CN103866016B - 一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其应用。所述的循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，包含RosetteSep稀有细胞富集试剂、RNA抽提试剂、RNA逆转录试剂、荧光标记Taqman探针、特异性引物和qPCR反应体系试剂。本发明可用于肿瘤病人微创液体活检，实现肿瘤转移复发的早期诊断和预警，监控抗肿瘤治疗疗效及肿瘤进展情况，实现基于循环肿瘤细胞的分子分型及筛选特异性针对循环肿瘤细胞的敏感药物，以提升对肿瘤转移、复发及耐药相关机制的认识并指导肿瘤患者的个体化医疗，从而显著改善肿瘤患者的总体生存，具有重要的临床意义。

Description

一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其应用。

背景技术

近年来肝细胞癌的发病率和死亡率迅速上升，跃居恶性肿瘤第五位。虽然治疗技术有了很大的提高，但5年生存率没有明显改善，约50％的患者在术后5年发生肿瘤复发或远处转移。因此，预测肝癌患者术后复发以便早期进行必要的干预是进一步改善肝癌预后的关键。临床迫切需要一种有效、可靠的检测技术解决疾病早期诊断、高风险复发的筛查、抗肿瘤治疗的效果评价、预防并控制远处转移等HCC治疗中所面临的难题。

循环肿瘤细胞(CTC)是指有原发肿瘤或肿瘤转移灶释放入外周血的肿瘤细胞，在健康人体内极为罕见。根据文献报道，循环肿瘤细胞在恶性肿瘤形成早期即可释放入血。循环肿瘤细胞由原发灶释放进入血液循环，是恶性肿瘤复发和转移的关键步骤。因此，CTC检测被认为是一种新的诊断技术，一项新的预后评价工具、一项有效的恶性肿瘤治疗应答的预测指标，在临床应用中被寄予极高期望。CTC的检测有助于早期肿瘤患者的诊断、术后患者监测肿瘤的复发与转移、评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后以及选择个体化的治疗策略。

一般而言，CTC检测的方法大致可以分为细胞计数技术和基于核酸检测的技术两类，通常都包括富集和检测两个步骤。由于CTC在外周血中数量稀少，通过富集细胞来提高检测的敏感性很有必要。

CTC富集技术主要分为以形态学为基础的富集和以免疫学为基础的富集。前者，主要依靠细胞密度梯度进行分离，操作步骤较繁琐，分离效果不佳。后者是基于细胞表面抗原分子能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场的作用下，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸引而滞留在磁场中，而其它细胞因为不带磁性，不能在磁场中停留，从而使细胞得以分离。其中，较具代表性的方法是磁性活化细胞分选系统(magneticactivatedcellsortingsystem，MACS)，采用胞膜或胞内染色(后者需要透膜化及固定)，然后通过免疫磁性标记的微球来捕获CTC。MACS方法分离效果优于细胞密度梯度法，但操作仍较复杂。

常用的CTC检测技术有流式细胞术(flowcytometry，FCM)和逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptasepolymerasechainreaction，RT-PCR)。RT-PCR技术因其操作简单、可标记物选择多、特异性好等特点而应用较多。

目前商业化CTC富集和检测相结合的技术主要有CellSearch、Epithelialimmunospot(EPISPOT)、CTC-chip等。其中，CellSearch是目前美国食品和药品管理局(FoodandDrugAdministration，FDA)唯一批准的检测CTC的方法。但是，CellSearch检测价格昂贵、标本用量大(7.5ml)，选用EpCAM作为标志物筛选(阳选法)CTC会对细胞表面不表达EpCAM的CTC造成漏检，且存在CTC数量少时检测重复性差、结果判断主观性强等缺点。EPISPOT是一种基于酶联免疫吸附测定原理的免疫学分析方法，基于阳选法的富集原理和CellSearch存在类似的缺点。CTC-chip作为一种全新的芯片技术，具有灵敏度高、特异性好的优点，但需要特殊的检测设备，且检测成本很高，不适合高通量检测。因此，临床上迫切需要一种特异性高、灵敏度高；通量高；成本低、高效且操作简单的CTC富集和检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，利用阴性富集方法最大限度的去除外周血中白细胞来富集循环中的微量肿瘤细胞，而后通过微量核酸提取及合成技术提取富集肿瘤细胞的RNA并进行逆转录，最后通过高灵敏的实时荧光定量PCR技术完成肿瘤细胞的检测。

为了达到上述目的，本发明提供了一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，包含RosetteSep稀有细胞富集试剂、RNA抽提试剂、RNA逆转录试剂、荧光标记Taqman探针、特异性引物和qPCR反应体系试剂。

本发明提供了一种循环肿瘤细胞检测方法，其特征在于，具体步骤包括：

应用RosetteSep稀有细胞富集技术(RosetteSepappliedimagingrareevent，RARE)富集5ml外周血中循环肿瘤细胞；抽提总RNA并逆转录合成cDNA；采用荧光标记Taqman探针qRT-PCR技术检测循环肿瘤细胞表面至少一个干性细胞标志物。

所述的循环肿瘤细胞检测方法使用上述的循环肿瘤细胞检测试剂盒。

本发明的检测流程如图8所示，其中，CTC富集部分：采用RosetteSepHumanCD45DepletionCocktail(StemcellCanada)试剂。RARE是一种结合密度梯度分离和抗体介导分离两个步骤的富集技术。在阴性分选过程中，CD45阳性细胞与多种红细胞交联结合成双特异性四聚抗体复合物，使用密度梯度离心法去除这些复合物后，CD45阴性的细胞得以从分离液和血浆之间分离。本发明的操作步骤简单，分离效果基本满足CTC富集要求。本发明采用荧光标记Taqman探针qRT-PCR技术检测CTC具有高特异性、高灵敏度、良好的重复性等特点，且可以根据需要设计检测多种CTC表面标志物的探针，进行多基因标志物联合检测，满足临床对于不同疾病的诊治需求。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明采用RosetteSepCD45阴选法筛选和富集CTC，(1)和CellSearch利用EpCAM作为标志物(阳选法)筛选和富集CTC相比，本发明可以获得更多的CTC，且用血量少(CellSearch方法需采用7.5ml，RosetteSep采血量仅5ml)。由于CTC表面的肿瘤干性细胞标志物很多，且表达不均一、呈异质性，因此，仅利用单一标志物筛选CTC必然会造成不表达该标志物的CTC损失，富集效果不佳。试剂盒通过CD45阴选最大程度富集外周血中CTC，且避免了血液系统来源细胞的干扰。(2)和MACSHEACD45microbeads(MitenlyGermany)方法相比，在同样使用CD45阴选的基础上，RosetteSep在不同浓度梯度的细胞回收试验中，回收率均显著优于MACS方法。(3)和传统密度梯度分离法(Ficoll)相比，Ficoll仅利用密度梯度离心分离细胞，无法去除大量血液系统来源细胞，干扰CTC检测。

2、本发明采用荧光标记Taqman探针qRT-PCR技术，(1)与CellSearch检测技术相比：本发明可以提供多基因标志物联合检测，CellSearch仅检测2种CTC表面标志物(CK19和EpCAM)。多基因标志物联合检测可以满足临床上对不同疾病诊断、治疗和随访的需要。而且，本发明操作简单、对仪器设备要求不高、结果判读客观。(2)与流式细胞术计数法相比：本发明可以充分利用富集后的样本。CTC在外周血中含量很低，富集后的样本十分珍贵。流式细胞术受限于其检测原理，无法避免在检测初期稳定系统流速时对样本的损耗，会减低CTC的检出率，且检测周期较长、操作复杂。

3、本发明可用于肿瘤病人微创液体活检，实现肿瘤转移复发的早期诊断和预警，监控抗肿瘤治疗疗效及肿瘤进展情况，实现基于循环肿瘤细胞的分子分型及筛选特异性针对循环肿瘤细胞的敏感药物，以提升对肿瘤转移、复发及耐药相关机制的认识并指导肿瘤患者的个体化医疗，从而显著改善肿瘤患者的总体生存，具有重要的临床意义。

4、本发明采血量少、高效富集微量细胞、检测灵敏度高、特异性好、通量高、操作简单、成本较低。

附图说明

图1为RosetteSep、Ficoll和MACSmicrobeads方法富集CTC的效果比较图；

图2为RosetteSep和MACSmicrobeads方法回收试验比较图；

图3A为检测到1个掺入Hep3B细胞的β-actin和EpCAM基因的溶解曲线；

图3B为检测到10个掺入Hep3B细胞的β-actin和EpCAM基因的溶解曲线；

图3C为分别检测到1、5、10、50、100个掺入Hep3B细胞的β-actin和EpCAM基因的溶解曲线；

图3D为掺入Hep3B细胞不同数量级Hep3B细胞后，EpCAMmRNA相对表达量与实际掺入细胞数量的相关性。

图4为两种不同方法CTC检测能力比较图；

图5为不同组间CTCmRNA相对表达量比较图；

图6为不同组间CTC阳性率图；

图7为EpCAM诊断HCC效果评价图；

图8为循环肿瘤细胞检测检测流程示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，由以下试剂组成：

1.RosetteSep稀有细胞富集试剂：RosetteSepHumanCD45DepletionCocktail(Stemcell，Canada)，5*2ml，Cat.No.15162。

2.MiniKit(50)(Qiagen，Germany)，Cat.No.74104。

3.ReverseTranscriptionKit(Qiagen，Germany)，Cat.No.205313。

4.qPCRSuperMix-UDG(Invitrogen，USA)，Cat.No.C11730-025。

5.Taq-Man探针(自配，10μM)：

EpCAMprobe：FAM-ACGGCGACTTTTGCCGCAGCT-TAM；

β-actinprobe：FAM-ATCACTGCCCTGGCACCCAGCA-TAM。

6.特异性引物(自配，10μM)：

EpCAM-F：5-CTCGCGTTCGGGCTTCT-3；

EpCAM-R：5’-TGTAGTTTTCACAGACACATTCTTCCT-3’；

β-actin-F：5’-TGGCATTGCCGACAGGAT-3’；

β-actin-R：5’-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3’。

使用上述循环肿瘤细胞检测试剂盒检测循环肿瘤细胞，在健康人外周血(标本来自体检的健康人群)中掺入不同数量Hep3B细胞，评价所建方法的CTC富集效率，具体检测步骤如下：

1.1.Hep3B细胞株(购自中国科学院，肝细胞肝癌肿瘤细胞，99.2％的细胞表面表达EpCAM，本实施例中以Hep3B细胞作为掺入法的CTC细胞)按比例用不含RNA酶的水稀释至0～1个Hep3B/μl。取96孔微孔板，每孔中加入1μl上述稀释后Hep3B细胞悬液，显微镜下观察并计数。同理，分别获得10个Hep3B细胞/μl和100个Hep3B细胞/μl的细胞悬液。

1.2.将计数后细胞悬液掺入5ml外周血，分别制得0、10、100个Hep3B细胞/5ml外周血样本。

1.3.采用RosetteSep试剂盒(Stemcell，Canada)，利用RARE方法富集含0、10、100个Hep3B细胞/5ml外周血样本中的CTC。

同时，分别采用Ficoll(GE，USA)和MACSmicrobeads(Mitenly，Germany)富集含0、10、100个Hep3B细胞/5ml外周血中的CTC作为对比。

1.4.总RNA抽提和cDNA合成。使用RNeasyminiKit(Qiagen，Germany)将步骤1.3中富集得到的CTC抽提总RNA并使用ReverseTranscriptionKit进行逆转录合成cDNA。

1.5.使用荧光标记Taqman探针qRT-PCR技术技术，以EpCAM作为Hep3B细胞表面标志物，计算Hep3B细胞mRNA相对表达量。

仪器：LightCycler480系统(RocheDiagnostics，Germany)。

EpCAM-F：5-CTCGCGTTCGGGCTTCT-3；

EpCAM-R：5’-TGTAGTTTTCACAGACACATTCTTCCT-3’；

EpCAMprobe：6FAM-ACGGCGACTTTTGCCGCAGCT-TAM；

β-actin-F：5’-TGGCATTGCCGACAGGAT-3’；

β-actin-R：5’CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3’；

β-actinprobe：FAM-ATCACTGCCCTGGCACCCAGCA-TAM；

引物和探针由LifeTechnologycorporation(Invitrogen，USA)合成。

PCR反应条件：5℃变性2min；进入循环，95℃变性3s，60℃退火延伸30s，共45个循环。

PCR反应体系(总体积20μl)：包括qPCRSuperMix-UDG12μl；10μM荧光探针1μl；10μM前向引物1μl；10μM反向引物1μl；cDNA模板5μl。

1.6.按下式计算Hep3B细胞mRNA相对表达量：

计算公式：2^-ΔCT[ΔCT＝Ct(target)-Ct(β-actin)].(Ct：扩增循环数；ΔCT：扩增循环数差值；target：目的基因；β-actin内参基因)

评估富集效率和背景干扰，结果如图1所示，健康人外周血(掺入0个Hep3B细胞/5ml外周血样本)：MACSmicrobeads和RosetteSep方法阴选后均未检测到CTC，证明健康人外周血没有CTC。Ficoll方法在无CD45阴选的条件下，存在背景表达影响后续CTC检测结果，造成假阳性。本实验证明CD45阴选法富集CTC可以有效避免背景表达的干扰。健康人外周血(掺入10个Hep3B细胞/5ml外周血样本)：RosetteSep、MACSmicrobeads和Ficoll方法均富集到CTC；健康人外周血(掺入100个Hep3B细胞/5ml外周血样本)：RosetteSep、MACSmicrobeads和Ficoll方法均富集到CTC，且RosetteSep富集效果显著优于MACSmicrobeads和Ficoll方法。本实验证明RosetteSep是一种高效的CTC富集技术。

实施例2

一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，组成与实施例1相同。

使用上述循环肿瘤细胞检测试剂盒检测循环肿瘤细胞，血液样本来自体检的健康人群的外周血，具体步骤如下：

1、采用实施例1步骤1.1.-1.2的方法制备得10、10²、10³、10⁴Hep3B细胞/5ml外周血样本。按试剂盒的说明分别采用RosetteSep(Stemcell，Canada)和MACSmicrobeads(Mitenly，Germany)富集含10、10²、10³、10⁴Hep3B细胞/5ml外周血样本中的CTC。

2、采用实施例1步骤1.4中的方法将步骤1中富集得到的CTC抽提总RNA并逆转录合成cDNA。

3、采用实施例1步骤1.5中的方法使用荧光标记Taqman探针技术，以EpCAM作为Hep3B细胞表面标志物，按照实施例1中步骤1.6计算Hep3B细胞mRNA相对表达量。

比较RosetteSep和MACSmicrobeads方法富集CTC的回收效率，结果如图2所示，在健康人外周血中分别掺入10、10²、10³、10⁴荧光标记CTC(Hep3B)细胞/5ml，比较RosetteSep和MACSmicrobeads方法富集CTC的回收效率。当掺入10CTC/5ml时，MACSmicrobeads的回收率几乎为零，显著低于RosetteSep(58.33％，P＜0.05)。当分别掺入10²、10³、10⁴CTC/5ml，MACSmicrobeads和RosetteSep回收率分别为24.82vs68.84，51.67vs71.90，66.95vs81.92；P＜0.05。因此，RosetteSep相比MACSmicrobeads是一种更为合适的CTC富集方法，对不同数量级的CTC均有良好的回收率。

实施例3

一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，组成与实施例1相同。

取体检的健康人的外周血，进行批内不精密度评估：采用实施例1步骤1.1.-1.2.制备得1、10个Hep3B细胞/5ml健康人外周血标本，使用本发明的循环肿瘤细胞检测试剂盒进行5次重复操作(方法同实施例1步骤1.3.-1.6.)以评估检测系统的批内不精密度(图3A、3B)。

如图3A和图3B所示，以β-actin作为内参标记物，EpCAM作为CTC表面标志物，荧光标记Taqman探针qRT-PCR为检测技术验证新平台检测CTC的精密度。结果显示，本发明建立的方法检测CTC结果准确、重复性好，可以满足低浓度CTC标本的检测要求。

取体检的健康人的外周血，进行批间不精密度评估：每天同一时间根据步骤1.1.-1.2.制备得1、10Hep3B细胞/5ml健康人外周血标本，使用本发明的循环肿瘤细胞检测试剂盒进行检测，重复检测5天(方法同步骤1.3.-1.6.)评估批间不精密度，结果如表1所示。

表1.RosetteSep阴选、荧光标记Taqman探针qRT-PCR技术检测平台性能评价

P1代表1Hep3B细胞/5ml健康人外周血标本，P2代表10Hep3B细胞/5ml健康人外周血标本。

取体检的健康人的外周血，进行线性评估：根据实施例1步骤1.1.-1.2.制备得1、5、10、50、100个Hep3B细胞/5ml健康人外周血标本，使用本发明的循环肿瘤细胞检测试剂盒进行检测(方法同实施例1步骤1.3.-1.6.)，评价检测系统线性，结果如图3C和图3D所示。

如图3C所示，以β-actin作为内参标记物，EpCAM作为CTC表面标志物，验证荧光标记Taqman探针qRT-PCR为检测技术验证新平台检测1、5、10、50、100个Hep3B细胞/5ml健康人外周血标本的准确性，并评估线性能力。结果显示，本发明建立的方法检测CTC结果准确，可以满足不同浓度CTC标本的检测要求。如图3D所示，线性分析结果表明本发明建立的方法检测0～100CTC和CTC相对表达量之间相关性良好(R²＝0.9966)。

实施例4

一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，组成与实施例1相同。

选择17例肝细胞癌患者及71例健康志愿者的外周血，分别采集两管血，一管5ml(使用上述的循环肿瘤细胞检测试剂盒及实施例1中步骤1.1-1.5进行检测，其中，步骤1.3中仅采用RosetteSep而不采用Ficoll和MACS进行富集)，一管7.5ml(使用Cellsearch检测系统进行检测)，分别计算17位肝细胞肝癌患者及71例健康人外周血中EpCAM^mRNA+的CTC含量(双盲实验)，使用2^-ΔΔCt计算法，以健康组的平均ΔCt[ΔCt＝Ct(target)-Ct(β-actin)](Ct：扩增循环数；ΔCT：扩增循环数差值；target：目的基因；β-actin内参基因)作为校准值，ΔΔCt＝[Ct(target样本)-Ct(β-actin样本)-ΔCt_{健康组均值}](Ct：扩增循环数；ΔCT：扩增循环数差值；target：目的基因；β-actin内参基因)，以2.0作为判读结果的cutoff值。如图4所示，本发明的循环肿瘤细胞检测试剂盒和CellSearch系统之间，在EpCAM^mRNA+CTC检测能力上一致性良好。

实施例5

一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，组成与实施例1相同。

使用上述的循环肿瘤细胞检测试剂盒以EpCAM为CTC表面标志物检测87例肝细胞肝癌(肝细胞肝癌组)、25例乙肝和/或肝硬化(肝炎/肝硬化组)、24例良性肝脏肿瘤(16例肝血管瘤和8例腺瘤)(良性肝脏肿瘤组)和71例健康人(健康对照组)的外周血样本中EpCAMmRNA相对表达量，上述样本分别来自复旦大学附属中山医院肝细胞肝癌患者、肝炎/肝硬化患者、良性肝脏肿瘤患者和体检为正常的健康人中，检测步骤为：(1)按照实施例1中步骤1.1-1.5方法进行检测，其中，步骤1.3中仅采用RosetteSep而不采用Ficoll和MACS进行富集；(2)按下式计算各样本中EpCAM的mRNA相对表达量：公式ΔCt＝Ct(target)-Ct(β-actin)(Ct：扩增循环数；ΔCT：扩增循环数差值；Target：目的基因；β-actin内参基因，以2.0作为判读结果的cutoff值)，比较CTC阳性率(图5-6)。

如图5所示，根据设定的cutoff值，健康对照组和肝炎/肝硬化组中未发现CTC，良性肝脏肿瘤中CTC表达量很低，HCC组中CTC高表达。

如图6所示，根据cutoff值的设定，不同组间EpCAM阳性细胞(CTC)所占比例：健康对照组、肝炎/肝硬化组、良性肝脏肿瘤和肝细胞肝癌组分别为0.00％，8％，8.30％和42.52％。在健康对照组中未发现CTC。

实施例6

一种循环肿瘤细胞检测试剂盒：

1.外周血循环肿瘤细胞富集试剂：RosetteSepHumanCD45DepletionCocktail(Stemcell，Canada)，5*2ml，Cat.No.15162；

2.MiniKit(50)(Qiagen，Germany)，Cat.No.74104；

3.ReverseTranscriptionKit(Qiagen，Germany)，Cat.No.205313；

4.qPCRSuperMix-UDG(Invitrogen，USA)，Cat.No.C11730-025；

5.Taq-Man探针(自配，10μM)：

EpCAMprobe：FAM-ACGGCGACTTTTGCCGCAGCT-TAM；

β-actinprobe：FAM-ATCACTGCCCTGGCACCCAGCA-TAM；

6.特异性引物(自配，10μM)：

EpCAM-F：5’-CTCGCGTTCGGGCTTCT-3；

EpCAM-R：5’-TGTAGTTTTCACAGACACATTCTTCCT-3’；

β-actin-F：5’-TGGCATTGCCGACAGGAT-3’

β-actin-R：5’CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3’；

在实施例5的各样本中增加AFP检测，分别以单独使用CTC、单独使用AFP和联合使用CTC/AFP绘制诊断HCC的ROC曲线，使用SPSS13.0软件，绘制各参数的ROC曲线并计算曲线下面积。

统计结果显示，联合使用AFP和CTC两项指标可以显著提高HCC早期诊断的灵敏度和特异性(图7和表2)。

如图7所示，联合使用AFP和EpCAM，诊断HCC的ROC曲线下面积显著增加，灵敏度和特异性分别为72.4％和96.7％。

表2.EpCAM诊断HCC效果评价

Claims (2)

1.一种肝癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，包含RosetteSep稀有细胞富集试剂、RNA抽提试剂、RNA逆转录试剂、针对肝癌循环肿瘤细胞表面至少一个干性细胞标志物的荧光标记Taqman探针及其特异性引物和qPCR反应体系试剂，其中所述至少一个干性细胞标志物是EpCAM，其特异性引物序列为：

EpCAM-F：5’-CTCGCGTTCGGGCTTCT-3’；

EpCAM-R：5’-TGTAGTTTTCACAGACACATTCTTCCT-3’；

其Taq-Man探针序列为：

EpCAMprobe：FAM-ACGGCGACTTTTGCCGCAGCT-TAM；

所述试剂盒的PCR反应条件为：5℃变性2min；进入循环，95℃变性3s，60℃退火延伸30s，共45个循环；

PCR反应体系总体积20μL：包括qPCRSuperMix-UDG12μL；10μM荧光探针1μL；10μM前向引物1μL；10μM反向引物1μL；cDNA模板5μL。

2.针对肝癌循环肿瘤细胞表面至少一个干性细胞标志物的荧光标记Taqman探针及其特异性引物在制备用于肝癌循环肿瘤细胞检测方法的试剂盒中的用途，其特征在于，所述检测方法的具体步骤包括：应用RosetteSep稀有细胞富集技术富集5ml外周血中循环肿瘤细胞；抽提总RNA并逆转录合成cDNA；采用荧光标记Taqman探针qRT-PCR技术检测循环肿瘤细胞表面至少一个干性细胞标志物；其中所述至少一个干性细胞标志物是EpCAM，其特异性引物序列为：

EpCAM-F：5’-CTCGCGTTCGGGCTTCT-3’；

EpCAM-R：5’-TGTAGTTTTCACAGACACATTCTTCCT-3’；

其Taq-Man探针序列为：

EpCAMprobe：FAM-ACGGCGACTTTTGCCGCAGCT-TAM；

所述试剂盒的PCR反应条件为：5℃变性2min；进入循环，95℃变性3s，60℃退火延伸30s，共45个循环；

PCR反应体系总体积20μL：包括qPCRSuperMix-UDG12μL；10μM荧光探针1μL；10μM前向引物1μL；10μM反向引物1μL；cDNA模板5μL。