CN105899677B

CN105899677B - 血细胞样品的emt-标志物水平差异用于诊断癌症、特别是结直肠(crc)和胰腺(pc)癌

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Publication number: CN105899677B
Application number: CN201480068270.4A
Authority: CN
Inventors: L·拉吉; G·塞莱斯蒂
Original assignee: Humanitas Mirasole SpA
Current assignee: Humanitas Mirasole SpA
Priority date: 2013-12-16
Filing date: 2014-12-16
Publication date: 2020-03-17
Anticipated expiration: 2034-12-16
Also published as: EP3083988B1; WO2015091575A3; US20160312296A1; EP3083988A2; CN105899677A; PL3083988T3; IL245766B; US10907210B2; EP2883962B1; ES2815526T3; EP2883962A1; ES2651522T3; IL245766A0; WO2015091575A2; BR112016013976A2

Abstract

本发明涉及一种确定对象是否患结直肠癌和胰腺癌或确定结直肠癌的阶段和/或进展的方法。测定血液样品中多个编码参与上皮细胞间质转型的转录因子/基因的mRNA存在与否，其中包括TWIST1、SLUG、ZEB2、ZEB1和CDH1的多个基因具有不同的mRNA水平，由此指示结直肠癌或胰腺癌诊断，和/或结直肠癌的诊断分期，和/或CRC的术后转移性进展。本发明还涉及使用试剂盒来实现该方法。

Description

血细胞样品的EMT-标志物水平差异用于诊断癌症、特别是结直肠(CRC)和胰腺(PC)癌

发明领域

本发明涉及用于疾病诊断、优选用于癌症诊断的分子标志物领域。本发明的目的在于检测和测定生物学样品即肿瘤患者的外周血样品中的参与上皮细胞间质转型的基因的mRNA水平，以确定疾病的存在、其进展和复发的风险。

背景

循环肿瘤细胞(CTCs)是一种从原发性肿瘤或其转移脱落的、循环于外周血的癌症细胞的异质群。目前，癌症患者的全血中的CTCs的原始数量和相关表型与患者的预后临床相关。CTC库包括具有上皮、间充质和类干特征的细胞。已显示人类(Min Yu等，Science，2013，339，580)和动物的癌症内渗与上皮细胞间质转型(EMT)相关，这是一个由转录因子(TFs；例如但不限于TWIST1、ZEB1、ZEB2、SLUG、SNAIL、PRXX1、等)驱动的过程，并且在转移性小生境(niche)中很可能是可逆的(间充质细胞上皮转型，MET)，并接着发生细胞上皮和/或间充质标志物(例如CDH1和Plastin3)改变。

所述的转录因子/基因都参与上皮细胞间质转型(EMT-标志物)。

因此，人血液中的EMT-标志物的检测有望提供诊断和预后的线索。

Celesti等(Gastroenterology 2013，145，647)显示，与来自对照的样品相比，来自结直肠癌症(CRC)患者血液样品的TWIST1 mRNA水平在统计学上(中位数)明显更高。不巧的是，患者和对照的TWIST1水平分布部分重叠，造成对诊断而言，单独测定TWIST1 mRNA不可靠、不适合。

Hung Pham等(Pancreas 2010，39，3，332-339)提出：胰腺癌组织样品中的SLUGmRNA过表达与PDGH的下调相关，导致PGE2产出增加。但是，该文献没有说单独测定血液样品中的SLUG mRNA对诊断胰腺癌而言是可靠且适宜的。

发明内容

通常，FDA批准的方法(即“细胞搜索”(Veridex公司)、“AdnaTest乳腺癌筛选”以及“Adnatest乳腺癌检测”(AdnaGen AG公司)、“Biocept Onco CEE”(生物概念实验室(Biocept Laboratories))通过检测CTCs等表达的上皮抗原表达。因此这些测试的诊断和预后价值有限。

本文作者展示了特异性针对肿瘤患者的循环细胞中的上皮细胞间质转型(EMT)基因的定量RT-PCR试验。与现有技术所报告的不同，在提取mRNA之前，不需要先进行循环细胞群的分离。该方式能够检测循环EMT-TF的转录水平升高，不论是何抗原或表型的细胞特征。

本文作者发现CRC患者的血细胞中有高水平的TWIST1、SLUG和低水平的ZEB1mRNA，而胰腺癌(PC)患者的血细胞中则有高水平的SLUG、TWIST 1和ZEB2 mRNA患者，据此可进行更可靠且确信的诊断。

因此，本发明的目的之一是一种确定对象是否患癌症的方法，该方法包括检测来自所述对象的血细胞样品中是否存在一组mRNA、其中至少包括SLUG和TWIST1 mRNA，其中

a)TWIST1和SLUG基因的mRNA水平高于对照样品而ZEB2基因的mRNA水平不高于对照样品指示结直肠癌，

b)TWIST1、SLUG、和ZEB2基因的mRNA水平均高于对照样品指示胰腺癌，

c)至少SLUG mRNA水平高于第一SLUG界限值(cut-off)指示结直肠或胰腺癌，

d)在SLUG mRNA水平不高于第一SLUG界限值的对象中，TWIST1mRNA水平高于TWIST1界限值指示结直肠癌，条件是所述对象还显示SLUG mRNA高于于第二SLUG界限值，所述第二SLUG界限值低于第一SLUG界限值，且/或CDH1 mRNA水平低于CDH1界限值，

e)在SLUG mRNA水平不升高的对象中，TWIST1 mRNA水平高于TWIST1界限值指示胰腺癌，条件是所述对象还显示ZEB2 mRNA水平升高。

在上述方法中，对照样品是来自正常对象或非PC、非CRC癌症患者的样品。

优选地，在根据本发明的方法中，SLUG和TWIST1 mRNA水平均高于各自界限值指示结直肠或胰腺癌。

优选地，在根据本发明的方法中，在SLUG mRNA水平高于第一SLUG界限值而TWIST1mRNA水平没有高于TWIST1界限值的对象中，ZEB2mRNA水平高于ZEB2界限值指示胰腺癌。

优选地，在根据本发明的方法中，在SLUG mRNA水平高于第一SLUG界限值而TWIST1mRNA水平没有高于TWIST1界限值的对象中，CDH1mRNA水平低于CDH1界限值指示结直肠癌。

优选地，在根据本发明的方法中，各界限值如下：

-结直肠癌的第一SLUG界限值7.93018E-9，

-结直肠癌的第二SLUG界限值1.84E-10，

-胰腺癌的第一SLUG界限值3.27E-9，

-结直肠癌的TWIST1界限值1.00725E-8，

-胰腺癌的TWIST1界限值1.35E-8，

-CDH1界限值：7.29E-8，

-胰腺癌的ZEB2界限值：7.19E-6。

本发明的另一个目的是一种在根据上述方法得到阳性结果的对象中区分结直肠癌和胰腺癌的方法，该方法包括分析来自所述对象的血细胞样品，其中，相对于来自结直肠癌患者的合适对照，ZEB1和/或ZEB2和/或CDH1 mRNAs中任一升高指示胰腺癌。

优选地，在上述方法中，ZEB2 mRNA水平高于界限值4.08E-5且/或CDH1 mRNA高于界限值1.022E-7。

本发明的另一个目的是一种确定患病对象结直肠癌阶段的方法，该方法包括分析来自所述对象的血细胞样品，其中：

a)ZEB1 mRNA水平高于来自结直肠癌患者的对照样品指示次晚期结直肠癌且/或

b)CDH1 mRNA水平低于来自结直肠癌患者的对照样品指示诊出转移性(即IV期)疾病，且/或

c)TWIST1 mRNA水平高于来自结直肠癌患者的对照样品指示异时性转移发展。

在上述用于确定结直肠癌阶段的方法中，在步骤a)中，对照样品可以是来自结直肠癌阶段已知的对象的样品；在步骤b)中，对照样品可以是来自患有结直肠癌但没有转移病灶的对象的样品；在步骤c)中，对照样品可以是来自患有结直肠癌但没有发生转移的对象的样品。

根据本发明的方法中，所述血细胞样品优选富集了循环肿瘤细胞(CTC)的细胞样品。

优选地，所述富集了循环肿瘤细胞(CTC)的细胞样品是外周血单核细胞(PBMC)样品。

在根据本发明的方法中，mRNA水平优选通过RT-PCR测定。

本领域技术人员所知的检测血液样品中特定mRNA的各种其他方法也在本发明的范围内。示例性的例子有：PCR扩增方法(QX200^TM Droplet Digital^TM PCR系统、TaqMan探针)、其他扩增方法；以及单细胞基因表达分析(miRGE-

)。

本发明的方法能够检测人类或动物血液样品中的EMT转录产物；例如，该方法可包括以下步骤：

a)外周血单核细胞(PBMC)的菲科尔(Ficoll)密度梯度分离，

b)使用RT-PCR进行的EMT基因表达水平检测，

c)患者和正常对照的EMT基因水平的比较，

d)如果检测所得的EMT基因水平统计学上显著地不同于正常水平(高于或低于视所选基因而预先确定的界限值)，则将患者诊断为特定肿瘤。

本发明的另一个目的是用定量RT-PCR试剂盒来实施上述方法：

-用来获得特定cDNA的逆转录手段；

-用来扩增特定cDNA的特定扩增探针；

-检测和测定经扩增特定cDNA水平的检测手段。

优选的所述扩增探针能够用于扩增：

-TWIST1的nt.781-835区域，Acc.No.:NM_000474.3，(SEQ ID No.1)；

-SLUG的nt.730-830区域，Acc.No.:NM_003068.4，(SEQ ID No.2)

-ZEB2的nt.1262-1361区域，Acc.No.:NM_014795.3，(SEQ ID No.3)

-CDH1的nt.4113-4172区域，Acc.No.:NM_004360.3，(SEQ ID No.5)

-ZEB1的nt.2917-3020区域，Acc.No.:NM_001128128.2，(SEQ ID No.6)。

优选地，所述扩增探针具有以下必要序列：

TWIST1-正向：AGCAAGATTCAGACCCTCAAGCT(SEQ ID No.12)；

TWIST1-反向：CCTGGTAGAGGAAGTCGATGTACCT(SEQ ID No.13)；

SLUG-正向：TGTTTGCAAGATCTGCGGC(SEQ ID No.14)；

SLUG-反向：TGCAGTGAGGGCAAGAAAAA(SEQ ID No.15)；

ZEB2-正向：GCTACACGTTTGCCTACCGC(SEQ ID No.16)；

ZEB2-反向：CGATTACCTGCTCCTTGGGTT(SEQ ID No.17)；

CDH1-正向：GGAACTATGAAAAGTGGGCTTG(SEQ ID No.20)；

CDH1-反向：AAATTGCCAGGCTCAATGAC(SEQ ID No.21)；

ZEB1-正向：GAAAGTGATCCAGCCAAATGG(SEQ ID No.22)；

ZEB1-反向：TGGGCGGTGTAGAATCAGAGT(SEQ ID No.23)。

发明详述

本发明将结合非限制性实施例进行说明。

附图说明

图1是69名CRC患者血液中的TWIST1(A)、SLUG(B)、ZEB1(C)mRNA水平与30名健康对照的比较。

图2是69名CRC患者血液中TWIST1(A)、SLUG(B)、ZEB1(C)mRNA水平的ROC曲线与30名健康对照的比较。

图3是基于TWIST1和SLUG两者mRNA循环水平的CRC诊断的算法(两步)。

图4是基于TWIST1-SLUG加CDH1 mRNA循环水平的CRC诊断算法(两步)。

图5是I和II期(pT1-4N0)CRC患者的ZEB1循环mRNA水平。

图6是II期(pT3N0)和III期(pT3N1-2)CRC患者的ZEB1循环mRNA水平。

图7是没有(M0)或具有(M+)诊出转移性疾病的患者的CDH1循环mRNA水平。

图8显示循环血细胞中的高TWIST1 mRNA水平与CRC转移性进程相关(无病存活–DFS-卡普兰迈耶(Kaplan-Meier)曲线)。

图9是PC患者和健康对照的血液中TWIST1、SLUG和ZEB2 mRNA水平。

图10是区分健康对照(n＝30)与PC患者(n＝24)的SLUG mRNA水平ROC曲线。

图11是基于TWIST1-SLUG加ZEB2 mRNA循环水平的PC诊断算法(两步)。

图12是PC患者和CRC患者不同的ZEB1、ZEB2和CDH1循环mRNA水平。

材料与方法

非经选择血液样品中的基因转录产物定量

将外周血(6mL)采集在用抗凝剂(EDTA、柠檬酸钠、肝素)涂覆的真空收集管中并于4℃保存。采集后4小时内用Ficoll-Paque Plus(GE医疗保健生命科学公司(GE HealthcareLife Science))按照制造商的说明对外周血进行梯度分离。简而言之，将15mL的Ficoll-Paque加入离心管并将稀释过的PBS(6mL+29mL平衡盐溶液)小心地铺在Ficoll-plaque上层。该溶液不混合而进行离心(20℃下400g、40分钟)。使用干净的巴斯德移液管移去上层，在界面上留下没有碰触过的淋巴细胞层。接着，用新的巴斯德移液管将PBMC层(包括循环肿瘤细胞)转移至干净的离心管中并用至少3体积(18ml)平衡盐溶液进行清洗。进行重悬后，将细胞离心(20℃下300g、20分钟)，并去除上清。在加入50mL平衡盐溶液后，对细胞沉淀进行最终离心(20℃下200g、20分钟)。再次去除上清并用凯杰公司(Qiagen)的裂解缓冲液和β-巯基乙醇(1:100)裂解细胞。然后使用凯杰公司的Rneasy小试剂盒按照制造商的说明分离出全部RNA。然后，将全部RNA重悬在60μL焦碳酸二乙酯处理过的水(DEPC水)中，用DNA酶(安碧生命科学公司(Ambion，Life Science))进行处理以最大程度减少基因组DNA污染。

所有RNA制备和操作步骤均在层流通风橱中、无RNA的条件下进行。RNA浓度用Nanodrop分光光度计读取260nm处的吸光度来确定。

使用高性能cDNA反转录试剂盒(应用生物系统生命科学公司(AppliedBiosystem，Life Science))将2μg处理过的RNA反转录为cDNA。对合成的cDNA进行定量RT-PCR以检测和量化EMT-基因mRNA水平：

TWIST1：NCBI Acc.No.NM_000474.3(SEQ ID No.1)，

SLUG或SNAI2：NCBI Acc.No.NM_003068.4(SEQ ID No.2)，

ZEB2或SIP1：NCBI Acc.No.NM_014795.3(SEQ ID No.3)，

SNAIL：NCBI Acc.No.NM_005985.3(SEQ ID No.4)，

CDH1：NCBI Acc.No.：NM_004360.3(SEQ ID No.5)，

ZEB1：NCBI Acc.No.：NM_001128128.2(SEQ ID No.6)，

PRRX1：NCBI Acc.No.：NM_006902.4(SEQ ID No.7)，

PLASTIN3：NCBI Acc.No.：NM_005032.6(SEQ ID No.8)。

简而言之，将1μl的cDNA(40ng)置于20μL反应体积中，其中包含12μl快速SyberGreen Master Mix、3μl管家基因和标的正向及反向引物(各5μM)和4μl DEPC水。

特定引物序列是：

18s-正向：CGC CGC TAG AGG TGA AAT TCT(SEQ ID No.9)，

18s-反向：CTT TCG CTC TGG TCC GTC TT(SEQ ID No.10)；

用来扩增18s的nt.1049-1100区域作为对照，Acc.No.：M10098.1，NCBI，(SEQ IDNo.11)；

TWIST1-正向：AGC AAG ATT CAG ACC CTC AAG CT(SEQ ID No.12)；

TWIST1-反向：CCT GGT AGA GGA AGT CGA TGT ACC T(SEQ ID No.13)；

用来扩增TWIST1的nt.781-835区域，Acc.No.：NM_000474.3，(SEQ ID No.1)；

SLUG-正向：TGT TTG CAA GAT CTG CGG C(SEQ ID No.14)；

SLUG-反向：TGC AGT GAG GGC AAG AAA AA(SEQ ID No.15)；

用来扩增SLUG的nt.730-830区域，Acc.No.：NM_003068.4，(SEQ ID No.2)；

ZEB2-正向：GCT ACA CGT TTG CCT ACC GC(SEQ ID No.16)；

ZEB2-反向：CGA TTA CCT GCT CCT TGG GTT(SEQ ID No.17)；

用来扩增ZEB2的nt.1262-1361区域，Acc.No.：NM_014795.3，(SEQ ID No.3)；

SNAIL-正向：CTT CCA GCA GCC CTA CGA C，(SEQ ID No.18)；

SNAIL-反向：CGG TGG GGT TGA GGA TCT(SEQ ID No.19)；

用来扩增SNAIL的nt.174-244区域，Acc.No.：NM_005985.3(SEQ ID No.4)。

CDH1-正向：GGAACTATGAAAAGTGGGCTTG(SEQ ID No.20)；

CDH1-反向：AAATTGCCAGGCTCAATGAC(SEQ ID No.21)；

用来扩增CDH1的nt.4113-4172区域，Acc.No.：NM_004360.3，(SEQ ID No.5)；

ZEB1-正向：GAAAGTGATCCAGCCAAATGG(SEQ ID No.22)；

ZEB1-反向：TGGGCGGTGTAGAATCAGAGT(SEQ ID No.23)；

用来扩增ZEB1的nt.2917-3020区域，Acc.No.：NM_001128128.2，(SEQ ID No.6)；

PRRX1-正向：ACACTATCCTGATGCTTT TGTG(SEQ ID No.24)；

PRRX1-反向：GAACTTGGCTCTTCGGTTC(SEQ ID No.25)；

用来扩增PRRX1的nt.395-494区域，Acc.No.：NM_006902.4(SEQ ID No.7)；

PLASTIN3-正向：CCTTCCGTAACTGGATGAACTC(SEQ ID No.26)；

PLASTIN3-反向：GGATGCTTCCCTAATTCAACAG(SEQ ID No.27)

用来扩增PLASTIN3的nt.1624-1837区域，Acc.No.：NM_005032.6，(SEQ ID No.8)。

扩增在ABI 7900HT实时PCR系统(应用生物系统公司)中进行，程序为：95℃10分钟、95℃15s循环40次、60℃60s。所有样品均一式三份地进行分析。靶基因和内标基因18s的定量使用SyberGreen的荧光发射来进行。DNA污染通过对每个样品的非反转录部分进行PCR来评估。对所有样品，检测同一反应中0-40次循环后对照和标志物基因的的荧光值，据此可推算每个产物的循环数阈值(CT)。CT值被认为是由双链PCR产物指数累积而得以检测到荧光性显著上升的PCR循环数。根据管家基因18s的表达对靶基因的表达进行标准化，以得到绝对定量(2^-ΔCT)，而相对定量通过比较对照和患者转录水平的2^-ΔΔCT方法算出(Livak Kj，Methods，2001；25(4):402-8)。

统计学分析

使用曼-惠特尼U检验对癌症患者和对照的循环EMT-TF mRNA表达水平的统计学上的显著差异进行评估。对于CRC和胰腺癌患者中水平显著较高的EMT-TF，使用通过ROC曲线分析而确定的最佳临界点来估算灵敏度和特异性。p值<0.05则被视为统计学上显著。所有的统计学分析使用StatDirect软件(StatsDirect有限公司，柴郡的奥特林厄姆，英国)进行。

对每个提出的诊断标志物进行了以下评估：

·特异性(也称为真阳性率)测定实际阳性被正确识别的比例。特异性涉及试验正确排除某种情形的能力。

·敏感度(也称为真阴性率)测定实际阴性被正确识别的比例。敏感性涉及试验正确识别某种情形的能力。

·诊断优势比是诊断试验有效性的量度。它被定义为如果对象具有疾病的情况下测试为阳性的几率与对象不具有疾病的情况下测试为阳性的几率之比。

·阳性和阴性预测值(分别为PPV和NPV)是统计中真阳性和真阴性结果与诊断试验中阳性和阴性结果的比例。

·假阳性率是假阳性比的预期，指的是在特定测试中错误地拒绝虚无假设的可能性

·假阴性率是在已知具有待测疾病或表现的对象中发生阴性检测结果的比例。

·假漏报率是已接受虚无假设的情形中不满足虚无假设的机率。

·假发现率是被拒绝的假设中错误的预期占比。

·阳性似然比(LR+)定义为如果测试为阳性则疾病的可能性会增加多少。

·阴性似然比(LR-)定义为如果测试为阴性则疾病的可能性会减少多少。

·精度是定义测试结果接近真实值程度的量度。

患者和方法

试验性研究包括69名CRC患者、以及24名胰腺癌患者，外加30名健康对照。所有样品经对象知情同意后如上所述进行处理。

结果

1.CRC患者的血细胞存在高水平TWIST1、SLUG和低水平ZEB1 mRNA

在健康对照(n＝30)中，在所有样品(100％)中检测到ZEB1、ZEB2、CDH1和SNAIL的编码mRNA。分别在26名(87％)和11名(36.7％)对照中检测到TWIST1和SLUG mRNA。在15个(50％)样品中检测到Plastin3 mRNA，并在4个(13％)样品中检测到PRRX1 mRNA。

在来自69名CRC患者的血液样品中，所有病例(100％)中检测到了TWIST1(菲希尔检验对比对照，p＝0.007)、ZEB2和SNAIL mRNA，并在66个病例(95.7％；菲希尔检验对比对照，p<0.001)中检测到了SLUG。在66个经检样品中，有65个(98.5％)可检测到CDH1。另外，在57个经检样品中，55(96.5％)个可检测到ZEB1表达，44(77.2％)个检测到Plastin3，并在3(5.3％)个检测到PRRX1。

如图1所示，CRC患者具有更高的TWIST1(图1A，绝对定量，中值，对照9.93E-9对比CRC 3.22 E-8；p<0.001)和SLUG(图1B，对照9.09E-13对比CRC 1.83E-08；p<0.001)mRNA循环水平。相反地，CRC患者的ZEB1水平低于对照(图1C，对照5.64E-7对比CRC 1.66E-07；p＝0.02)。ZEB2、SNAIL、CDH1、Plastin、PRRX1 mRNA的血液水平在病例和对照之间没有差异。因此，与对照相比，癌症患者的血细胞中的TWIST1水平高2.3倍，其SLUG水平高386倍，且其ZEB1水平低5.1倍(相对定量)。

识别CRC患者的血细胞中TWIST1和SLUG mRNA阈值。

作者接着通过ROC曲线确定了识别CRC患者的高水平转录产物的最佳临界点(图2)。通过这种方式，区分CRC患者与健康对照时，高水平的TWIST1(高于界限值，1.01E-8)具有94.2％的灵敏度和50％的特异性(表1和图2A)，同时高SLUG水平(高于界限值，7.93E-9)具有76.8％的灵敏度和90％的特异性(表2和图2B)。

表1.TWIST1 mRNA循环水平高于最佳界限值的结直肠癌诊断率、灵敏度和特异性。

PPV＝阳性预测值 FPR＝假阳性率

FDR＝假发现率 FNR＝假阴性率

FOR＝假漏报率 TNR＝真阴性率

NPV＝阴性预测值 LR+＝阳性似然比

ACC＝精度 LR-＝阴性似然比

TPR＝真阳性率 DOR＝诊断优势比

表2.SLUG mRNA循环水平高于最佳界限值的结直肠癌诊断率、灵敏度和特异性。

PPV＝阳性预测值 FPR＝假阳性率

FDR＝假发现率 FNR＝假阴性率

FOR＝假漏报率 TNR＝真阴性率

NPV＝阴性预测值 LR+＝阳性似然比

ACC＝精度 LR-＝阴性似然比

TPR＝真阳性率 DOR＝诊断优势比

将血细胞中的TWIST1和SLUG(具有或不具有CDH1)mRNA循环水平结合用于识别CRC患者。

我们利用TWIST1灵敏度结合SLUG特异性来将CRC患者区分于健康个体。用该方法，我们首先确定了TWIST1和SLUG mRNA均为高水平(即，高于界限值)的试样(CRC 49/69，71％；对照2/30，6.6％)(图3)。另一方面，TWIST1和SLUG mRNA均低(即，低于界限值)仅在对照中检测出(14/30，33.3％)。在其余样品(20个病例和14名对照)中，16个病例和13个对照显示出高-TWIST1-低-SLUG mRNA水平，4个病例和1个对照显示出低-TWIST1-高-SLUG mRNA水平。基于这34个样品绘出二级SLUG ROC曲线(界限值1.84E-10)。根据该二级界限值，17个CRC样品显示出高-SLUG水平、3个显示出低-SLUG水平，与此相比，7个对照显示出高-SLUG水平、7个对照显示出低-SLUG水平。最后，这一两个步骤的TWIST1-SLUG算法的总灵敏度和特异性分别是95.7％和70％。阳性和阴性预测值分别是88％和87.5％，诊断优势比是51.3(表3)。

或者，可基于高-TWIST1-低-SLUG和低-TWIST1-高-SLUG mRNA水平的34个样品绘出二级CDH1ROC曲线(界限值7.29E-8)。根据该二级CDH1界限值，14个CRC样品显示出低-CDH1水平、6个显示出高-CDH1水平，与此相比，4个对照显示出低-CDH1水平、10个对照显示出高-CDH1水平(图4)。因此，这另一个结合TWIST1和SLUG外加CDH1水平的算法得到了91.3％的总灵敏度和80％的特异性。阳性和阴性预测值分别是91％和80％，诊断优势比是42(表4)。通过将基本相似的灵敏度与提高的特异性相匹配，两个或两个以上的标志物的结合比之增强了单个标志物的诊断性能，由此可与假阴性率相关地尽可能减少假阳性率，从而提高诊断优势比和精度。

表3.根据诊断算法1，TWIST1和SLUG mRNA循环水平高于最佳界限值的结直肠癌诊断率、灵敏度和特异性。

PPV＝阳性预测值 FPR＝假阳性率

FDR＝假发现率 FNR＝假阴性率

FOR＝假漏报率 TNR＝真阴性率

NPV＝阴性预测值 LR+＝阳性似然比

ACC＝精度 LR-＝阴性似然比

TPR＝真阳性率 DOR＝诊断优势比

表4.根据诊断算法2，TWIST1和SLUG外加CDH1 mRNA循环水平高于最佳界限值的结直肠癌诊断率、灵敏度和特异性。

PPV＝阳性预测值 FPR＝假阳性率

FDR＝假发现率 FNR＝假阴性率

FOR＝假漏报率 TNR＝真阴性率

NPV＝阴性预测值 LR+＝阳性似然比

ACC＝精度 LR-＝阴性似然比

TPR＝真阳性率 DOR＝诊断优势比

血细胞中的ZEB1和CDH1 mRNA循环水平根据癌症的TNM诊断特征而不同。

至于局部浸润，ZEB1 mRNA水平在pT1-T2 N0M0(即，I期)CRCs患者中显著地低于pT3-T4 N0M0(即，II期)CRCs患者(中值，I期1.14E-7对比II期4.51E-7，总p＝0.001)(图5)。至于淋巴结转移，同样深度局部浸润的CRC患者(即pT3)，没有结节浸润(即，N0)的比检出结节浸润(N1-N2，中值，N0 6.72E-7对比N1-2 2.66E-7；p＝0.02)的具有更高的ZEB1 mRNA循环水平(图6)。至于远端转移，诊断出具有转移性疾病(M+)的患者与不具有转移病灶(M0)的患者相比显示出显著较低的CDH1 mRNA循环水平(中值，M+2.38E-8对比M0 5.88E-8，p＝0.02)(图7)。

血细胞中的TWIST1 mRNA循环水平区分随着时间发展到转移。诊断时尚不具有远端转移(I-III期)的CRC患者(n＝54)中，8个患者中的7个(87.5％)具有更高的TWIST1 mRNA循环水平(>3.07E-8)，他们之后都发展为术后转移进程。因此，TWIST1水平在CRC的患者中识别出了明显不同的无病存活情形(图8)。

2.胰腺癌(PC)患者的血细胞中存在高水平的TWIST1、SLUG和ZEB2mRNA。

血液中的EMT-TF mRNA水平在PC患者和健康个体中存在差异。如图9所示，与健康对照相比，24名PC患者具有较高的TWIST1(图9A，绝对定量，中值，对照9.935E-9对比PC3.41E-8；p<0.001)和SLUG(图9B，对照9.09E-13对比PC，1.30E-8；p<0.0001)以及ZEB2(图9C，对照1.69E-6对比PC 1.52E-5；p<0.01)水平。因此，PC患者的血液中TWIST1、SLUG和ZEB2mRNA循环水平平均分别比对照高14、788、和5倍(相对定量)。

识别PC患者的血液中SLUG mRNA阈值。通过ROC曲线分析，在将癌症患者区分于健康对照方面，高水平SLUG(高于界限值，3.27E-9)本身达到100％的灵敏度和70％特异性，达到75％阳性和100％阴性预测值，诊断优势比为130(图10和表5)。

血细胞中的TWIST1和SLUG和ZEB2 mRNA循环水平结合用于识别CRC患者。我们利用TWIST1结合SLUG来区分健康个体与PC患者。用该方法，我们首先确定了TWIST1(界限值，1.35E-8)和SLUG mRNA均为高水平的试样(PC 22/24，91.6％；对照6/30，20％)(图11)。另一方面，TWIST1和SLUG mRNA均低(即，低于界限值)仅在对照中检测出(14/30，33.3％)。在其余样品(2个病例和10个对照)中，8个对照显示出高-TWIST1-低-SLUG mRNA水平，2个病例和2个对照显示出低-TWIST1-高-SLUG mRNA水平。基于这12个样品绘出二级ZEB2 ROC曲线(界限值7.19E-8)。根据该第二级界限值，1个PC样品显示出高-ZEB2水平、1个显示出低-ZEB2水平，与此相比，7个对照显示出高-ZEB2水平、3个对照显示出低-ZEB2水平。最后，这一两个步骤的TWIST1-SLUG外加ZEB2算法的总灵敏度和特异性分别是95.8％和76.7％。阳性和阴性预测值分别是76.7％和95.8％，诊断优势比是75.57(表7)。

患者PC患者的血细胞中ZEB1、ZEB2和CDH1 mRNA水平高于CRC患者。另外，我们对PC和CRC患者的血液中EMT-基因水平进行比较发现，PC患者的ZEB1(PC 1.14E-6对比CRC1.66E-7，p＝0.002)、ZEB2(PC1.52 E-5对比CRC 6.62 E-6，p＝0.03)和CDH1(PC 1.36E-7对比CRC5.73E-8，p＝0.001)水平明显高于CRC患者。通过相对定量，PC患者的ZEB1的转录水平平均比CRC患者高7倍，而PC患者的ZEB2和CDH1均比CRC患者高2倍(图12)。

将胰腺癌与结直肠癌区分的血细胞中CDH1和ZEB2 mRNA水平阈值。将胰腺癌患者与结直肠癌患者区分的CDH1界限值是1.022E-7，对胰腺癌的特异性为75.4％(69个结直肠癌阳性中17个阳性)、灵敏度为58.3％(24个胰腺癌病人中检出14个)。接着，二级ZEB2界限值(4.08E-5)从17个结直肠癌且CDH1水平未检出的患者中区分出5个(ZEB2值<4.08E-5)，且从10个具有胰腺癌且CDH1水平未检出的患者中区分出2个(ZEB2值>4.08E-5)。总体上，将CDH1和ZEB2 mRNA水平结合，将患者胰腺癌与结直肠癌区分的特异性为82％，灵敏度为66.7％。

表5.SLUG mRNA循环水平高于最佳界限值的胰腺癌诊断率、灵敏度和特异性。

PPV＝阳性预测值 FPR＝假阳性率

FDR＝假发现率 FNR＝假阴性率

FOR＝假漏报率 TNR＝真阴性率

NPV＝阴性预测值 LR+＝阳性似然比

ACC＝精度 LR-＝阴性似然比

TPR＝真阳性率 DOR＝诊断优势比

表6.TWIST1 mRNA循环水平高于界限值的胰腺癌诊断率、灵敏度和特异性。

表7.SLUG、TWIST1和ZEB2 mRNA循环水平高于界限值的胰腺癌诊断率、灵敏度和特异性。

PPV＝阳性预测值 FPR＝假阳性率

FDR＝假发现率 FNR＝假阴性率

FOR＝假漏报率 TNR＝真阴性率

NPV＝阴性预测值 LR+＝阳性似然比

ACC＝精度 LR-＝阴性似然比

TPR＝真阳性率 DOR＝诊断优势比。