TWI718474B

TWI718474B - 評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法及其套組

Info

Publication number: TWI718474B
Application number: TW108103917A
Authority: TW
Inventors: 馬念涵; 黃秋錦; 張兆祥; 陳建隆; 李安倫
Original assignee: 國立中央大學; 中國醫藥大學
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2021-02-11
Also published as: US20200248268A1; TW202030331A

Abstract

提供一種評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法，包含測量個體的樣本中至少一種微型糖核酸表現量，微型核糖核酸由miR-1274、miR-19、miR-30、及miR-708所組成；比對對照組與樣本相同的微型核糖核酸表現量，以評估個體是否具有罹患泌尿上皮癌之風險。另提供一種評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的套組，包含至少一試劑用於辨識個體的樣本中的至少一種微型核糖核酸表現量如前所述。

Description

評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法及其套組

本發明是有關於一種評估方法及其套組，且特別是有關於一種評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法及其套組。

泌尿上皮癌(Urothelial carcinoma，UC)是台灣泌尿系統特有型態的癌症，發生率在慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)病人第3至5期由55%上升到71%，顯示泌尿上皮癌的發生在的慢性腎臟病族群有正向關係。截至2015年慢性腎臟病全球盛行率為8~16%，泌尿上皮癌的診斷除了病史詢問、理學檢查外，最重要的就是尿液檢驗、尿液細胞學檢查和泌尿道影像檢查。泌尿上皮癌的初期症狀不明顯，主要是以血尿和腰痛來表現，且確診時癌症往往已較晚期。由於目前沒有適當的腫瘤標記供診斷和追蹤治療之用，造成此疾病常較晚發現和死亡率較高。

因此，如何發展可檢測泌尿上皮癌的生物標記，現有技術實有待改善的必要。

本揭示內容的目的在於提供一種評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法與套組，以非侵入的方式達成精準度高的檢測效果。

本揭示內容提供了一種評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法，包含：測量個體的樣本中至少一種微型核糖核酸表現量，微型核糖核酸係選自於由miR-1274、miR-19a、miR-30及miR-708所組成之群組；以及比對對照組與樣本相同的微型核糖核酸表現量，其中當樣本的至少一微型核糖核酸係選自於由miR-1274、miR-30及miR-708所組成之群組的表現量低於對照組對應的微型核糖核酸表現量，及/或當樣本的微型核糖核酸miR-19a表現量高於對照組的微型核糖核酸表現量，則個體被評估為具有罹患泌尿上皮癌之風險。

在一些實施方式中，對照組係取自一群已知未罹患泌尿上皮癌的個體。

在一些實施方式中，個體為接受透析治療之患者。

在一些實施方式中，樣本包含腹水、血液、尿液、糞便、胃液、膽汁或其組合。

本揭示內容另提供了一種評估慢性腎臟病的個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法，包含：測量慢性腎臟病的個體的樣本中至少一種微型核糖核酸表現量，微型核糖核酸係選自於由miR-1274、miR-19a、miR-30、miR-708、miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636所組成之群組；以及比對對照組與樣本相同的微型核糖核酸表現量，其中當樣本的至少一微型核糖核酸係選自於由miR-1274、miR-30、miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636所組成之群組的表現量低於對照組對應的微型核糖核酸表現量，及/或當樣本的至少一微型核糖核酸係選自於由miR-19a及miR-708所組成之群組的表現量高於對照組對應的微型核糖核酸表現量，則慢性腎臟病的個體被評估為具有罹患泌尿上皮癌之風險。

在一些實施方式中，對照組係取自一群已知未罹患泌尿上皮癌的慢性腎臟病個體。

在一些實施方式中，慢性腎臟病的個體為接受透析治療之患者。

本揭示內容另提供了一種評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法，包含：測量個體的樣本中複數微型核糖核酸表現量，這些微型核糖核酸包含miR-1274、miR-19a、miR-30及miR-708；將這些微型核糖核酸表現量進行運算獲得預測分數S；提供參考值S0；以及評估個體患有泌尿上皮癌的風險程度，當預測分數S大於或等於參考值S0，則個體被評估為具有罹患泌尿上皮癌之風險。

在一些實施方式中，預測分數S藉由將這些微型核糖核酸表現量以下列公式進行運算所獲得：預測分數S=-2.061+(1.698 * A)+(1.300 * B)+(0.861 * C)+(1.330 * D) 式(1)，其中當miR-1274的表現量小於或等於34.41時，A=1，當miR-1274的表現量大於於34.41時，A=0；當miR-19a大於或等於0.0002243時，B=1，當miR-19a小於0.0002243時，B=0；當miR-30的表現量小於或等於3.798時，C=1，當miR-30的表現量大於3.798時，C=0；以及當miR-708大於或等於2.235 * 10^-7時，D=1，當miR-708小於2.235 * 10^-7時，D=0。

在一些實施方式中，提供參考值S0步驟，包含：測量一群已知未罹患以及一群已知罹患泌尿上皮癌的個體的樣本中複數微型核糖核酸表現量，這些微型核糖核酸為miR-1274、miR-19a、miR-30及miR-708；以及將這群已知未罹患以及這群已知罹患泌尿上皮癌的個體的樣本中這些微型核糖核酸表現量，以接受者操作特徵曲線計算，獲得截斷值即為參考值S0。

在一些實施方式中，這些微型核糖核酸更包含miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636。

在一些實施方式中，預測分數S藉由將這些微型核糖核酸表現量以下列公式進行運算所獲得：預測分數S=-3.471+(1.258 * A)+(0.590 * B)+(0.327 * C)+(1.042 * D)-(0.561 * E)+(1.605 * F)-(0.172 * G)+(0.413 * H)+(1.541 * I) 式(2)，其中當miR-1274的表現量小於或等於34.41時，A=1，當miR-1274的表現量大於34.41時，A=0；當miR-19a大於或等於0.0002243時，B=1，當miR-19a小於0.0002243時，B=0；當miR-30的表現量小於或等於3.798時，C=1，當miR-30的表現量大於3.798時，C=0；當miR-708大於或等於2.235 * 10^-7時，D=1，當miR-708小於2.235 * 10^-7時，D=0；當miR-155小於或等於1.227時，E=1，當miR-155大於1.227時，E=0；當miR-19b小於或等於0.3685時，F=1，當miR-19b大於0.3685時，F=0；當miR-210小於或等於1.797時，G=1，當miR-210大於1.797時，G=0；當miR-378小於或等於0.7642時，H=1，當miR-378大於0.7642時，H=0；以及；當miR-636小於或等於0.5524時，I=1，當miR-636大於0.5524時，I=0。

在一些實施方式中，提供參考值S0步驟，包含：測量一群已知未罹患以及一群已知罹患泌尿上皮癌的個體的樣本中複數微型核糖核酸表現量，這些微型核糖核酸為miR-1274、miR-19a、miR-30、miR-708、miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636；以及將這群已知未罹患以及這群已知罹患泌尿上皮癌的個體的樣本中這些微型核糖核酸表現量，以接受者操作特徵曲線計算，獲得截斷值即為參考值S0。

在一些實施方式中，個體包含接受透析治療之患者或慢性腎臟病之患者。

本揭示內容另提供了一種評估個體是否罹患泌尿上皮癌的套組，包含：至少一試劑，試劑用於辨識個體的樣本中的至少一種微型核糖核酸表現量，其中微型核糖核酸係選自於由miR-1274、miR-19a、miR-30、miR-708、miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636所組成之群組。

在一些實施方式中，所述至少一試劑包含多個試劑，這些試劑用於辨識樣本中的微型核糖核酸為miR-1274、miR-19a、miR-30、及miR-708。

在一些實施方式中，所述至少一試劑包含多個試劑，這些試劑用於辨識樣本中的微型核糖核酸為miR-1274、miR-19a、miR-30、miR-708、miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636。

在一些實施方式中，試劑包含引子對、探針或其組合。

100:方法

102、104、106、108、110、112:步驟

本發明上述和其他態樣、特徵及其他優點參照說明書內容並配合附加圖式得到更清楚的瞭解。

第1圖根據本揭示內容之一些實驗例，篩選用於檢測泌尿上皮癌的微型核糖核酸的流程。

第2圖為本揭示內容之一些實驗例，顯示在對照組、慢性腎臟病組(CKD)和泌尿上皮癌組(UC)患者的樣本中的 miR-1274a的表現量。

第3圖為本揭示內容之一些實驗例，顯示在對照組、慢性腎臟病組(CKD)和泌尿上皮癌組(UC)患者的樣本中的miR-19a-5p的表現量。

第4圖為本揭示內容之一些實驗例，顯示在對照組、慢性腎臟病組(CKD)和泌尿上皮癌組(UC)患者的樣本中的miR-30a-5p的表現量。

第5圖為本揭示內容之一些實驗例，顯示在對照組、慢性腎臟病組(CKD)和泌尿上皮癌組(UC)患者的樣本中的miR-708-5p的表現量。

第6圖為本揭示內容之一些實驗例，顯示在對照組、慢性腎臟病組(CKD)和泌尿上皮癌組(UC)患者的樣本中的miR-155-5p的表現量。

第7圖為本揭示內容之一些實驗例，顯示在對照組、慢性腎臟病組(CKD)和泌尿上皮癌組(UC)患者的樣本中的miR-19b-1-5p的表現量。

第8圖為本揭示內容之一些實驗例，顯示在對照組、慢性腎臟病組(CKD)和泌尿上皮癌組(UC)患者的樣本中的miR-210-3p的表現量。

第9圖為本揭示內容之一些實驗例，顯示在對照組、慢性腎臟病組(CKD)和泌尿上皮癌組(UC)患者的樣本中的miR-378a-3p的表現量。

第10圖為本揭示內容之一些實驗例，顯示在對照組、慢性腎臟病組(CKD)和泌尿上皮癌組(UC)患者的樣本中的 miR-636的表現量。

第11圖顯示四組微型核醣核酸表現量同時以接受者操作特徵(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析的結果。

第12圖顯示九組微型核醣核酸表現量同時以接受者操作特徵曲線分析的結果。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文將參照附圖來描述本發明之實施方式與具體實施例；但這並非實施或運用本揭示內容具體實施例的唯一形式。以下所揭示的各實施例，在有益的情形下可相互組合或取代，也可在一實施例中附加其他的實施例，而無須進一步的記載或說明。

於本文中，除非內文中對於冠詞有所特別限定，否則『一』與『該』可泛指單一個或多個。將進一步理解的是，本文中所使用之『包含』、『包括』、『具有』及相似詞彙，指明其所記載的特徵、區域、整數、步驟、操作、元件與/或組件，但不排除其它的特徵、區域、整數、步驟、操作、元件、組件，與/或其中之群組。

雖然下文中利用一系列的操作或步驟來說明在此揭露之方法，但是這些操作或步驟所示的順序不應被解釋為本揭示內容的限制。例如，某些操作或步驟可以按不同順序進行及/或與其它步驟同時進行。此外，並非必須執行所有繪示的操作、步驟及/或特徵才能實現本揭示內容的實施方式。此外，在此所述的每一個操作或步驟可以包含數個子步驟或動作。

本揭示內容一些實施態樣中，提供一種評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法。在一實施例中，適合以本揭示內容之評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法來評估的泌尿上皮癌，可包括因長期腹膜透析、慢性腎臟病所引發的泌尿上皮癌，亦可以是無其他病因而罹患泌尿上皮癌。

上述個體可包括，但不限於人類、猩猩、猴子、貓、狗、兔子、天竺鼠、大鼠或小鼠。在一實施例中，上述個體可為接受透析治療之患者。

慢性腎臟病跟泌尿上皮癌有密切的關連，其中慢性腎臟病定義和分期標準是由美國腎臟基金會(Kidney Disease Outcome Quality Initiative，簡稱KDOQI)於2002年制定。慢性腎臟病是指出現腎臟損害或腎絲球過濾率(glomerular filtration rate，GFR)<60mL/min/1.73m²且持續超過三個月以上，並將慢性腎臟病依據GFR分為五期如下表1：

請參見第1圖，繪示篩選與泌尿上皮癌相關的微型核糖核酸的流程圖。

方法100起始於步驟102，收集接受透析治療患者的尿液及/或血液樣本。由於這群患者有高度泌尿上皮癌發生率，因此比較這群患者中，無泌尿上皮癌患者(對照組及/或CKD組)和有泌尿上皮癌患者(UC組)的微型核糖核酸表現量的差異。

在一些實施例中，對照組可為從未罹患泌尿上皮癌的受試者獲得樣本。在一實施例中，對照組為正常受試者。

之後，步驟104為從尿液及/或血液樣本中萃取總微型核糖核酸。微型核糖核酸在人類的組織與細胞樣本中非常穩定，不易被降解，在許多體液中如血液、唾液、尿液、腹水等樣本都可以偵測得到微型核糖核酸。本揭示內容的一些實驗例係檢測患者尿液及/或血液樣本中的微型核糖核酸。

本文所述「微型核糖核酸(micro ribosomal nucleic acid，miRNA)」，又名為微小核糖核酸、小核糖核酸、微核糖核酸、小分子核糖核酸。微型核糖核酸是由19至25個核苷酸所組成的小型非編碼家族，其通過序列特異性辨識信使核糖核酸(mRNA)後，抑制信使核糖核酸的轉譯、或降解信使核糖核酸來調節基因的表達。

之後，步驟106為將總微型核糖核酸反轉錄為互補的去氧核糖核酸(complementary DNA，cDNA)。

之後，步驟108為進行微型核糖核酸陣列實驗，將反轉錄的cDNA以微型核糖核酸晶片檢測，檢測晶片所涵蓋的可檢測微型核糖核酸之表現。例如，TaqMan^® Array Human MicroRNA A Cards v2.0晶片可用於檢測近三百八十種人類微型核糖核酸之表現，獲得目標微型核糖核酸之互補去氧核糖核酸的循環閾值(cycle threshold，CT)。

之後，步驟110為資料分析和挑選候選基因。由微型核糖核酸陣列實驗的結果，可以挑出在無泌尿上皮癌患者和有泌尿上皮癌患者之間，表現量有明顯差異的特定的微型核糖核酸。例如，有些特定的微型核糖核酸在泌尿上皮癌患者的樣本中表現量較高，另一些特定的微型核糖核酸在泌尿上皮癌患者的樣本中表現量較低；或是，有些特定的微型核糖核酸在泌尿上皮癌患者的樣本中表現量較低，另一些特定的微型核糖核酸在泌尿上皮癌患者的樣本中表現量較高。這些特定的微型核糖核酸可做為檢測泌尿上皮癌的候選基因。

之後，步驟112為驗證候選基因。進一步地再對這些候選基因做驗證，例如進行即時定量聚合酵素鏈鎖反應(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)，測量這些個別的候選基因在非泌尿上皮癌患者和泌尿上皮癌患者之間的表現量。

在一些實施例中，測量微型核糖核酸表現量的方法，可藉由例如定量或半定量即時定量聚合酵素鏈鎖反應(real-time PCR)、北方墨點法(northern blotting analysis)、液相雜交(liquid hybridization)等方法測量微型核糖核酸的表現量。

在一些實施例中，計算CT值的正規化包括兩種方法。第一種是用RNU6(U6 small nuclear RNA)作正規化，這個方式是利用微型核糖核酸陣列中的RNU6的CT值當作參考點，透過2^-△CT這一個公式轉換成表現量，其中的△CT為「目標微型核糖核酸之互補去氧核糖核酸的CT值減去RNU6的CT值」。第二種方法是利用微型核糖核酸陣列中，所有被偵測到的微型核糖核酸的CT值的平均當作參考點，透過2^-△CT公式轉換成表現量，其中的△CT為「目標微型核糖核酸的CT值減去平均的CT值」。

在本揭示內容中，利用接收者操作特徵(ROC)曲線獲得檢測泌尿上皮癌之敏感度(sensitivity)和特異度(specificity)。例如：利用「prism」這套軟體繪製接收者操作特徵曲線，輸入的資料為正規化後的微型核糖核酸的表現量；在計算部分皆使用預設值進行，接著挑選概似比(likelihood ratio)最大情況下相對應的值當作截斷值(cut off)，藉由截斷值進而得出靈敏度與特異度。

此外，在一些實驗例中，還包含測試不同的微型核糖核酸之組合，對於各個微型核糖核酸的表現量做數值運算，並以多元邏輯回歸分析方式(例如：羅吉斯回歸分析，Logistic regression)，建立模型公式，以用於評估泌尿上皮癌的風險。

本揭示內容另一些實施態樣中，提供一種檢測微型核糖核酸的試劑在製備泌尿上皮癌風險判斷的套組(試劑盒)的應用，其中微型核糖核酸選自於由miR-1274、miR-19a、miR-30、miR-708、miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、miR-636及其組合所組成之群組。

在一些實施方式中之所檢測的序列，微型核糖核酸為源自於人類，其中miR-1274為hsa-miR-1274a(如SEQ ID NO.1)；miR-30為hsa-miR-30a-5p(如SEQ ID NO.2)；miR-19a為hsa-miR-19a-5p(如SEQ ID NO.3)；miR-708為hsa-miR-708-5p(如SEQ ID NO.4)；miR-155為hsa-miR-155-5p(如SEQ ID NO.5)；miR-19b為hsa-miR-19b-1-5p(如SEQ ID NO.6)；miR-210為hsa-miR-210-3p(如SEQ ID NO.7)；miR-378為hsa-miR-378a-3p(如SEQ ID NO.8)；及miR-636為hsa-miR-636(如SEQ ID NO.9)。微型核糖核酸及其登記號碼(miRBase Mature sequence accession number)為：hsa-miR-30a-5p(MIMAT0000087)；hsa-miR-19a-5p(MIMAT0004490)；hsa-miR-708-5p(MIMAT0004926)；hsa-miR-155-5p(MIMAT0000646)；hsa-miR-19b-1-5p(MIMAT0004491)；hsa-miR-201-3p(MIMAT0000267)；hsa-miR-378a-3p(MIMAT0000732)；及hsa-miR-636(MIMAT0003306)。

在一些實施方式中，套組可能為試劑盒的型式，且套組更包括PCR反應的常用試劑，如檢測微型核糖核酸的引子或探針、緩衝液，去氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP)、氯化鎂、純水和Taq聚合酶等。

在一些實施方式中，其中的探針或引子可能固定於固體載體，例如晶片。

實施例1

單一種微型核醣核酸對泌尿上皮癌的預測

1.1 收集檢體

收集50位正常受試者的檢體、111位罹患慢性腎臟病患者的檢體、及111位罹患慢性腎臟病且具有泌尿上皮癌患者的檢體(表2)，以進一步分析微型核糖核酸與泌尿上皮癌的相關性。對於已經確診為慢性腎臟病且具有泌尿上皮癌(UC組)的患者，分析微型核糖核酸之表現與慢性腎臟病(CKD組，無罹患泌尿上皮癌)或正常受試者(對照組)之間的差異，並評估是否可以作為篩選罹患泌尿上皮癌的生物標記。

「^a」：單因子變異數分析分析(Oneway ANOVA test)；「^b」：皮爾森卡方檢定(Pearson Chi-Square test)。

1.2 萃取與定量微型核糖核酸

以常規的方式，萃取患者的尿液或血液中的總微型核糖核酸(total miRNA)，並且按照TaqMan^® MicroRNA Reverse Transcriptase原廠所提供的步驟取600奈克(ng)總微型核糖核酸進行反轉錄，獲得互補去氧核糖核酸。接著互補去氧核糖核酸依照TaqMan^® Array Human MicroRNA A Cards v2.0原廠所提供的步驟進行微型核糖核酸陣列的實驗。具體而言，利用原廠所提供的螢光探針來偵測miR-1274(如SEQ ID NO.1)、miR-30(如SEQ ID NO.2)、miR-19a(如SEQ ID NO.3)、miR-708(如SEQ ID NO.4)、miR-155(如SEQ ID NO.5)、miR-19b(如SEQ ID NO.6)、miR-210(如SEQ ID NO.7)、miR-378(如SEQ ID NO.8)、miR-636(如SEQ ID NO.9)、miR-126-3p(如SEQ ID NO.10；MIMAT0000445)、miR-202-3p(如SEQ ID NO.11；MIMAT0002811)、miR-210-3p(如SEQ ID NO.12；MIMAT0000267)、及miR-33b-5p(如SEQ ID NO.13；MIMAT0003301)之互補去氧核糖核酸，並進行擴增反應同時釋放出螢光物質。透過偵測螢光強度以得到miR-1274、miR-19a、miR-30、miR-708、miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636之互補去氧核糖核酸的CT值。最後，以RNU6作正規化，將微型核糖核酸之互補去氧核糖核酸的CT值減去RNU6的CT值獲得△CT，再由公式2^-△CT取對數值轉換成表現量。

評估個體罹患泌尿上皮癌之風險

請參看第2圖至第5圖，分別顯示萃取自尿液中的四種微型核糖核酸miR-1274、miR-19a、miR-30及miR-708在對照組、CKD組和UC組的數值散佈圖。各組別上方的數值表示對照組與CKD組、對照組與UC組、CKD組與UC組之間的統計P值，並判斷P值是否具有顯著差異如P<0.05、P<0.01或P<0.001。第2、4、5圖顯示於UC組的微型核糖核酸miR-1274、miR-30、及miR-708表現量皆低於對照組。不過，第3圖顯示於UC組的微型核糖核酸miR-19a表現量則高於對照組。因此，至少一種微型核糖核酸miR-1274、miR-19a、miR-30、或miR-708可作為評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的生物標記。

評估慢性腎臟病患者罹患泌尿上皮癌之風險

請參看第2圖至第10圖，其中第6圖至第10圖分別顯示萃取自血液中的五種微型核糖核酸miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636在對照組、CKD組和UC組的數值散佈圖。第2、4、6-10圖顯示於UC組的微型核糖核酸miR-1274、miR-30、miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636表現量皆低於CKD組。不過，第3、5圖顯示於UC組的微型核糖核酸miR-19a及miR-708表現量則高於CKD組。因此，至少一種微型核糖核酸miR-1274、miR-19a、miR-30、miR-708、miR-155、 miR-19b、miR-210、miR-378、或miR-636可作為評估慢性腎臟病患者罹患泌尿上皮癌之風險的生物標記。

1.3羅吉斯回歸分析

如上述第1.2節，將CKD組與UC組由公式2^-△CT取對數值轉換成表現量後，分別以羅吉斯回歸分析進行模式預測。選擇敏感度與特異度最佳之泌尿上皮癌預測機率作為截斷值，並繪出接受者操作特徵曲線。計算接受者操作特徵曲線下的面積(area under curve，AUC)，其中AUC=0.5為無鑑別力，隨著AUC數值越大，鑑別能力越強。下表2顯示這些微型核糖核酸表現量的比值的曲線下面積至少大於0.58。

表3顯示，若待測檢體的微型核糖核酸miR-1274表現量小於或等於其對應之截斷值34.61、miR-19a表現量大於或等於其對應之截斷值0.0002243、miR-30表現量小於或等於其對應之截斷值3.798、 miR-708表現量大於或等於其對應之截斷值2.235*10^-7、miR-155表現量小於或等於其對應之截斷值1.227、miR-19b表現量小於或等於其對應之截斷值0.3685、miR-210表現量小於或等於其對應之截斷值1.797、miR-378表現量小於或等於其對應之截斷值0.7642、miR-636表現量小於或等於其對應之截斷值0.5524，則評估個體具有高度風險罹患泌尿上皮癌。因此，至少一種微型核糖核酸表現量大於或小於其對應的截斷值，評估個體具有高度風險罹患泌尿上皮癌。

比較例1

取實施例1的1.1節中CKD組與UC組，CKD組與UC組的微型核糖核酸表現量的偵測方法同實施例1的第1.2節。表4顯示不同於表3的九組微型核糖核酸表現量，分析是否適合作為評估泌尿上皮癌風險的生物標誌。分析方式同實施例1第1.3節，計算接受者操作特徵曲線下的面積。

由上表4可知，以上四組微型核糖核酸miR-126-3p、miR-202-3p、miR-210-3p及miR-33b-5p的曲線下面積數值接近0.5，被視為無鑑別力。因此，並非任何微型核醣核酸皆可作為評估個體具有高度風險罹患泌尿上皮癌的生物標誌。

實施例2

同時使用四組微型核醣核酸表現量對泌尿上皮癌的預測

取實施例1中CKD組與UC組中的四組微型核醣核酸(miR-1274、miR-19a、miR-30與miR-708)表現量，同時以羅吉斯回歸分析進行模式預測。

預測分數S=-2.061+(1.698*A)+(1.300*B)+(0.861*C)+(1.330*D) 式(1)。

當miR-1274的表現量小於或等於34.61時，A=1，當miR-1274的表現量大於34.61時，A=0；當miR-19a大於或等於0.0002243時，B=1，當miR-19a小於0.0002243時，B=0；當miR-30的表現量小於或等於3.798時，C=1，當miR-30的表現量大於3.798時，C=0；以及當miR-708大於或等於2.235*10^-7時，D=1，當miR-708小於2.235*10^-7時，D=0。之後以ROC曲線進行分析，結果如表5與第11圖所示。

請參閱第11圖所示，曲線下面積為0.8211顯示鑑別能力高。由上表5可知，當截斷值為0.4830，可得到敏感度為79.5%、特異度為70.4%。因此，同時使用四組微型核醣核酸表現量預測泌尿上皮癌，可獲得精準的預測結果。

實施例3

同時使用九組微型核醣核酸表現量對泌尿上皮癌的預測

取實施例1中CKD組與UC組的九組微型核醣核酸(miR-1274、miR-19a、miR-30、miR-708、miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636)表現量，同時以羅吉斯回歸分析進行模式預測。

預測分數S=-3.471+(1.258*A)+(0.590*B)+(0.327*C)+(1.042*D)-(0.561*E)+(1.605*F)-(0.172*G)+(0.413*H)+(1.541*I) 式(2)。

當miR-1274的表現量小於或等於34.61時，A=1，當miR-1274的表現量大於34.61時，A=0；當 miR-19a大於或等於0.0002243時，B=1，當miR-19a小於0.0002243時，B=0；當miR-30的表現量小於或等於3.798時，C=1，當miR-30的表現量大於3.798時，C=0；當miR-708大於或等於2.235*10^-7時，D=1，當miR-708小於2.235*10^-7時，D=0；當miR-155小於或等於1.227時，E=1，當miR-155大於1.227時，E=0；當miR-19b小於或等於0.3685時，F=1，當miR-19b大於0.3685時，F=0；當miR-210小於或等於1.797時，G=1，當miR-210大於1.797時，G=0；當miR-378小於或等於0.7642時，H=1，當miR-378大於0.7642時，H=0；以及；當miR-636小於或等於0.5524時，I=1，當miR-636大於0.5524時，I=0。之後以ROC曲線進行分析，結果如表6與第12圖所示。

請參閱第12圖所示，曲線下面積為0.8607顯示鑑別能力高。由上表6可知，當截斷值為-0.3095，可得到敏感度為85%、特異度為72%。因此，同時使用九組微型核醣核酸表現量預測泌尿上皮癌，相較於使用四組微型核醣核酸可獲得更精準的預測結果。

雖然本揭示內容已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本揭示內容，任何熟習此技藝者，在不脫離本揭示內容之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本揭示內容之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110> 國立中央大學中國醫藥大學

<120> 評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法及其套組

<130> NP-23794-TW

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

<210> 5

<211> 24

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

<210> 6

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

<210> 9

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

<210> 10

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

<210> 12

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Horno sapiens)

<400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

100‧‧‧方法

102、104、106、108、110、112‧‧‧步驟

Claims

一種評估一個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法，包含：測量該個體的一樣本中至少一種微型核糖核酸表現量，該微型核糖核酸係選自於由miR-1274、miR-30及miR-708所組成之群組；以及比對一對照組與該樣本相同的該微型核糖核酸表現量，其中當該樣本的至少一微型核糖核酸係選自於由miR-1274、miR-30及miR-708所組成之群組的表現量低於該對照組對應的該微型核糖核酸表現量，則該個體被評估為具有罹患泌尿上皮癌之風險。
如請求項1所述的方法，其中該對照組係取自一群已知未罹患泌尿上皮癌的個體。
如請求項1所述的方法，其中該個體為接受透析治療之患者。
如請求項1所述之方法，其中該樣本包含腹水、血液、尿液、糞便、胃液、膽汁或其組合。
一種評估一慢性腎臟病的個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法，包含：測量該慢性腎臟病的個體的一樣本中至少一種微型核糖核酸表現量，該微型核糖核酸係選自於由miR-1274、 miR-30、miR-708、miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636所組成之群組；以及比對一對照組與該樣本相同的該微型核糖核酸表現量，其中當該樣本的至少一微型核糖核酸係選自於由miR-1274、miR-30、miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636所組成之群組的表現量低於該對照組對應的該微型核糖核酸表現量，及/或當該樣本的至少一微型核糖核酸係miR-708的表現量高於該對照組對應的該微型核糖核酸表現量，則該慢性腎臟病的個體被評估為具有罹患泌尿上皮癌之風險。
如請求項5所述的方法，其中該對照組係取自一群已知未罹患泌尿上皮癌的慢性腎臟病個體。
如請求項5所述的方法，其中該慢性腎臟病的個體為接受透析治療之患者。
如請求項5所述之方法，其中該樣本包含腹水、血液、尿液、糞便、胃液、膽汁或其組合。
一種評估一個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法，包含：測量該個體的一樣本中複數微型核糖核酸表現量，該些微型核糖核酸包含miR-1274、miR-19a、miR-30及miR-708；將該些微型核糖核酸表現量進行運算獲得一預測分數S；提供一參考值S0；以及評估該個體患有泌尿上皮癌的風險程度，當該預測分數S大於或等於該參考值S0，則該個體被評估為具有罹患泌尿上皮癌之風險。
如請求項9所述的方法，其中該預測分數S藉由將該些微型核糖核酸表現量以下列公式進行運算所獲得：預測分數S=-2.061+(1.698*A)+(1.300*B)+(0.861*C)+(1.330*D) 式(1)，其中當miR-1274的表現量小於或等於34.61時，A=1，當miR-1274的表現量大於34.61時，A=0；當miR-19a大於或等於0.0002243時，B=1，當miR-19a小於0.0002243時，B=0；當miR-30的表現量小於或等於3.798時，C=1，當miR-30的表現量大於3.798時，C=0；以及當miR-708大於或等於2.235*10^-7時，D=1，當miR-708小於2.235*10^-7時，D=0。
如請求項9所述之方法，其中提供該參考值S0步驟，包含：測量一群已知未罹患以及一群已知罹患泌尿上皮癌的個體的樣本中複數微型核糖核酸表現量，該些微型核糖核酸為miR-1274、miR-19a、miR-30及miR-708；以及將該群已知未罹患以及該群已知罹患泌尿上皮癌的個體的樣本中該些微型核糖核酸表現量，以一接受者操作特徵曲線計算，獲得一截斷值即為參考值S0。
如請求項9所述的方法，其中該些微型核糖核酸更包含miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636。
如請求項12所述的方法，其中該預測分數S藉由將該些微型核糖核酸表現量以下列公式進行運算所獲得：預測分數S=-3.471+(1.258*A)+(0.590*B)+(0.327*C)+(1.042*D)-(0.561*E)+(1.605*F)-(0.172*G)+(0.413*H)+(1.541*I) 式(2)，其中當miR-1274的表現量小於或等於34.61時，A=1，當miR-1274的表現量大於34.61時，A=0；當miR-19a大於或等於0.0002243時，B=1，當miR-19a小於0.0002243時，B=0；當miR-30的表現量小於或等於3.798時，C=1，當miR-30的表現量大於3.798時，C=0；當miR-708大於或等於2.235*10^-7時，D=1，當miR-708小於2.235*10^-7時，D=0；當miR-155小於或等於1.227時，E=1，當miR-155大於1.227時，E=0；當miR-19b小於或等於0.3685時，F=1，當miR-19b大於0.3685時，F=0；當miR-210小於或等於1.797時，G=1，當miR-210大於1.797時，G=0；當miR-378小於或等於0.7642時，H=1，當miR-378大於0.7642時，H=0；以及；當miR-636小於或等於0.5524時，I=1，當miR-636大於0.5524時，I=0。
如請求項12所述的方法，其中提供該參考值S0步驟，包含：測量一群已知未罹患以及一群已知罹患泌尿上皮癌的個體的樣本中複數微型核糖核酸表現量，該些微型核糖核酸為miR-1274、miR-19a、miR-30、miR-708、miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636；以及將該群已知未罹患以及該群已知罹患泌尿上皮癌的個體的樣本中該些微型核糖核酸表現量，以一接受者操作特徵曲線計算，獲得一截斷值即為參考值S0。
如請求項9所述的方法，其中該個體包含接受透析治療之患者或慢性腎臟病之患者。
如請求項9所述之方法，其中該樣本包含腹水、血液、尿液、糞便、胃液、膽汁或其組合。
一種評估一個體是否罹患泌尿上皮癌的套組，包含：至少一試劑，該試劑用於辨識該個體的一樣本中的至少一種微型核糖核酸表現量，其中該微型核糖核酸係選自於由miR-1274、miR-19a、miR-30、miR-708、miR-155、 miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636所組成之群組。
如請求項17所述之套組，其中所述至少一試劑包含多個試劑，該些試劑用於辨識該樣本中的微型核糖核酸為miR-1274、miR-19a、miR-30、及miR-708。
如請求項17所述之套組，其中所述至少一試劑包含多個試劑，該些試劑用於辨識該樣本中的微型核糖核酸為miR-1274、miR-19a、miR-30、miR-708、miR-155、miR-19b、miR-210、miR-378、及miR-636。
如請求項17所述之套組，其中該試劑包含引子對、探針或其組合。