CN110878353B - miR-376b的应用及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了miR‑376b的应用及检测试剂盒。具体涉及检测miR‑376b的试剂在制备预测患有脓毒血症的人或鼠中急性肾损伤制剂中的应用。在脓毒血症急性肾损伤患者中，尿miR‑376b表达下调，血肌酐值或尿素氮值与尿miR‑376b表达均存在负相关性。提示miR‑376b表达下调可能与脓毒血症患者的急性肾损伤相关。本发明结果表明，miR‑376b可作为脓毒血症AKI诊断的生物标记物，具有早期诊断的优势和较高的敏感性及特异性。

Description

miR-376b的应用及检测试剂盒

技术领域

本发明属于脓毒血症患者急性肾损伤检测技术领域，具体涉及一种检测miR-376b的试剂在制备预测脓毒血症患者急性肾损伤制剂中的应用，以及检测试剂盒。

背景技术

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)，亦称急性肾衰竭，是由多种原因引起的肾脏功能快速下降甚至丧失，导致机体不能及时将体内各种毒素和代谢产物排泄出去，进而使得各种有害物质或者体内的正常代谢产物在体内蓄积，引起机体内环境的紊乱和代谢异常，并出现全身各个系统的症状。在临床上，AKI主要由脓毒血症，缺血再灌注(IR)损伤和各种内源性以及外源性肾毒素物质引起。其中，脓毒血症占所有AKI病例的近一半。此外，据统计，脓毒血症的发病率也在不断上升。根据一项针对美国人群的回顾性分析，在22年间，脓毒血症诊断的年增长率为8.7％。肾脏对脓毒血症损伤极其敏感，而且脓毒血症AKI的死亡率高达70％，是脓毒血症致死的重要独立危险因素。但目前对脓毒血症AKI的发病机制的了解十分有限，临床上早期诊断困难。因此，找到一个能够早期诊断发现脓毒血症患者AKI的指标，具有重要的意义。

根据KDIGO指南，血清肌酐和尿量是AKI诊断和分期的金标准.然而，这两个指标也有很大的局限性。主要表现为血清肌酐和尿量易受多种因素的影响，如有效循环血容易不足或利尿剂的使用。因此，近年来，一些新型蛋白标志物也被应用于AKI的诊断，包括肾损伤分子-1(KIM-1)，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)，金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP2)，胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)和胱抑素C。但是，在脓毒血症AKI的诊断中，这些指标仍然具有很大的局限性。如在没有AKI的情况下，脓毒血症本身也会引起NGAL的上调，诊断缺乏特异性。关键的是，脓毒血症AKI小管损伤轻微，这些蛋白质指标在尿液中并不会出现明显的上调。

MicroRNAs(miRNAs)是一类由21-25个核苷酸组成的小分子非编码RNAs，它们能够在细胞内调控相应靶基因的表达。通过定量检测血液和尿液中的microRNAs分子表达量，可协助诊断AKI，并实时监测病情的发展和转归。与传统生化指标相比，miRNAs在生物体液中非常稳定，不易降解，容易分析和量化。同时关键的是，基于Taqman的miRNAs检测是高度特异性的，因为它以碱基互补配对为原则，是基于核酸序列的。这些优点提示我们可以使用miRNAs作为AKI的诊断和判断疾病预后的分子指标。同时，基于PCR的扩增能够在少量体液中测量非常少量的miRNA，具有高度的诊断敏感性。这些优点提示我们可以使用miRNAs作为脓毒血症AKI的诊断和判断疾病预后的分子指标。

发明内容

本发明的第一个目的是提供miR-376b的应用，具体是检测miR-376b的试剂在制备预测患有脓毒血症的人或鼠中急性肾损伤制剂中的应用。该试剂用于预测或者诊断患有脓毒血症的人或鼠患急性肾损伤的风险。

上述的miR-376b序列分为人源性：aucauagaggaaaauccauguu或者鼠源性：aucauagaggaacauccacuu。

上述检测人源性miR-376b的试剂用于制备预测患有脓毒血症的人中急性肾损伤制剂。

上述检测鼠源性miR-376b的试剂用于制备预测患有脓毒血症的鼠中急性肾损伤制剂。

本发明基于首次发现miR-376b与脓毒血症患者中的急性肾损伤的关联性，进而获得miR-376b在脓毒血症患者急性肾损伤的相关检测产品制备中的新应用。对早期诊断、预测脓毒血症并急性肾损伤有重要意义。

进一步具体的，所述的检测miR-376b的试剂包括检测尿液或者肾组织中表达量的试剂。

通过试验发现，在脓毒血症急性肾损伤模型中血液、尿液或者肾组织中均存在miR-376b下调的现象，但在尿液或肾组织中，差异达到了显著的水平。因此，本发明扩大了检测对象范围，提升了检测的便利性。

进一步的，申请人发现通过原位杂交，进一步证实在脓毒血症AKI中，miR-376b主要在肾小管中的表达下调。因此，本发明所述的检测miR-376b的试剂还可以是检测肾小管中表达量的试剂。

进一步地，从试剂的检测类型来说，所述的检测miR-376b的试剂包括，但不限于PCR检测试剂或者原位杂交检测试剂。

优选：使用Taqman探针法检测。

对人：提取患者尿标本中的Total RNA，使用taqman探针合成cDNA(人源性miR-376b探针、引物货号：001102，taqman microRNA Reverse Transcirption Kit，均购自于ThermoFisher公司)，采用TaqMan-based Real-time-PCR测定miR-376b(

Universal Master Mix II,no UNG，购自于ThermoFisher公司)。

对鼠：提取小鼠肾组织Total RNA，使用taqman探针合成cDNA(鼠源性miR-376b探针，引物货号：002452，taqman microRNA Reverse Transcirption Kit，均购自于ThermoFisher公司)，采用TaqMan-based Real-time-PCR测定经基因芯片分析的microRNA分子miR-376b(

Universal Master Mix II,no UNG，购自于ThermoFisher公司)。

或者提取小鼠尿液Total RNA(QIAGEN miRNeasy Serum/Plasma Kit，购自于QIAGEN公司)，同样使用taqman探针合成cDNA(试剂同前)，采用TaqMan-based Real-time-PCR测定尿miR-376b的表达(试剂同前)。

本发明首次发现脓毒血症急性肾损伤模型中血肌酐值或尿素氮值与尿miR-376b表达均存在负相关性，为进一步研究脓毒血症急性肾损伤的重要指标血肌酐值或尿素氮值与尿miR-376b之间的关系打下基础，研发前景好。

本发明的第二个目的是提供预测脓毒血症患者急性肾损伤试剂盒，包含检测miR-376b表达量的试剂。该试剂盒制备方便，使用简单，结果准确，敏感性和特异性均较高。

进一步的，所述的检测miR-376b表达量的试剂类型包括但不限于PCR检测试剂或者原位杂交检测试剂。

进一步的，所述的检测miR-376b表达量的试剂包括：检测尿液或者肾组织中表达量的试剂。

进一步的，所述的检测miR-376b表达量的试剂为检测肾小管中表达量的试剂。

本发明通过试验及结果分析在脓毒血症急性肾损伤患者中，其血、尿和肾组织miR-376b表达均下调，但在尿液中其相关性更好，提示miR-376b表达下调可能与脓毒血症引发的急性肾损伤相关。首次发现脓毒血症急性肾损伤模型中血肌酐值或尿素氮值与尿miR-376b表达均存在负相关性。这个发现为使用尿miR-376b下降水平作为诊断脓毒血症AKI并监测脓毒血症AKI病情的发展和转归提供了依据。

本发明发现的miR-376b,与传统生化指标相比，miRNAs在生物体液中非常稳定，不易降解，容易分析和量化。同时关键的是，基于Taqman的miRNA检测是高度特异性的，因为它以碱基互补配对为原则，是基于核酸序列的。此外，基于PCR的扩增能够在少量体液中测量非常少量的miRNA，具有高度的诊断敏感性。

本发明主要优势是能够早期从脓毒血症病人中筛选出患有AKI的病人，从而能够做到对脓毒血症AKI的早发现，早治疗，极大的降低脓毒血症AKI的死亡率。尿[TIMP2]*[IGFBP7]是通过美国FDA认证的能够早期诊断AKI的敏感指标，该指标在AKI中的诊断价值已经受到广泛的认同。本发明发现的尿miR-376b与尿[TIMP2]*[IGFBP7]相比，尿miR-376bAUC值更高(0.81)，因此，其诊断价值优于尿[TIMP2]*[IGFBP7]。

本发明结果表明，通过分析脓毒血症AKI中microRNA表达的变化，鉴定出可以用于脓毒血症AKI早期诊断和预后分析的microRNA mi-376b，提高脓毒血症AKI的早期诊出率、准确率，改善其治疗和预后，提高了脓毒血症AKI患者的生存率。

附图说明

图1：以脂多糖内毒素(lipopolysaccharide,LPS)腹腔注射诱导小鼠脓毒血症AKI模型中小鼠血清肌酐值、血清尿素氮值、肾组织石蜡切片HE染色变化图；

其中A：小鼠血清肌酐值；B:小鼠血清尿素氮值；C：肾组织石蜡切片HE染色。

图2：在LPS处理后，不同时间点RT-PCR特异性扩增小鼠肾组织中miR-376b示意图。

图3：原位杂交证实在脓毒血症AKI中miR-376b在肾小管中的表达下调图。

图4：提取小鼠尿液Total RNA，采用TaqMan-based Real-time-PCR测定尿miR-376b的表达图。

图5：脓毒血症AKI的血肌酐值及尿素氮值与尿miR-376b表达均存在负相关性图；

其中A:脓毒血症AKI患者尿miR-376b的水平相较于脓毒血症非AKI患者尿miR-376b的水平明显降低；B：脓毒血症患者尿miR-376b的水平与血清肌酐值的相关分析；C：脓毒血症患者尿miR-376b的水平与血清尿素氮值的相关分析。

图6：受试者工作特征曲线(ROC)评价尿miR-376b作为脓毒血症AKI诊断指标的有效性。

图7：尿[TIMP2]*[IGFBP7]诊断脓毒血症AKI的ROC曲线。

图8：检测血液中miR-376b的表达；

其中A:在LPS诱导的脓毒血症AKI小鼠模型中不同时间点血清miR-376b的表达水平变化B:在脓毒血症AKI患者和脓毒血症非AKI患者中血清miR-376b的表达水平。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1

基因芯片分析：以脂多糖内毒素(lipopolysaccharide,LPS)腹腔注射诱导小鼠脓毒血症AKI，以芯片技术分析了肾组织microRNA表达谱的变化。结果表明：在LPS处理24小时后，部分microRNA表达上调或者下调，其中包括miR-376b。这些结果揭示了microRNA在脓毒血症AKI中的可能变化趋势，为接下来的实验奠定了基础。

动物实验设计：

C57BL/6小鼠，周龄6-8周，购买自长沙斯莱克景达实验动物有限公司。我们以LPS(购买自美国sigma公司)腹腔注射(剂量10mg/kg)诱导脓毒血症动物模型。具体分组如下表1:(LPS溶于生理盐水中，control组单纯注射生理盐水)

表1

注射完毕，将小鼠放回饲养笼中，供给正常的饮食和饮水。在设定的时间点分批处死小鼠，收取肾组织和血液标本，进行进一步的分析，control组在24h时间点处死。

图1：A：小鼠血清肌酐值；B:小鼠血清尿素氮值；C：肾组织石蜡切片HE染色。在LPS处理12h后，与control组相比，肾脏病理和功能损伤开始出现，表明在小鼠腹腔注射LPS后，成功诱发了脓毒血症AKI的动物模型，损伤在24h时间点最严重，48h后损伤已经部分恢复。

在上述的动物模型中，提取小鼠肾组织Total RNA，结合前期基因芯片分析结果，使用taqman探针合成cDNA(鼠源性miR-376b探针，引物货号：002452，taqman microRNAReverse Transcirption Kit，均购自于ThermoFisher公司)，采用TaqMan-based Real-time-PCR测定经基因芯片分析的microRNA分子miR-376b(

Universal Master MixII,no UNG，购自于ThermoFisher公司)。结果见图2，我们发现，在LPS处理后，小鼠miR-376b表达下调，在24h降到最低。同时，通过原位杂交，进一步证实在脓毒血症AKI中，miR-376b主要在肾小管中的表达下调。结果见图3。

此外，我们进一步提取小鼠尿液Total RNA(QIAGEN miRNeasy Serum/PlasmaKit，购自于QIAGEN公司)，同样使用taqman探针合成cDNA(试剂同前)，采用TaqMan-basedReal-time-PCR测定尿miR-376b的表达(试剂同前)。结果见图4。我们发现，在LPS处理12h后，尿液中的miR-376b开始出现下降，在24h时进一步下降。提示了尿miR-376b作为脓毒血症AKI诊断指标的可能性。

实施例2

除了动物实验，同时收集了临床标本，进行了相关临床试验和检测。共收集我院(中南大学湘雅二医院)脓毒血症患者尿标本共40例；其中20例脓毒血症合并AKI，20例脓毒血症无AKI(对照)(所有脓毒血症患者收集时既往均体健，部分基础指标及炎症指标见下表2)。

表2

	脓毒血症非AKI	脓毒血症AKI	P值
				性别(男/女)	13/7	8/12	0.12
年龄	54.85±4.11	55.20±4.13	0.94
				血肌酐,μmol/L	76.71±7.25	345.20±53.63	<0.01*
血尿素氮(mg/dL)，mmol/L	5.72±0.67	26.24±2.46	<0.01*
				血清白蛋白,g/L	25.72±0.78	28.07±0.96	0.07
血红蛋白,g/L	100.3±4.81	100.2±4.48	0.99
				中性粒细胞,X109	13.48±1.01	13.5±1.07	0.98
血沉	80.21±6.81	58.71±8.03	0.04*
				C反应蛋白,mg/L	187.2±16.46	171.5±34.72	0.68
降钙素原,ng/L	18.5±6.75	23.09±6.53	0.63

提取患者尿标本中的Total RNA，使用taqman探针合成cDNA(人源性miR-376b探针、引物货号：001102，taqman microRNA Reverse Transcirption Kit，均购自于ThermoFisher公司)，采用TaqMan-based Real-time-PCR测定miR-376b(

Universal Master Mix II,no UNG，购自于ThermoFisher公司)。结果发现，与脓毒血症无AKI患者相比：脓毒血症AKI患者尿液miR-376b表达下调。为了探究脓毒血症患者血肌酐与尿素氮值是否与尿miR-376b表达存在一定的相关性，进行了血肌酐及尿素氮与尿miR-376b表达的相关分析。结果表明：血肌酐值及尿素氮值(采用从BioAaasy Systems公司购买的肌酐测定试剂盒(货号：DICT-500)和尿素氮测定试剂盒(货号：DIUR-500)测定)与尿miR-376b表达均存在负相关性。该实验说明尿miR-376b可以预测脓毒血症急性肾损伤，可用于检测脓毒血症AKI的预后和转归)，二者均有统计学意义。具体结果见图5。

实施例3

我们使用受试者工作特征曲线(ROC)评价尿miR-376b作为脓毒血症AKI诊断指标的有效性。结果如图6，AUC＝0.81，具有较好的诊断价值。根据ROC曲线，我们在约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)最大处认为诊断效果最佳，依此原理确定的诊断界值为尿miR-376b<0.69倍。我们最终确定的诊断界值及其诊断的敏感性和特异性如表3。

表3

尿[TIMP2]*[IGFBP7]是通过美国FDA认证的能够早期诊断AKI的敏感指标，该指标在AKI中的诊断价值已经收到广泛的认同。本发明采用相同的样本，测定尿[TIMP2]*[IGFBP7]，其尿[TIMP2]*[IGFBP7]诊断脓毒血症AKI的ROC曲线见图7，说明尿miR-376b与尿[TIMP2]*[IGFBP7]相比，尿miR-376b AUC值更高(0.81)，因此，其诊断价值优于尿[TIMP2]*[IGFBP7]。

结论：

以上动物实验和临床研究结果表明，尿miR-376b下调可从脓毒血症患者中诊断出脓毒血症AKI的患者，具有较高的敏感性及特异性。

实施例4

本发明检测了血液中miR-376b的表达,在脓毒血症AKI和脓毒血症非AKI中血miR-376b水平无统计学差异，而尿液中的miR-376b明显下调，见图8。说明miR-376b的下调单纯由肾脏损伤引起，而非其他脏器，因此能够作为脓毒血症AKI的诊断标志物。

序列表

<110> 中南大学湘雅二医院

<120> miR-376b的应用及检测试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

aucauagagg aaaauccaug uu 22

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 鼠(Muroidea)

<400> 2

aucauagagg aacauccacu u 21

Claims (4)

1.miR-376b的应用，其特征在于，检测miR-376b的试剂在制备预测患有脓毒血症的人或鼠中急性肾损伤制剂中的应用，所述的miR-376b序列分为人源性：AUCAUAGAGGAAAAUCCAUGUU或者鼠源性：AUCAUAGAGGAACAUCCACUU；所述的检测miR-376b的试剂为检测尿液或者肾组织中的miR-376b表达量的试剂。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测人源性miR-376b的试剂用于制备预测患有脓毒血症的人中急性肾损伤制剂，检测鼠源性miR-376b的试剂用于制备预测患有脓毒血症的鼠中急性肾损伤制剂。

3.根据权利要求1所述的应用，所述的试剂是检测肾小管中miR-376b表达量的试剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测miR-376b的试剂包括PCR检测试剂或者原位杂交检测试剂。

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