CN116254335A - Adam12生物标志物在冠状动脉扩张症诊断中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了ADAM12生物标志物在冠状动脉扩张症诊断中的应用，本发明能够更准确的判断冠状动脉扩张症。实验证明，通过检测本发明的生物标志物ADAM12可以判断受试者是否患有冠状动脉扩张症，具有很高的实际应用价值。

Description

ADAM12生物标志物在冠状动脉扩张症诊断中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及ADAM12生物标志物在冠状动脉扩张症诊断中的应用。
背景技术
冠状动脉扩张症(CAE)是指各种原因造成冠状动脉局限性或弥漫性扩张超过其邻近正常冠脉管径的1.5倍或以上的疾病。常累及多支血管，以右冠状动脉扩张多见，是一种少见的冠状动脉异常，男性多于女性。2018年被列入国家卫生健康委员会等5部门联合制定的《第一批罕见病目录》。
冠状动脉扩张症的发病机制尚不清楚，冠脉中层弹力纤维的降解和缺失被认为是发病的中心环节，多种因素如高同型半胱氨酸血症、高胰岛素血症、肺炎支原体感染、一氧化氮过度暴露等，导致细胞外基质金属蛋白酶及细胞内半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶等活性增强，引起冠脉中层及内外弹性膜的降解，造成炎性细胞向血管中层的弥散，促进局部血管平滑肌细胞的增殖和迁移及细胞外基质的生成，最终引起冠状动脉的扩张性重塑。
冠状动脉扩张症临床表现通常是无症状，仅在心脏检查时偶然发现。稳定型心绞痛是最常见的症状，当自发夹层形成时也可出现恶性心律失常甚至猝死。由于其不易发现的性质，冠状动脉扩张症的提前诊断和预测变得及其重要。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术存在的不足，提供ADAM12生物标志物在冠状动脉扩张症诊断中的应用，能够更准确的判断冠状动脉扩张症。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测样本中ADAM12生物标志物的试剂在制备诊断冠状动脉扩张症的产品中的应用。
进一步，所述试剂选自：特异性识别ADAM12基因的探针，或特异性扩增ADAM12基因的引物，或特异性结合ADAM12基因编码的蛋白的结合剂。
本发明中特异性结合ADAM12基因编码的蛋白的结合剂例如蛋白质ADAM12的受体、结合蛋白质ADAM12的凝集素、针对蛋白质ADAM12的抗体、针对蛋白质ADAM12的肽抗体、双特异性结合剂或双特异性抗体形式。特异性结合剂的具体例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。
进一步，所述检测样本包括但不限于体液(例如血液、血浆、血清、外周血、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水等)、渗出液、骨髓、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻、喉或生殖器拭子的提取物、消化组织的细胞悬浮液、或粪类物质的提取物、以及来自人、动物(例如非人哺乳动物)的组织和器官样本，以及由此衍生出的加工样本。
进一步，所述检测样本为外周血。
进一步，所述试剂可以以单一剂型配制，或者可替换地分别配制单独试剂并以任选的具有其使用说明的试剂盒的形式一起提供。
进一步，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸或核酸膜条。
进一步，所述芯片包括基因芯片和蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测ADAM12基因转录水平的针对ADAM12基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括ADAM12蛋白的特异性抗体或配体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测ADAM12基因转录水平的试剂或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测ADAM12蛋白表达水平的试剂或芯片；所述试纸包括基因检测试纸、蛋白检测试纸。
进一步，所述条膜包括基底和固定于所述基底上的特异性识别ADAM12的探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。
进一步，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。
进一步，所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。
进一步，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。
进一步，所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述试剂盒包括通过western印迹法、ELISA、放射性免疫测定、放射性免疫扩散法、奥克特洛尼免疫扩散法、火箭电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀测定法、补体结合测定法、FACS、蛋白质芯片检测法检测ADAM12基因或蛋白表达水平的试剂。
进一步，所述试剂盒包括检测ADAM12基因或蛋白的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。
本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。
在某些实施方案中，本文提供的是用于检测一种生物标志物的mRNA水平的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种生物标志物的mRNA特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、mRNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。
本发明还提供了一种体外检测样本中ADAM12表达水平的产品，所述产品包括能够分析检测出前面中所述的生物标志物的表达水平的试剂。
进一步，所述样本包括但不限于体液(例如血液、血浆、血清、外周血、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水等)、渗出液、骨髓、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻、喉或生殖器拭子的提取物、消化组织的细胞悬浮液、或粪类物质的提取物、以及来自人、动物(例如非人哺乳动物)的组织和器官样本，以及由此衍生出的加工样本。
在本发明的上下文中，所使用的术语“样本”是指获得自或衍生自受试者的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，样本是指来源于受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。
进一步，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸或核酸膜条。
进一步，所述芯片包括基因芯片和蛋白芯片
进一步，所述基因芯片包括用于检测ADAM12基因转录水平的针对ADAM12基因的寡核苷酸探针。
进一步，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。
进一步，所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。
进一步，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。
进一步，所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述蛋白芯片包括ADAM12蛋白的特异性抗体或配体
进一步，所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒。
进一步，所述所述基因检测试剂盒包括用于检测ADAM12基因转录水平的试剂或芯片。
进一步，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测ADAM12蛋白表达水平的试剂或芯片。
进一步，所述试纸包括基因检测试纸、蛋白检测试纸。
进一步，所述试剂盒包括通过western印迹法、ELISA、放射性免疫测定、放射性免疫扩散法、奥克特洛尼免疫扩散法、火箭电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀测定法、补体结合测定法、FACS、蛋白质芯片检测法检测ADAM12基因或蛋白表达水平的试剂。
在本发明中本领域技术人员通过已知的测定法进行生物标志物表达量的测定，具体测定法包括多分析物谱测试、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法、蛋白质印迹测定法、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光测定法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定法或狭线印迹测定法。
本发明还提供了前面所述的产品在制备诊断冠状动脉扩张症的工具中的应用。
本发明还提供了ADAM12在构建预测冠状动脉扩张症的计算模型中的应用。
在某些实施方案中，在本文使用的“受试者”指代哺乳动物，如啮齿动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物。具体地，根据本发明的受试者是人。
ADAM12的基因ID为8038，在本发明中，ADAM12包括野生型、突变型或其片段。在本领域通用测序分析中，会将原始测序结果比对到人的参考基因组上，因此筛选结果中的ADAM12可能会包含不同的转录本，只要可以比对到参考基因组上的ADAM12(基因ID：8038)即可。目前已经公开的ADAM12有多个亚型。
在本发明上下文中，所使用的术语“生物标志物”是指基因，与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品相比，它在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中差异地存在(即增加或减少)。该术语通常是指一种基因的浓度、含量或两种或更多种基因的浓度、含量。
术语“探针”是指包括在促进杂交的条件下与核酸或其补体中的靶标序列特异性杂交，从而允许检测靶标序列或其扩增的核酸的核酸寡聚体或适体。检测可以是直接(即由直接与靶标或扩增的序列杂交的探针产生)或间接(即由与连接探针和靶标或扩增的序列的中间分子结构杂交的探针产生)的。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了一种冠状动脉扩张症的新的分子标志物-ADAM12基因，通过检测受试者外周血中ADAM12的表达水平，可以判断受试者是否患有冠状动脉扩张症，从而指导临床医生对受试者的预防和治疗方案整理优化；同时利用分子标志物来实现疾病的诊断和治疗，相比传统手段，具有更高的特异性和灵敏度。
附图说明
图1是蛋白互作网络图；
图2是ADAM12诊断冠状动脉扩张症的ROC曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
在实践中，接受者操作特征曲线(ROC曲线)通常通过绘制变量值与其在“正常”(例如，没有产前病症或病状的明显健康个体)和“疾病”群体(类似地，例如，两种不同状态，如病毒性和细菌性RTI或典型和非典型肺炎)中的相对频率来计算。对于任何特定的标志物，患有和未患有疾病/病状的受试者的标志物水平的分布可能会重叠。在这样的条件下，测试不能以100％的准确度绝对区分正常和疾病，且重叠区域可能指示测试不能区分正常和疾病的位置。选择阈值，低于该阈值的检验被认为是“异常”，高于该阈值的检验被认为是“正常”，或者低于或高于该阈值的检验指示特定病状。ROC曲线下面积(AUC)是感知测量将允许正确鉴定病状的概率的量度。即使测试结果不一定提供准确的数字，也可以使用ROC曲线。只要可以对结果进行排名，就可以创建ROC曲线。
ROC曲线的水平轴代表(1-特异性)，其随着假阳性率的增加而增加。曲线的垂直轴表示灵敏度，其随真阳性率的增加而增加。因此，对于选择的特定截止值，可以测定(1-特异性)的值，并且可以获得相应的灵敏度。ROC曲线下的面积是所测量的标志物水平允许正确识别疾病或状况的概率的度量。因此，ROC曲线下面积(AUC)可用于决定检验的有效性。
如上文概述的，除了在本发明的各方面中待检测的特定标志物或标志物小组之外，对于特定诊断或鉴别诊断可以考虑其它参数。如本文所用，参数是可以帮助定义特定系统的特征、特点或可测量因素。参数是健康和生理相关评估的重要要素，如疾病/病症/临床病状风险。此外，将参数定义为客观测量并评估为正常生物过程、致病过程或对治疗性干预的药理应答的指标的特征。
实施例1与冠状动脉扩张症相关的生物标志物的筛选
1、筛选方法
(1)筛选所用的数据及预处理
为了筛选可用于冠状动脉扩张症诊断的生物标志物，从基因表达综合数据库(GEO)中下载与冠状动脉扩张症相关的公共基因表达数据。从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载数据集GSE87016。
从基因表达综合数据库(GEO)下载的数据还需要做进一步处理：
1)所选数据集必须为全基因组的DNA甲基化数据；
2)这些数据来自于冠状动脉扩张症和对照血液样本；
3)本研究均考虑经标准化或者原始数据集。
(2)高通量转录组数据及预处理
通过Illumina平台，得到了大量的样本双端测序数据。鉴于数据错误率对结果的影响，采用Trimmomatic软件对原始数据进行质量预处理，并对整个质控过程中的reads数进行统计汇总。
具体步骤及顺序如下：
(1)去接头(Adaptor)；
(2)去除低质量reads；
(3)从3'端及5'端以不同方式去除低质量碱基；
(4)统计原始测序量，有效测序量，Q30，GC含量，并进行综合评价。
对数据质控后的序列进行数据量统计。
(3)mRNA基因表达水平分析
用已知的参考基因序列以及注释文件作为数据库，采取序列相似性比对的方法鉴定出各蛋白编码基因在各样本中的表达丰度。使用htseq-count软件获取每个样本中比对到蛋白编码基因上的reads数。比对获得counts后，需要对蛋白编码基因进行过滤，去除reads数为零的基因。各样本中检出基因数目如表1所示，表1检出基因数目统计部分结果展示
Figure BDA0004128775500000081
FPKM法能消除蛋白编码基因长度和测序量差异对计算蛋白编码基因表达的影响，计算得到的基因表达量反应表达高或低。
(4)mRNA的差异分析
首先根据counts均值对基因进行过滤，只保留counts均值大于2的基因进行下一步分析。利用DESeq2对各个样本基因的counts数目进行标准化处理(采用BaseMean值来估算表达量)，计算差异倍数，并采用NB(负二项分布检验的方式)进行差异显著性检验，最终根据差异倍数及差异显著性检验结果来筛选差异蛋白编码基因。筛选差异的条件为p<0.05&|log2foldChange|>1。
(5)差异甲基化分析
从GEO数据库下载GSE87016数据集，该数据集包含23个样本的甲基化数据(NOR:CAE＝12:11)，采用CHAMP包对甲基化数据进行差异甲基化分析。设置的筛选标准是P.Value<0.05。
(6)异常甲基化修饰差异表达基因的蛋白互作分析
为了探讨筛选的异常甲基化修饰差异表达基因之间的蛋白相互作用关系，我们用在线数据库STRING构建筛选的20个异常甲基化修饰差异表达基因的PPI网络。
2、结果
利用DESeq2对各个样本基因的counts数目进行标准化处理(采用BaseMean值来估算表达量)，计算差异倍数，并采用NB(负二项分布检验的方式)进行差异显著性检验，最终根据差异倍数及差异显著性检验结果来筛选差异蛋白编码基因。对高通量测序的转录组的mRNA分析，得到152个差异表达基因，包括93个上调，59个下调。
从GEO数据库下载GSE87016数据集，该数据集包含23个样本的甲基化数据(NOR:CAE＝12:11)，采用CHAMP包对甲基化数据进行差异甲基化分析。设置的筛选标准是P.Value<0.05，得到9377个差异甲基化位点，共4318个差异甲基化基因，包括2289个高甲基化基因，2029个低甲基化基因。
对mRNA差异表达基因和差异甲基化基因取交集以获得异常甲基化调控的差异表达基因，得到9个高甲基化修饰表达下调的基因和11个低甲基化修饰的表达上调基因。
为了探讨筛选的异常甲基化修饰差异表达基因之间的蛋白相互作用关系，我们用在线数据库STRING构建筛选的20个异常甲基化修饰差异表达基因的PPI网络。图1显示了用STRING数据库构建的20个异常甲基化修饰差异表达基因的PPI网络。
接着我们把在STRING数据库中获得的结果导入Cytoscape软件(http://www.cytoscape.org/)，并使用CytoHubba插件来筛选核心基因。我们总共采用了3种算法，将每种算法的前10个基因取交集后总共筛选出10个核心基因(表2)。
表2 3种方法筛选异常甲基化修饰差异表达基因的HUB基因
Figure BDA0004128775500000091
实施例2冠状动脉扩张症生物标志物ADAM12诊断效能验证分析
基于高通量转录组数据整合分析的结果，筛选ADAM12作为候选基因，收集冠状动脉扩张症患者血液和对照血液(>15例)，提取RNA样品，利用荧光定量PCR(qRT-PCR)验证候选基因在疾病组和对照组的差异表达。
绘制ADAM12诊断冠状动脉扩张症的ROC曲线图，如图2所示，ADAM12在冠状动脉扩张症诊断中显示出较高的诊断效能，AUC值为0.752，敏感性为0.692，特异性为0.812，提示ADAM12能够针对冠状动脉扩张症进行具有诊断效能的诊断。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测样本中ADAM12生物标志物的试剂在制备诊断冠状动脉扩张症的产品中的应用；
优选地，所述检测样本包括血液、血浆、血清、外周血、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水、渗出液、骨髓、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻、喉或生殖器拭子的提取物、消化组织的细胞悬浮液、或粪类物质的提取物、以及来自人、动物(例如非人哺乳动物)的组织和器官样本，以及由此衍生出的加工样本；
优选地，所述检测样本为外周血。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：特异性识别ADAM12基因的探针，或特异性扩增ADAM12基因的引物，或特异性结合ADAM12基因编码的蛋白的结合剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸或核酸膜条。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述芯片包括基因芯片和蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测ADAM12基因转录水平的针对ADAM12基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括ADAM12蛋白的特异性抗体或配体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测ADAM12基因转录水平的试剂或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测ADAM12蛋白表达水平的试剂或芯片；所述试纸包括基因检测试纸、蛋白检测试纸。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括通过western印迹法、ELISA、放射性免疫测定、放射性免疫扩散法、奥克特洛尼免疫扩散法、火箭电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀测定法、补体结合测定法、FACS、蛋白质芯片检测法检测ADAM12基因或蛋白表达水平的试剂。
6.一种体外检测样本中ADAM12表达水平的产品，其特征在于，所述产品包括能够分析检测出权利要求1中所述的生物标志物的表达水平的试剂。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸或核酸膜条；
优选地，所述芯片包括基因芯片和蛋白芯片；
优选地，所述基因芯片包括用于检测ADAM12基因转录水平的针对ADAM12基因的寡核苷酸探针；
优选地，所述蛋白芯片包括ADAM12蛋白的特异性抗体或配体；
优选地，所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒；
优选地，所述基因检测试剂盒包括用于检测ADAM12基因转录水平的试剂或芯片；
优选地，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测ADAM12蛋白表达水平的试剂或芯片；
优选地，所述试纸包括基因检测试纸、蛋白检测试纸。
8.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括通过western印迹法、ELISA、放射性免疫测定、放射性免疫扩散法、奥克特洛尼免疫扩散法、火箭电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀测定法、补体结合测定法、FACS、蛋白质芯片检测法检测ADAM12基因或蛋白表达水平的试剂。
9.权利要求6-8任一项所述的产品在制备诊断冠状动脉扩张症的工具中的应用。
10.ADAM12在构建预测冠状动脉扩张症的计算模型中的应用。
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