的变化显著上调，提示顺铂可以显著损坏肾功能(图3-C)。以上表明数据申请人已经成功建立顺铂-AKI体内模型。顺铂-AKI体外模型建立：用20μm顺铂与人肾小管上皮细胞(HK-2)孵育24h后提取蛋白及RNA用于后续研究分析。
二、基于顺铂-AKI体内和体外模型检测NR1D1基因和蛋白变化情况
本实施例通过qPCR和WB检测了顺铂处理后和HK-2处理后小鼠中NR1D1的变化情况。具体方法步骤如下：
a、蛋白免疫印迹实验
蛋白样品提取及浓度测定
(1)预制备蛋白裂解液:磷酸酶抑制剂和PMSF各取10μl加入980μl RIPA裂解液中混匀后插在冰上；
(2)蛋白裂解：将事先切块保存的组织放入研钵，研磨后PBS润洗组织碎片收集细胞，HK-2细胞弃上清，清洗三次。向收集的细胞中加入RIPA预混液，均匀裂解10min。
(3)蛋白提取：裂解后的蛋白13000r低温离心16min。收取上清；
(4)蛋白浓度测定：本申请采用碧云天BCA蛋白检测试剂盒来检测蛋白浓度，测完浓度取适量蛋白和5×变性缓冲液4:1混匀。100℃金属加热15min。
Western Blotting
(1)配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)：本申请采用12％的胶；
(2)加样：marker 3-5μl、样品50μg；
(3)电泳：上层胶60V，30min；下层胶100V跑完；
(4)转膜：ddH2O、甲醇和10×转膜液(7:2:1)配置1×转膜液，通过湿转法和NC膜转膜，；
(5)封闭：5％的脱脂奶粉，水平摇床室温1h；
(6)一抗结合：β-actin(1:1000)、NR1D1(1:1000)，抗体漠过膜在4℃条件下过夜；
(7)洗膜：1×TBST，5min 3次；
(8)二抗孵育：山羊抗兔IgG(1:3000)，室温水平摇床1h；
(9)洗膜：1×TBST，5min 3次；
(10)曝光：1：1配置ECL发光液，Bio-Rad凝胶成像仪进行曝光；
(11)分析：ImageJ分析灰度值。
b、qPCR
提取总RNA
(1)组织和细胞裂解：液氮萃冷组织，加入TRIzon在冰上磨碎后收集。HK-2细胞用PBS清洗三次之后加入TRIzon静置5min，反复吹打后收集；
(2)收集后加入氯仿，涡旋10s，室温沉淀3min；
(3)低温12000r离心15min。可见混悬液分3层，小心吸取中间层液体；
(4)加入异丙醇静置10min，低温12000r离心10min，晾干显现出白色沉淀；
(5)用无酶无菌水溶解RNA；测定RNA纯度和浓度，OD260/280在1.8-2.0；
逆转录反应：此次实验采用康为世纪HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis试剂盒。每管RNA模板总量为1μg，冰上操作。
(1)去基因组
Figure BDA0003612701710000111
反应条件：42℃，2min。
(2)逆转录反应
Figure BDA0003612701710000112
反应条件：42℃，15min，85℃，5min。反应结束后瞬时离心冻于-20用于后续试验。
3扩增反应：试剂盒为Takara TB Green Premix Ex Taq II。
Figure BDA0003612701710000113
Figure BDA0003612701710000121
反应条件：第一步95℃30s，第二步(PCR反应)95℃5s，60℃34s，共40个循环。
结果分析：用2–ΔΔCT的方法进行定量，以β-actin为内参对结果进行校正。
WB和qPCR结果表明，NR1D1在mRNA和蛋白表达水平一致，顺铂可以上调小鼠肾脏(图4-A,B)和HK-2中NR1D1表达(图4-C，D),与生信分析结果相符。
实施例3临床AKI病人样本验证
临床急性肾损伤病人及对照血清样本获取：筛选山西省人民院2019年-2021年期间肾内科确诊急性肾损伤的病例70例；20例健康对照样本来自山西省人民医院体检中心。
针对AKI病人血清和对照血清样本，通过酶联免疫吸附实验检测RORC、JUNB、P21和NR1D1蛋白的表达水平，具体操作如下：
本申请酶联免疫吸附测定试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。
1)将血清样本从-80℃冰箱取出并在冰上溶解；2)将NR1D1试剂盒放入室温平衡60min；3)设置标准孔、空白孔和样本孔各加50μl；4)各孔加入HRP标记的检测抗体100μl，封板37℃孵育60min；5)弃去液体，加入350μl洗涤液，重复5遍；6)各孔加入底物A、B各50μl,37℃孵育15min；7)每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔OD值。
结果如图5所示，相比于健康组，病人组的JUNB、NR1D1和P21均显著升高，RORC表达显著降低，该结果与生信分析结果一致，具有统计学意义，说明了JUNB、NR1D1和RORC可用于药物性-AKI疾病的诊断。
实施例4、RORC、JUNB和NR1D1与P21相关性分析
考虑到P21是目前公认的药物性-AKI的诊断生物标记基因，本实验将实验组P21和RORC、JUNB和NR1D1浓度分别比上对照组浓度，将P21/对照的值降序排列并匹配相应的RORC、JUNB和NR1D1/对照值作图，分别比较RORC、JUNB和NR1D1与P21之间的切合率(C)。试验发现：RORC、JUNB和NR1D1分别与P21高度切合，结果图如6所示，该结果表明JUNB、NR1D1和P21分别与P21正相关性，同样证实RORC、JUNB和NR1D1也可作为药物性-急性肾损伤体的诊断标记基因。
综上，无论从生信分析的统计学结果，还是临床样本分析结果可知，RORC、JUNB和NR1D1可用于药物性-急性肾损伤体的诊断分析。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.针对NR1D1、JUNB或RORC检测剂在制备用于诊断或检测药物性-急性肾损伤的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测于包括但不限于核酸水平进行检测、蛋白蛋白水平进行检测。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测剂于核酸水平进行检测；
优选的，所述检测剂用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测剂于蛋白水平进行检测；
优选的，所述检测剂用于执行以下任一种方法：生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及免疫法进行检测。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括检测其他基因或蛋白的试剂，用于联合检测。
6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于，所述检测针对的样品选自受试者的血液、血清、血浆、组织或组织裂解液、细胞培养上清中至少一种。
7.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述诊断包括但不限于早期诊断、疾病诊断或伴随诊断。
8.一种用于预测、评估或筛查顺铂-急性肾损伤的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含用于NR1D1检测的试剂。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒为核酸水平检测试剂盒；
优选的，所述试剂盒用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法；
或所述试剂盒为蛋白水平检测试剂盒；
优选的，所述试剂盒用于执行以下任一种方法：生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及免疫法进行检测。
10.一种诊断药物性-急性肾损伤的方法，其特征在于，所述方法包括检测患者NR1D1、JUNB或RORC的基因或蛋白水平。
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