CN107541563A

CN107541563A - 一种用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的分子标记物、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN107541563A
Application number: CN201710365860.9A
Authority: CN
Inventors: 张东山; 瞿思源; 李惠玲; 林连成
Original assignee: Shenzhen Sciarray Biotech Co ltd; Second Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Shenzhen Sciarray Biotech Co ltd; Second Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2017-05-19
Filing date: 2017-05-23
Publication date: 2018-01-05
Anticipated expiration: 2037-05-23
Also published as: EP3543359A4; CN107541563B; US20190331698A1; WO2018210201A1; EP3543359A1; EP3543359B1

Abstract

本发明公开了一种用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的分子标记物、试剂盒及应用。脓毒血症并急性肾损伤患者血液中的TCONS_00024536呈高表达，通过检测患者血液中TCONS_00024536的表达水平，可以判断患者是否患有脓毒血症急性肾损伤或患脓毒血症急性肾损伤的概率。本发明对于特异、灵敏的实现脓毒血症并急性肾损伤早期诊断、预测有重要意义。

Description

一种用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的分子标记物、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及一种用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的分子标记物、试剂盒及应用。

背景技术

脓毒血症是危急重患者常见病因及并发症之一，其病死率达50％以上。同时，脓毒血症也是重症患者发生急性肾损伤的常见原因，脓毒血症患者一旦并发急性肾损伤，其病死率可高达70％。因此，早期诊断和治疗是降低脓毒血症相关AKI发病率和病死率的关键。目前急性肾损伤的诊断主要依靠血肌酐及尿量，但血肌酐及尿量受多种因素影响，不能及时准确地反映肾功能变化，对AKI诊断缺乏足够的敏感性和特异性。现已知，当肾功能丧失达50％时肌酐浓度才会发生变化，而且肌酐达到稳态需要几天的时间，因此不能及时反映肾脏功能。此外，肌酐受到年龄、性别、种族、机体容量状况、肌肉分解代谢、蛋白质摄取、胃肠道出血及药物等诸多肾外因素影响。可见血肌酐升高往往滞后于肾功能的恶化，且不能准确反映肾功能的改变。因此，寻找高敏感性和特异性的生物学标志物，对于AKI的早期诊断和预后评估至关重要。

长链非编码RNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，研究表明，其在多种疾病的发生、发展过程中出现异常表达，能反应疾病的发展及预后，而且其在血液中表达相对稳定，作为分子标记物具有特异、灵敏、快速、方便、针对性强的优点。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种能早期检测脓毒血症并急性肾损伤的分子标记物，对早期诊断、预测脓毒血症并急性肾损伤有重要意义。

一种用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的分子标记物TCONS_00024536，序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的目的之二是提供上述分子标记物TCONS_00024536的应用。即检测TCONS_00024536表达水平的产品在制备早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤工具中的应用。

所述产品包括：通过RT-PCR或者实时定量PCR检测TCONS_00024536表达水平的制剂。

用RT-PCR检测TCONS_00024536表达水平的特异性扩增TCONS_00024536的引物序列为：

F：5’-TAGGAAGGGCTGTTGACTGG-3’

R：5’-CTGGGAGCTGGATTCAGAAG-3’。

本发明的目的之三是提供一种用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的试剂盒，包含通过RT-PCR或者实时定量PCR检测TCONS_00024536表达水平的试剂。

所述的用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的试剂盒，包含一对通过RT-PCR特异性扩增TCONS_00024536的引物，其引物序列为：

F：5’-TAGGAAGGGCTGTTGACTGG-3’

R：5’-CTGGGAGCTGGATTCAGAAG-3’。

申请人发现TCONS_00024536在脓毒血症并急性肾损伤患者中表达上调(图2)，提示TCONS_00024536是诊断、预测脓毒血症并急性肾损伤的分子标记物。本发明为脓毒血症急性肾损伤诊断、预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。

附图说明

图1为LncRNA的芯片表达谱分析结果。

A.热图；B.脓毒症AKI与对照组和脓毒症非AKI与对照组相比中上调的LncRNA，C.脓毒症AKI与脓毒症非AKI相比上调和下调的LncRNA,D脓毒症AKI与对照组和脓毒症非AKI与对照组相比中下调的LncRNA；E,脓毒症非AKI与对照组上调同时在脓毒症AKI与对照组中下调的LncRNA，脓毒症非AKI与对照组上调同时在脓毒症AKI与对照组中下调的LncRNA；F代表TCONS_00024536在脓毒症AKI与对照组相比上调，在脓毒症非AKI与对照组相比下调。

图2为RT-PCR验证了TCONS_00024536在对照、脓毒症AKI、脓毒症非AKI中的表达情况，A.TCONS_00024536和内参GAPDH；B为灰度分析。差异具有统计学意义。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：筛选与脓毒血症并发急性肾损伤相关的分子标记物

1.样本收集

收集健康人、脓毒血症非急性肾损伤、脓毒血症并发急性肾损伤患者

血液标本。

2.RNA样品的制备和质量分析

使用康为世纪公司的Trizol提取总RNA，具体操作步骤如下：

1)取2mL收集在柠檬酸钠处理过的试管中的全血，放入无酶离心管中；

2)收集血浆：3000rpm离心10min，小心地从样品顶部吸走上清(血浆)放入另一无酶离心管中；

3)取250μL血浆液体，转至1.5ml的离心管中，750μL的TRIzol试剂，手动剧烈振荡管体至混匀。

4)匀浆后样品于15-30℃孵育5分钟。

5)于匀浆的样品中加入0.2mL的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15-30℃孵育2-3分钟。4℃下12,000rpm离心15分钟。

6)离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。吸取500μL水相转移到新离心管中。

7)于新离心管加入500μL异丙醇，混匀以沉淀其中的RNA。混匀后15-30℃孵育10分钟后，于4℃12,000rpm离心10分钟。

8)移去上清液，加入至少1mL的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后4℃7,500rpm离心5分钟。

9)去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟。

10)加入无RNA酶水20uL，用移液器反复吹打几次。然后盖好盛有RNA的离心管，存于-80℃冰箱中。

11)RNA质量分析：使用ND-1000测定将上述提取的RNA浓度和纯度。

3.高通量转录组测序

1)RNA-seq读段定位

2)转录丰度评估

3)差异表达基因检测

4.结果

RNA-seq结果如图1所示，预实验使用LncRNA芯片手段研究了来自5名健康对照、15名脓毒症不伴AKI患者和15名脓毒症性AKI患者的血浆。我们通过分析microarray的结果得知：

(1)相比健康人，脓毒症AKI患者的血液样本中有1084个lncRNA表达上调，914个lncRNA表达下调；(2)相比健康人，脓毒症非AKI患者的血浆中有538个lncRNA表达上调，522个lncRNA表达下调；(3)脓毒症AKI与脓毒症非AKI相比有1056个lncRNA表达上调，824个lncRNA表达下调；(4)脓毒症非AKI与对照组及脓毒症AKI与对照组相比均上调的lncRNA有207个，表达都下调的lncRNA有254个；(5)脓毒症非AKI与对照组上调中表达上调，脓毒症AKI与对照组中表达下调的lncRNA有110个；在脓毒症非AKI与对照组中表达下调，脓毒症AKI与对照组中表达上调的lncRNA有87个；(6)代表TCONS_00024536在脓毒症AKI与对照组相比上调了5.2倍，在脓毒症非AKI与对照组相比下调了2倍。上述通过基因芯片结果说明，LncRNA在脓毒症AKI和非AKI中表达均有变化，通过各组的比较最后筛选到在AKI中上调而在非AKI中下调的LncRNA，重点聚焦在显著变化的TCONS_00024536，初步提示LncRNA可以作为一种标记物。

为了进一步验证芯片的结果，我们进一步RT-PCR验证了TCONS_00024536的表达。

实施例2:RT-PCR验证差异性表达

1.根据高通量测序的检测结果选取进行RT-PCR验证。按照实施例1中样本收集方式选择健康人、脓毒血症并发急性肾损伤、脓毒血症非急性肾损伤血液标本。

2.RNA提取步骤同实施例1

3.逆转录：使用ThermoFish公司的逆转录试剂盒进行操作。

4.RT-PCR扩增

1)引物设计

根据TCONS_00024536和Gapdh的基因编码序列设计PCR扩增的引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

TCONS_00024536：

F：5’-TAGGAAGGGCTGTTGACTGG-3’

R：5’-CTGGGAGCTGGATTCAGAAG-3’

Gapdh基因：

F：5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’

R：5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’

2)按照下表配制PCR反应体系(其中Tap MasterMix预混体系购至康为世纪公司)：

PCR反应程序

变性及退火重复35-40个循环。

5.琼脂糖凝胶电泳：取10μLPCR产物在2％琼脂糖凝胶上电泳检测，RT-PCR结果的琼脂糖电泳照片用图像分析系统进行灰度扫描，灰度扫描值(光密度扫描值)为IA，它代表凝胶上目的条带的亮度，即反应目的条带的量。

PCR产物的相对量(IA比值)＝目的片段的IA/内对照GAPDH的IA通过上诉公式计算出cDNA片段在健康对照组、脓毒症并发急性肾损伤组、脓毒血症非急性肾损伤的IA比值，该比值为RT-PCR产物的相对量。

6.结果：结果如图2所示，与健康人、脓毒症非AKI组相比，TCONS_00024536在脓毒症并发急性肾损伤患者血液中的表达上调，RT-PCR的结果验证了LncRNA芯片发现，提示TCONS_00024536可以作为脓毒症AKI的早期诊断分子标记。

上述实施例的说明至少用于理解本发明的方法及其核心思想。在不脱离本发明原理的前提下，对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学湘雅二医院

深圳市赛尔生物技术有限公司

<120> 一种用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的分子标记物、试剂盒及

应用

<130> 无

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1611

<212> RNA

<213> TCONS_00024536的序列

<400> 1

cuuuuuuuuc ccccugagau ggagucucac ucuaucgccc aggcuggagu gcggugcagu 60

ggcauggucu uggcucacug caaccuccac cuccuggguu caagcaauuc uccugccuca 120

gccccccaag uagcugggac uauaggcaug ccccaccacg cccagauuau uuuuguauuu 180

uuaguagaga caggguuuca ccauauuggc caggcugguc ucgaacuccu gaccucaaga 240

ucugcccacc uuggccuccc aaagugcugg gauuacaggc gugagcuacu augcccagcc 300

uguccaccuc uuccuuuagc aaacaaaauc ccugggcgac cagagugacc ccagaaauug 360

gaggagggca gagaccccgu cuuuggaggu gauguggagg guguccaggc ccgcccuugu 420

cucacaggcg cacacccugc uggaggccaa gugucggaca ugaaggugac gcugccccau 480

gcuguccaga cacccagcaa ugcucagcac ccggaaacag gaccggccuc ugcucugcgu 540

ggagcccacc cggacagucc aucucagccc cuucuaccca gggaccccca ggccccugcc 600

cgcaugcagg aacuguccuc ugggcagagc agcccccucc ccaugagggu cucgcaggcc 660

caggacucgc guccagcagc uccuggacau ggccuugcug cccggccagg gcuagugucc 720

gugaacagag aauagugugu gugagcggcu cugucaucug ucacuugggg cugccugugu 780

cccucuccag gaccucagug ccgaucgcag gaaaggaugu uggcacggcc cccgguggga 840

caggccagcc acguuagggg augcugcacg acaaagccca cggcgguggu gucacaugaa 900

ugucaccugc ucuucacacc cagccuagga agggcuguug acuggaggcu gacauaccca 960

gcgaggccuc ugacgucccu gucacccccu ggggugggag aguccccucu uccagccugu 1020

cuggggccuu gccccucccu acagcccagc ucgggaaaca aaugcuccuu ccagcagcag 1080

cagagagcug uagagccggg gcuccgggca gcuucugaau ccagcuccca ggccacagau 1140

cacagggaca ggacgggagc cucccacaca gacgccaggc agcaggaccc cggcugggaa 1200

gucacaucca aaggacagaa ccaccugccc aaguccccuc cacuucugag aaccaccugc 1260

ccaagucccc uccacgucug agaaccaccu gcccaagucc ccuccacauc ugaacacuca 1320

uugcuguguc cggacgcaga aauucacacu cggauuuugu ccggcauucc cacucccugc 1380

ccugcuugga gaggcaggac cgcaggucug ccggccccaa cggcagcgcc acagugcccg 1440

gcacagaggc cugcuggucg cgcauacaaa gcacccgccg gccauuauca uuccggagcc 1500

ggccagagcc ucccggcugc aucucaucgg ucauucagca gcccguaaug acuugucagu 1560

uccuugcccu gccauuuucu gucuaauuaa uucuuuuauu gugcaccgga u 1611

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 特异性扩增TCONS_00024536的引物F

<400> 2

taggaagggc tgttgactgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 特异性扩增TCONS_00024536的引物R

<400> 3

ctgggagctg gattcagaag 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Gapdh基因引物F

<400> 4

caaggtcatc catgacaact ttg 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Gapdh基因引物R

<400> 5

gtccaccacc ctgttgctgt ag 22

Claims

1.一种用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的分子标记物TCONS_00024536，序列如SEQ ID NO：1所示。

2.检测TCONS_00024536表达水平的产品在制备早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤工具中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR或者实时定量PCR检测TCONS_00024536表达水平的制剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用RT-PCR检测

TCONS_00024536表达水平的特异性扩增TCONS_00024536的引物序列为：

F：5’-TAGGAAGGGCTGTTGACTGG-3’

R：5’-CTGGGAGCTGGATTCAGAAG-3’。

5.一种用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的试剂盒，其特征在于，包含通过RT-PCR或者实时定量PCR检测TCONS_00024536表达水平的试剂。

6.根据权利要求5所述的用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的试剂盒，其特征在于，包含一对通过RT-PCR特异性扩增TCONS_00024536的引物，其引物序列为：

F：5’-TAGGAAGGGCTGTTGACTGG-3’

R：5’-CTGGGAGCTGGATTCAGAAG-3’。