CN112662774A - 一种肝癌循环肿瘤细胞标志物及其应用 - Google Patents

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CN112662774A CN202110037340.1A CN202110037340A CN112662774A CN 112662774 A CN112662774 A CN 112662774A CN 202110037340 A CN202110037340 A CN 202110037340A CN 112662774 A CN112662774 A CN 112662774A
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何叶
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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种肝癌循环肿瘤细胞标志物及其应用，本发明从肿瘤脂代谢活性异常的角度对循环肿瘤细胞(CTCs)进行功能鉴定，由于脂代谢相关信号通路分子在癌症进展中表达相对稳定，可以避免肝癌循环肿瘤细胞的漏检，从而提高监测的精确性，能更好的反映CTCs的生物学行为。同时，本发明的引物和探针(逆转录引物、锁式探针)可用于肝癌细胞APOB和/或ALB的mRNA检测，具有设计简单，原位杂交中检测信号强，无干扰等特点，原位锁式探针杂交实验表明，本发明的引物和探针可用于临床肝癌患者血液样本的CTCs鉴定，具有高特异性和高敏感性的特点，而且不局限于血液样本的使用。

Description

一种肝癌循环肿瘤细胞标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种肝癌循环肿瘤细胞标志物及其应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulatingtumor cells，CTCs)是从原位实体瘤或转移瘤部位自发或者因临床诊疗操作而脱落并释放到血液循环的稀有细胞。近年来，作为一种有望替代传统组织活检的“液体活检”技术的标志物之一，CTCs的计数已被报道和转移性乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌和肝癌等癌症的转移、复发、无进展生存期、总生存期等预后显著相关。“液体活检”最大的优势在于可连续取样、微创、方便、便捷，并能克服传统组织活检难以连续取样、转移灶取样困难和出血风险等技术困境，因此，具有广阔的临床应用前景。然而，血液中存在大量的血细胞，大概109个红细胞或106个白细胞中仅存在一个CTC，导致血细胞成为CTCs检测的主要干扰。因此，准确鉴定CTCs是计数和下游分析的主要技术瓶颈。鉴于大部分实体瘤细胞均来源于上皮，目前临床上用于表征CTCs的技术平台主要依赖于上皮细胞来源的标志物[如上皮细胞黏附分子(Epithelial celladhesion molecules,EpCAM)，细胞角蛋白(CKs)]的检测以实现对CTCs的分离和鉴定。然而，大量研究表明，上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤细胞转移级联起始步骤中扮演着重要的角色，该过程导致细胞的极性消失，形态改变，侵袭能力增强，同时，细胞上皮标志物表达下调甚至消失。已有研究表明，CTCs是肿瘤复发和转移的重要驱动因素之一，显然，EMT这一动态变化的生物进程使得CTCs标志物具有不确定性，单独依赖上皮标志物来鉴定CTCs可能会导致大部分间质型CTCs漏检，而这些间质型标志物可能具有重要的临床意义。例如，有研究表明，间质表型CTCs侵袭性较上皮表型CTCs强，并且和临床化疗耐药相关。因此，有必要开发一种在癌症进展中表达相对稳定，在白细胞和CTCs中表达差异明显的CTCs新型生物标志物。
代谢重编程是肿瘤的十大特征之一，继糖代谢和谷胺酰胺代谢异常之后，近年来，脂代谢异常和肿瘤的发生、发展、侵袭、转移表型的关联也被逐渐揭示。高脂代谢可以给细胞增殖活动提供能量，生物膜合成的原材料和脂质信号分子。研究发现，肝细胞癌的脂代谢重编程主要表现为脂质从头合成、脂质摄取、胆固醇合成和脂肪酸β氧化活动显著增加等。脂代谢相关的酶和转录调节因子在癌细胞中过表达，已经作为癌症药物治疗的有效靶标被广泛应用。而高转移潜能细胞由于其恶性表型特征，对脂质有更高的需求。因此，脂代谢异常分子可能是具有功能活性CTCs的一个有用的生物标志物。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种肝癌循环肿瘤细胞标志物，所述标志物为脂代谢相关信号通路分子，可为肝癌循环肿瘤细胞的鉴定或预后预测提供新的方法，能更好的反映CTCs的生物学行为。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种肝癌循环肿瘤细胞标志物，所述标志物为脂代谢相关信号通路分子。
优选地，所述脂代谢相关信号通路分子为APOB和/或ALB。
本发明提供一种新型的肝癌循环肿瘤细胞标志物，以脂代谢相关信号通路分子(APOB和/或ALB)作为肝癌循环肿瘤细胞标志物，从肿瘤脂代谢活性异常的角度对循环肿瘤细胞(CTCs)进行功能鉴定，能更好的反映CTCs的生物学行为，而且脂代谢相关信号通路分子(APOB和/或ALB)在癌症进展中表达相对稳定，可以避免肝癌循环肿瘤细胞的漏检，提高监测的精确性。
需要说明的是，从原理上而言，本发明的脂代谢相关信号通路分子除了可以作为肝癌循环肿瘤细胞的标志物外，还可以作为其他癌症的循环肿瘤细胞的标志物。所述脂代谢相关信号通路分子优选APOB和/或ALB。
本发明还提供了上述的肝癌循环肿瘤细胞标志物在制备肝癌循环肿瘤细胞鉴定和/或预后预测产品中的应用。
优选地，在制备肝癌循环肿瘤细胞鉴定产品时，所述肝癌循环肿瘤细胞标志物为APOB和/或ALB。
优选地，在制备肝癌循环肿瘤细胞预后预测产品时，所述肝癌循环肿瘤细胞标志物为APOB。
本发明还提供了一种肝癌循环肿瘤细胞鉴定和/或预后预测产品，所述产品以脂代谢相关信号通路分子为检测指标。
本发明还提供了一种肝癌循环肿瘤细胞鉴定和/或预后预测产品，所述产品包括用于检测肝癌循环肿瘤细胞中的脂代谢相关信号通路分子的引物。
优选地，所述脂代谢相关信号通路分子为APOB和/或ALB。
优选地，所述产品采用原位锁式滚环扩增技术，所述引物包括逆转录引物、锁式探针和检测探针。
进一步地，所述逆转录引物包括如SEQ ID NO:1-3所示的核苷酸序列和/或如SEQID NO:4-9所示的核苷酸序列，所述锁式探针包括如SEQ ID NO:14-16所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO:17-22所示的核苷酸序列，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:27-29所示。
更进一步地，所述引物还包括检测CD45(白细胞标志物)的逆转录引物和锁式探针，所述逆转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10-13，所述锁式探针的核苷酸序列如SEQID NO:23-26。
本发明还提供了一种以脂代谢相关信号通路分子为检测指标的肝癌循环肿瘤细胞鉴定和/或预后预测方法，包括以下步骤(如图1所示)：
A.从患者外周静脉采血5-10毫升于抗凝采血管中(无需有创的病理活检)；
B.将采集的血液样本通过离心法去除血浆，加入RosetteSepTM试剂室温下混匀30分钟；
C.通过密度梯度离心法富集外周血CTCs，制成细胞甩片后，利用原位滚换扩增技术将用于鉴定CTCs的脂代谢相关信号通路分子靶基因扩增，使待检信号得以放大；
D.利用共聚焦显微镜扫描样本区域，获得病人的CTCs信息：癌患者外周血CTCs的APOB和/或ALB呈阳性，细胞核Hoechst染色呈阳性，CD45表达则呈阴性。
优选地，上述检测方法中，所述脂代谢相关信号通路分子为APOB和/或ALB。
本发明利用原位锁式滚环扩增技术，对肝细胞癌患者外周血CTCs的脂代谢标志物进行检测，从而实现CTCs的鉴定或预后预测。肝细胞癌标本实验的验证结果表明，该方法可以实现对CTC表达的标志物在RNA水平的定性和定量分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供一种肝癌循环肿瘤细胞标志物，所述标志物为脂代谢相关信号通路分子，从肿瘤脂代谢活性异常的角度对循环肿瘤细胞(CTCs)进行功能鉴定，由于脂代谢相关信号通路分子在癌症进展中表达相对稳定，可以避免肝癌循环肿瘤细胞的漏检，从而提高监测的精确性，能更好的反映CTCs的生物学行为。同时，本发明的引物和探针(逆转录引物、锁式探针)可用于肝癌细胞APOB和/或ALB的mRNA检测，具有设计简单，原位杂交中检测信号强，无干扰等特点，原位锁式探针杂交实验表明，本发明的引物和探针可用于临床肝癌患者血液样本的CTCs鉴定，具有高特异性和高敏感性的特点，而且不局限于血液样本的使用。
附图说明
图1为本发明利用脂代谢标志物检测外周血CTCs的工作流程图；
图2为以健康外周血白细胞做对照组，利用脂代谢通路相关基因阵列在7株肝癌细胞系中检测到的差异表达基因；
图2中，A为FA通路芯片结果的聚类分析；B为LP通路芯片结果的聚类分析；C为以MHCC-97H细胞为例，差异表达基因的火山图(差异倍数＞2且P＜0.05)；C中两条竖线和一条横线划分的区域分别表示：区域1为p值有意义低表达基因；区域2/5为基因表达无差异；区域3为p值有意义高表达基因；区域4/6为p无有意义差异化表达基因；其中，区域3中的基因为表达上调基因群。
图3为7株肝癌细胞表达上调基因的韦恩图；
图3中，A为FA通路中7株肝癌细胞显著上调基因的集合；B为LP通路中7株肝癌细胞显著上调基因的集合。
图4为THPA数据库显示APOB和ALB基因在肝组织和外周血白细胞中的差异表达量；
图4中，A为GTEx数据库中的RNA测序数据；B的测序数据来源于Monaco等发表的文献(Monaco G,Lee B,Xu W,Mustafah S et al.RNA-Seq Signatures Normalized by mRNAAbundance Allow Absolute Deconvolution of Human Immune Cell Types.Cell Rep2019Feb5；26(6):1627-1640.e7.PMID:30726743)；pTPM即每百万转录本，***代表p<0.001。
图5为正常肝脏组织和肝癌组织中APOB在mRNA水平的差异比较；
图5中，A为使用Oncomine数据库中的Roessier liver2数据集；B为TCGA的RNA测序数据，数据转换为log2；*代表p<0.05,***代表P<0.001。
图6为APOB基因表达水平和肝癌患者的总生存期以及无复发生存期的关系；
图7为Hep3B细胞经过CFSE预标记后与APOB基因共定位的荧光图像；
图7中，a为细胞核染色图像；b为使用绿色荧光染料CFSE染色并标记细胞的图像，用以锁定加入到血液样本中的肿瘤细胞；c为用于标记肿瘤细胞的APOB探针的荧光信号；d为上述a、b、c三个荧光通道信号合并的示意图。
图8为APOB联合ALB标志物鉴定4种肝癌细胞系的荧光图像(所用肝癌细胞分别为SK-Hep1、MHCC97-LM3、MHCC97-L、MHCC97-H，各幅图的标尺均为10微米)；
图9为APOB,ALB联合CD45标志物鉴定肿瘤细胞和白细胞的荧光图像(所用肿瘤细胞为Hep3B)；
图9中，a为肿瘤细胞Hep3B的细胞核染色图像；b为靶向白细胞标志物CD45探针在Hep3B细胞呈阴性表达；c显示了用于标记肿瘤细胞的APOB探针的荧光信号；d显示了用于标记肿瘤细胞的ALB探针的荧光信号；e为上述a、b、c、d四个荧光通道信号合并的示意图；f为健康人外周血分离出的白细胞的细胞核染色图像；g为靶向白细胞标志物CD45探针呈阳性表达；h显示了用于标记肿瘤细胞的APOB探针在白细胞中呈现阴性表达；i显示了用于标记肿瘤细胞的ALB探针在白细胞中呈现阴性表达；j为上述f、g、h、i四个荧光通道信号合并的示意图。
图10为Hep3B细胞掺入血液之后，APOB，ALB联合CD45标志物鉴定肿瘤细胞和白细胞的荧光图像(长箭头所指为白细胞，白色三角形所指为Hep3B肿瘤细胞)；
图11为肝癌患者外周血样本中检测到的几例代表性CTC(表达谱为DAPI+APOB+ALB+CD45-)及外周血白细胞(表达谱为DAPI+APOB-ALB-CD45+)的荧光图(灰色阴影为细胞核染色；方框内区域点状信号为CD45探针荧光；圆形区域内点状信号为ALB探针荧光信号[箭头所指点状信号除外]；圆形区域内箭头所指点状信号为APOB探针荧光信号；白色粗横线为标尺长度，代表10微米)。
图12为代表性APOB和ALB双阳性CTC细胞群的荧光图(灰色阴影为细胞核染色；圆形区域内点状信号为ALB探针荧光信号[箭头所指点状信号除外]；圆形区域内箭头所指点状信号为APOB探针荧光信号；标尺长度代表10微米)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1肿瘤细胞和血细胞差异表达脂代谢标志物的筛选与验证
1.材料和方法
(1)细胞株
7株肝细胞癌细胞系：MHCC97-L、MHCC97-H、Hep3B2.1-7和MHCC97-LM3购于复旦大学中山医院肝癌研究所，SNU-182购于中国科学院细胞库，HepG2、SK-Hep1分别由付卫民教授、黄宁研究生慷慨赠送(南方医科大学)；
(2)培养基及胎牛血清
胎牛血清、DMEM、RPMI-1640购于广州捷威斯科技有限公司(Gibco生产)，EMEM(含有NEAA)培养基购于广州佰路生物科技有限公司(ATCC生产)。DMEM用于培养MHCC97-L、MHCC97-H、MHCC97-LM3和SNU-182细胞，培养时添加10％胎牛血清；RPMI-1640用于培养HepG2及SK-Hep1细胞；EMEM用于培养Hep3B2.1-7，培养时添加15％胎牛血清。
(3)基因芯片分析
用于检测肝细胞癌细胞MHCC97-L、MHCC97-H、Hep 3B2.1-7(后面简称Hep3B)、MHCC97-LM3、SNU-182、HepG2、SK-Hep1和健康人白细胞脂代谢基因谱以筛选差异表达基因。脂代谢功能芯片类型为：1)RT2 ProfilerTMPCR Array Human Fatty Acid Metabolism(FA通路芯片，PAHS-007ZA)，包含的检测基因主要涉及脂肪酸代谢、脂肪酸转运、脂肪酸生物调节合成、酮生成和酮体代谢、甘油三酯代谢等脂肪酸代谢过程及其主要调节基因；2)RT2ProfilerTMPCR Array Human Lipoprotein Signaling&Cholesterol Metabolism(LP通路芯片，PAHS-080ZA)，包含的检测基因主要涉及低密度脂蛋白受体及其相关蛋白、低密度脂蛋白相关蛋白、高密度脂蛋白相关蛋白、胆固醇转运、胆固醇代谢等脂蛋白和胆固醇代谢过程及其主要调节基因，购于广州昂科生物有限公司(Qiagen生产)。
(4)检测样本
7种肝癌细胞株各3份(确保样本重复，共21份样本)和健康人外周血2mL，共计30例(分离外周血白细胞后，随机将30份白细胞标本分为3组，每组为10例外周血白细胞的集合，确保阴性对照组基因表达无偏差)，用RNeasy Mini Kit(Qiagen生产)试剂盒提取纯化细胞总RNA,随后，利用Dnase I消化样品以去除可能残留的基因组DNA。用RT2 First StrandKit(Qiagen生产)按照说明书操作将提取纯化后的RNA样品逆转录为cDNA，再用脂代谢功能芯片进行检测，按照标准说明书操作。
2.结果
(1)基因芯片筛选脂代谢差异基因
肝癌细胞株和健康对照组白细胞样本经RNeasy Mini Kit试剂盒(Qiagen)提取并纯化RNA和浓度测定后，利用RT2 First StrandKit逆转录合成cDNA链，然后采用上述2种基因芯片(FA通路芯片，PAHS-007ZA和LP通路芯片，PAHS-080ZA)进行基因表达水平检测。
结果如图2A和2B所示。P值小于0.05并且logFC大于2(4倍差异)为显著上调差异表达基因。以此方法作标准筛选，以健康志愿者外周血白细胞集合样本为对照分析组，肝细胞癌细胞株MHCC97-L、MHCC97-H、Hep3B、MHCC97-LM3、SNU-182、HepG2、SK-Hep1中FA通路差异表达的基因分别为43、41、50、46、46、50、52个，LP通路差异表达的基因分别为52、43、58、52、53、55、53个，图2C为Hep 3B细胞在脂代谢基因芯片筛选结果的火山图，图2D为Hep 3B细胞在脂蛋白信号传导和胆固醇代谢组合基因芯片筛选结果的火山图。肝癌细胞上调表达基因集合重叠情况的韦恩图如图3所示，该图分别显示7株肝癌细胞在FA(图3A)、LP(图3B)中显著上调的基因集合的重叠情况，其中FA芯片中细胞均上调的基因共10种，LP芯片中细胞均上调的基因共14种,详细信息如表1所示。
表1基因芯片筛选的脂代谢差异表达基因信息
FA通路基因名称 功能分类 LP通路基因名称 功能分类
DECR2 脂肪酸代谢 LRP6 低密度脂蛋白受体
PRKAA2 脂肪酸合成调节 NR1H4 胆固醇代谢
EHHADH 酰基辅酶A脱氢 NPC1L1 胆固醇转运
ACAT1 乙酰辅酶A转运酶 MVK 胆固醇生物合成
FABP5 脂肪酸转运 APOB 胆固醇转运
SLC27A4 脂肪酸转运 HMGCS2 胆固醇生物合成
ECHS1 脂肪酸代谢 DHCR24 胆固醇生物合成
HMGCS2 酮体生成和代谢 FDPS 胆固醇生物合成
ALDH2 脂肪酸代谢 FDFT1 胆固醇生物合成
ACOT7 脂酰辅酶A硫酯酶 DHCR7 胆固醇生物合成
ACSL3 乙酰辅酶A合成
ACOX2 乙酰辅酶A氧化
GPD1 甘油三酯代谢
FASN 脂肪酸生物合成调节
(2)人类蛋白组图谱(The Human Protein Atlas,THPA)数据库验证候选基因的特异性
通过以上芯片分析，筛选出23个高表达的候选基因(如表1所示；两个通路芯片中，HMGCS2基因在两个通路芯片中都有检测且在实验组细胞中均表达上调)。为了在这23个基因中筛选出最合适的标志物，利用THPA数据库在组织中鉴定这些基因的特异性。THPA数据库整合了采用各种组学技术(包括基于抗体的成像，基于质谱的蛋白质组学，转录组学和系统生物学)在细胞，组织和器官层面绘制所有人类蛋白质的生物学图谱。该数据库包含6个部分，涵盖了组织图谱，细胞图谱，病理图谱，血液图谱，脑图谱和代谢图谱。其中，获取的RNA-seq数据来源于GTEx(Genotype-Tissue Expression，基因型-组织表达)数据库(是THPA数据来源之一)。基于此研究临床样本类型，选择数据库中纳入的肝脏组织样本175例，PBMC(Peripheral blood monoculear cell，外周血单核细胞)样本13例，结果显示，APOB基因mRMA表达量的中位数(分布范围)在肝脏组织为219.4(32.3-493.1)TPM(全称为Transcripts Per Million，为衡量基因表达量的指标之一，计算方法为先对每个基因的read数用基因的长度进行校正，之后再用校正的基因read数[nr/Lr]与校正后的该样本的所有校正后的read数求商)，在PBMC为0TPM(p<0.001,图4A)。而其它特异性较低(数据未显示)。另外，还分析了ALB的表达量，结果显示，肝脏组织表达量为25818.4(1935.2-57204.3)TPM，显著高于PBMC的0TPM(p<0.001,图4B)。以上结果表明APOB和ALB基因在肝组织中高表达，而不存在于血液的PBMC中,具有细胞分布特异性。
(3)APOB的预后价值评估
为了筛选出具有潜在临床意义的标志物，在Oncomine数据库(https://www.oncomine.org/resource/login.html)，TCGA(The cancer genome atlas，癌症基因组图谱)数据库和Kaplan-Meier plotter数据库(肿瘤基因预后预测数据库，http://kmplot.com/analysis/)中进一步验证APOB基因和肝癌(HCC)的关联性。首先，使用Oncomine数据库分析APOB在肝癌组织中的mRNA水平(http://www.oncom ine.org)。该微整列数据库包含715个数据集和86,733个样本的基因数据。筛选样本设置条件如下：APOB，癌症vs.正常，肝癌，p<0.05。在候选样本中选择样本量最大的Roessier liver2数据集，该样本包含正常肝组织220个，肝细胞癌组织225个。提取表达量数据并进行分析，结果显示APOB的mRNA水平在肝细胞癌中显著低于正常组织(p<0.001；图5A)。
另外，在TCGA数据库中查找APOB在肝癌和正常肝组织中的RNA-seq(polyA+Illumina HiSeq)数据。该数据集共有HCC组织369个样本，正常对照组50个样本。使用在线TCGA可视化分析工具GEPIA对数据进行分析，结果显示肝癌组织中APOB mRNA水平低于正常肝组织，差异具有显著性(p<0.05,图5B)。基因表达数据转化为log2(transcript countper million[TPM]-1)。以上证明APOB在肝癌组织中表达下调。
接下来，使用Kaplan-Meier plotter评估APOB在肝癌中的预后意义。该数据库数据包含基因芯片和RNA-seq检测结果，纳入超过54000个基因在21种癌症中的生存信息,数据来源于GEO(Gene Expression Omnibus database，基因表达数据库)，EGA(EuropeanGenome-phenome Archive，欧洲基因组表型档案)和TCGA数据库。据此对APOB和肝癌患者的总生存期(overall survival,OS)以及无复发生存期(Recurrence free survival,RFS)的关系进行了评估。通过中位数将样本分为高低表达组，(RNAseq ID 338),共纳入364例用于OS分析和316例用于RFS分析(图6)。结果显示，APOB高表达组的OS和RFS中位生存时间分别为70.5个月和30.4个月，显著高于低表达组的31个月和17.9个月(OS,P<0.001；RFS，p<0.05)。这些数据表明组织APOB降低可能是HCC患者预后的预测因子。
实施列2设计并合成APOB,ALB,CD45引物和探针用于肿瘤细胞检测
1.材料和方法
(1)CFSE预标记肿瘤细胞
CFSE,全称为羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯，是一种绿色荧光染料，可被动扩散进入细胞，并与细胞内胺类共价结合，形成稳定的荧光偶联物，该试剂的激发光/发射光为492/517nm。简要的标记方法为：离心收集细胞，调整细胞浓度为1×106个/管；用500μLCFSE工作液(1：1000稀释度)悬浮细胞，于37℃避光孵育20分钟；加入500μL预热的细胞培养基悬浮细胞，37℃孵育5分钟；离心收集细胞，去除染料后，加入预热的细胞培养基悬浮细胞。
(2)外周血白细胞分离
本实施方案中所需外周血白细胞利用LymphoprepTM试剂通过密度梯度离心法获得，具体实施方法为：使用PBS缓冲液等比例稀释外周血样本，混匀；将3mL的LymphoprepTM加入至离心管中；小心将稀释的血液样品铺在LymphoprepTM溶液上；室温条件下1200g离心30分钟(关闭制动)；分离出白细胞所在细胞层，PBS缓冲液清洗两遍后混悬待用。
(3)RosetteSepTM试剂盒富集CTCs
收集外周抗凝静脉血，去除血浆之后，利用RosetteSepTM试剂盒的抗体复合物使白细胞和红细胞交联形成较大体积复合物，联合SepMateTM管的隔离作用和LymphoprepTM密度梯度理性介质的分离作用，负向富集CTCs。
(4)逆转录引物、锁式探针、检测探针
合成表2所示的检测AOPB,ALB,CD45的引物和原位锁式探针以及荧光成像所用的荧光检测探针(荧光检测探针序列来自文献，本实施例检测时使用以下这些探针的混合物以便提高检测灵敏度；实际上也可以有其他的引物和探针设计和组合方式)，所有序列均由北京华大六合华大基因科技有限公司合成。本实施例中为获得高敏感荧光信号，故合成靶向APOB基因的3条引物，其中一条引物为锁核酸修饰，3条对应锁式探针；ALB为6条引物，其中一条引物为锁核酸修饰，6条对应锁式探针；CD45为4条引物，其中一条引物为锁核酸修饰，4条对应锁式探针(试剂操作中不局限于这些数目，只要原位锁式探针杂交检测效果满足要求即可)。
其中，逆转录引物RV_APOB_1'LNA、RV_APOB_1、RV_APOB_2、RV_ALB_2'LNA、RV_ALB_1、RV_ALB_2、RVALB3、RV_ALB_4、RVALB_5、RV_CD45_3'LNA、RV_CD45_1、RV_CD45_2、RV_CD45_3的核苷酸序列分别列于序列表SEQ ID NO:1-13中。锁式探针plp_APOB、plp_APOB-_2、plp_APOB_3、plp_ALB、plp_ALB2、plp_ALB3、plp_ALB4、plp_ALB5、plp_ALB_6、plp_CD45、plp_CD45_2、plp_CD45_3、plp_CD45_4的核苷酸序列分别列于序列表SEQ ID NO:14-26中。检测探针Cy3、Cy5、FITC的核苷酸序列分别列于序列表SEQ ID NO:27-29中。
表2靶基因原位锁式滚换扩增引物和探针序列
Figure BDA0002893758880000101
Figure BDA0002893758880000111
(5)原位锁式杂交
利用上述引物和探针进行mRNA原位锁式杂交，检测肿瘤细胞中的APOB和ALB标志物信号，以确立实验方案。具体操作为：将肿瘤细胞甩片，使用3.7％甲醛溶液固定细胞并梯度脱水(70％,85％和100％)后，加盖Secure-SealTM密封型杂交池；逆转录使用50uL反应体系如下：1μmol/L引物，20U/μL的逆转录酶，1U/μL RNA酶抑制剂，0.5mmol/L dNTPs，0.4μg/μL的BSA。反应条件为45℃反应3个小时。连接反应为50uL体系如下：0.5U/μL连接酶，0.1μm锁式探针，50mmol/L的KCl，20％甲酰胺，0.4μg/μL BSA，以及0.4U/μL RNA酶抑制剂。全部细胞玻片置于湿盒中，湿盒置于分子杂交箱中，反应过程为先37℃、30分钟，之后45℃、45分钟，反应结束后使用缓冲液清洗两次。滚换扩增50uL反应体系如下：5％甘油，0.25mmol/LdNTPs，phi29聚合酶及其缓冲液(按照说明书推荐浓度)。全部细胞玻片置于湿盒中，湿盒置于分子杂交箱中，反应过程为室温下过夜孵育，并于反应结束后使用缓冲液清洗两次。荧光检测探针结合反应体系如下：0.1μmol/L检测探针，20％甲酰胺,2μg/mLHoechst33342细胞核染料。全部细胞玻片置于湿盒中，湿盒置于分子杂交箱中，反应过程为37℃、30分钟，严格避光操作，反应结束后使用缓冲液清洗两次，并进行梯度酒精脱水(70％,85％和100％)，并使用SlowFade抗淬灭试剂滴于标本上，加盖盖玻片4℃冰箱内避光保存；荧光探针信号在共聚焦显微镜下进行检测和结果判读。
2、实验结果
(1)脂代谢标志物APOB可对肝癌肿瘤细胞进行荧光成像。
从图7可知，APOB的荧光信号点均位于预标记CFSE绿色荧光的Hep3B细胞上，而作为对照的白细胞没有检测到APOB荧光信号。以上荧光成像特点，表明脂代谢标志物可标记肝癌肿瘤细胞。
(2)APOB和ALB可对多种不同肝癌细胞系进行荧光成像。
图8为APOB和ALB在不同肝癌细胞系(MHCC97-H细胞、MHCC97-L细胞、MHCC97-LM3细胞、SK-Hep1细胞)的原位锁式探针杂交荧光图像，表明靶向这两个基因的引物和探针组合荧光信号强，特异性高，在多个肝癌细胞系中都有表达，可继续用于临床样本CTCs检测。
(3)APOB，ALB和CD45可分别对肿瘤细胞和白细胞进行荧光成像。
图9a-e显示Hep3B细胞APOB,ALB信号阳性，而CD45信号阴性。图9f-j显示在白细胞上检测到一个CD45探针的荧光信号点，而Cy3和Cy5通道无信号，说明所用探针具有靶向特异性，即靶向APOB和ALB的探针可用于特异性标记肿瘤细胞，在外周血白细胞中没有表达；同时，我们自行设计的CD45引物和探针可以特异性的标记白细胞，而在肿瘤细胞中没有检测出其表达。由此，我们设定CTCs荧光信号特征为：细胞核荧光呈阳性表达，APOB和/或ALB荧光信号呈阳性表达，CD45荧光信号呈阴性表达；我们设定外周血白细胞荧光信号特征为：细胞核荧光呈阳性表达，APOB和ALB荧光信号呈阴性表达，CD45荧光信号呈阳性表达。
(4)APOB，ALB和CD45探针组合原位锁式探针杂交检测肝癌细胞具有高度敏感性和特异性。
将数量约3×104个Hep3B细胞掺入2mL健康体检者外周血，采用表2中检测APOB,ALB,CD45的引物和组合锁式探针对肝癌细胞和白细胞的信使RNA进行原位检测，结果如图10所示，箭头指代白细胞，该细胞尺寸较小，CD45信号阳性，而APOB和ALB信号阴性；白色三角形指代Hep3B肿瘤细胞，该细胞和白细胞比较，体积较大，APOB和ALB信号阳性，而CD45信号阴性。
以上研究结果表明，APOB，ALB和CD45基因在肝肿瘤细胞和白细胞的表达水平并不相同。在肿瘤细胞中，APOB和ALB基因高表达，而不表达CD45；白细胞特异性表达CD45基因，而不表达APOB和ALB基因。CD45是也称为白细胞共同抗原(leukocyte common antigen，LCA)，该分子在所有白细胞上都有表达，是目前CTCs鉴定中用于排除白细胞被广泛使用的标志物。以上实验表明，APOB，ALB和CD45标志物用于鉴定肿瘤细胞具有高度敏感性和特异性。可见，APOB和ALB是潜在的CTCs鉴定标志物。
实施例3脂代谢标志物在肿瘤患者外周血样本中用于CTCs的鉴定和分型
1、材料和方法
(1)招募病理诊断为肝细胞癌并接受手术治疗的肝癌患者28例，同时招募患有肝脏良性疾病(包括慢性肝炎，脂肪肝，肝硬化等)患者5例作为阴性对照，经所有患者知情同意，采集10mL外周血，利用上述方法(实施例2的方法)检测CTCs数目及其脂代谢等标志物的表达情况。
(2)去除血浆之后，利用RosetteSepTM试剂盒负向富集CTCs。利用Hoechst33342细胞核染料和AOPB,ALB,CD45多对引物和探针对固定在玻片上的CTCs进行mRNA原位锁式杂交和荧光标记，按照前述方法(实施例2的方法)，检测外周血CTCs的APOB和ALB标志物信号，以鉴定CTCs，并对其进行分型。
2、结果
(1)如图11A-C所示，部分肝癌患者外周血中检出APOB(箭头标记)和ALB(圆形区域内除箭头标记的其它荧光点)双阳性CTC(s)，外周血白细胞无APOB和ALB表达，CD45探针阳性表达(方框区域内荧光点)。
(2)如图12所示，在几例已发生转移和肝癌术后复发的患者外周血中，检出APOB(箭头标记)和ALB(圆形区域内除箭头标记的其它荧光点)双阳性CTC细胞群。
由上述结果可见，脂代谢相关信号通路分子APOB和ALB可作为CTCs的鉴定标志物，同时说明上述的引物和探针(表2)可用于临床肿瘤患者血液样本的CTCs鉴定，且具有高特异性和高敏感性的特点。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 一种肝癌循环肿瘤细胞标志物及其应用
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> RV_APOB_1'LNA(人工序列)
<220>
<223> “+”前一个核苷酸为锁核酸核苷酸
<400> 1
g+ga+ga+aa+gg+c aggaagaggt 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> RV_APOB_1(人工序列)
<400> 2
tcttagcgtc cagtgtgtac tga 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> RV_APOB_2(人工序列)
<400> 3
aactgtggag ccataagctg tag 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> RV_ALB_2'LNA(人工序列)
<220>
<223> “+”前一个核苷酸为锁核酸核苷酸
<400> 4
g+cc+at+tt+cac cataggtttc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> RV_ALB_1(人工序列)
<400> 5
gctgcgaaat catccataac 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> RV_ALB_2(人工序列)
<400> 6
ttctcatgca acacacataa c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> RV_ALB_3(人工序列)
<400> 7
ggacactgct gaagatactg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> RV_ALB_4(人工序列)
<400> 8
ctgtcatcag cacattcaag 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> RV_ALB_5(人工序列)
<400> 9
tcttgatttg tctctccttc tc 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> RV_CD45_3'LNA(人工序列)
<220>
<223> “+”前一个核苷酸为锁核酸核苷酸
<400> 10
g+ct+ca+ct+ct+c tttactcatt tc 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> RV_CD45_1(人工序列)
<400> 11
ctttctccac tgttgtctta tc 22
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> RV_CD45_2(人工序列)
<400> 12
ctttcaggtc aacttcaata tctc 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> RV_CD45_3(人工序列)
<400> 13
gtctttcagg tcaacttcaa tatc 24
<210> 14
<211> 90
<212> DNA
<213> plp_APOB(人工序列)
<220>
<223> “5phos”表示该寡核苷酸序列5'端进行磷酸化修饰
<400> 14
/5phos/gaagccatct gcaaggagca aaaaaaaaaa aaaaaagtag ccgtgactat cgactaaaaa 60
aaaaaaaaaa ctaagaggaa gcatgtggca 90
<210> 15
<211> 90
<212> DNA
<213> plp_APOB_2(人工序列)
<220>
<223> “5phos”表示该寡核苷酸序列5'端进行磷酸化修饰
<400> 15
/5phos/tcagcagcag ccagtcctgt aaaaaaaaaa aaaaaagtag ccgtgactat cgactaaaaa 60
aaaaaaaaaa ccgccccttg tcaactctga 90
<210> 16
<211> 90
<212> DNA
<213> plp_APOB_3(人工序列)
<220>
<223> “5phos”表示该寡核苷酸序列5'端进行磷酸化修饰
<400> 16
/5phos/ctccaaatgg actcatctgc aaaaaaaaaa aaaaaagtag ccgtgactat cgactaaaaa 60
aaaaaaaaaa ggtcgcctgc caaactgctt 90
<210> 17
<211> 92
<212> DNA
<213> plp_ALB(人工序列)
<220>
<223> “5phos”表示该寡核苷酸序列5'端进行磷酸化修饰
<400> 17
/5phos/gcacagttgc aactcttcgt aaaaaaaaaa aaaacctcaa tgcacatgtt tggctccaaa 60
aaaaaaaaaa accctttttg gagacaaatt at 92
<210> 18
<211> 88
<212> DNA
<213> plp_ALB_2(人工序列)
<220>
<223> “5phos”表示该寡核苷酸序列5'端进行磷酸化修饰
<400> 18
/5phos/caaaagagca actgaaagca aaaaaaaaaa aacctcaatg cacatgtttg gctccaaaaa 60
aaaaaaaaga aacacaagcc caaggcaa 88
<210> 19
<211> 90
<212> DNA
<213> plp_ALB_3(人工序列)
<220>
<223> “5phos”表示该寡核苷酸序列5'端进行磷酸化修饰
<400> 19
/5phos/ctatccgtgg tcctgaacca aaaaaaaaaa aaaacctcaa tgcacatgtt tggctccaaa 60
aaaaaaaaaa tgccctgtgc agaagactat 90
<210> 20
<211> 90
<212> DNA
<213> plp_ALB_4(人工序列)
<220>
<223> “5phos”表示该寡核苷酸序列5'端进行磷酸化修饰
<400> 20
/5phos/ttggtgttga ttgcctttgc aaaaaaaaaa aaaacctcaa tgcacatgtt tggctccaaa 60
aaaaaaaaaa gagaagaaaa tttcaaagcc 90
<210> 21
<211> 90
<212> DNA
<213> plp_ALB_5(人工序列)
<220>
<223> “5phos”表示该寡核苷酸序列5'端进行磷酸化修饰
<400> 21
/5phos/aatgctgcca tggagatctg aaaaaaaaaa aaaacctcaa tgcacatgtt tggctccaaa 60
aaaaaaaaaa tcttaccaaa gtccacacgg 90
<210> 22
<211> 84
<212> DNA
<213> plp_ALB_6(人工序列)
<220>
<223> “5phos”表示该寡核苷酸序列5'端进行磷酸化修饰
<400> 22
/5phos/catgcagata tatgcacaca aaaaaaaaaa acctcaatgc acatgtttgg ctccaaaaaa 60
aaaaaagctg aaacattcac cttc 84
<210> 23
<211> 90
<212> DNA
<213> plp_CD45(人工序列)
<220>
<223> “5phos”表示该寡核苷酸序列5'端进行磷酸化修饰
<400> 23
/5phos/tgccacttaa acatgagctg aaaaaaaaaa aaaacctcaa tgctgctgct gtactacaaa 60
aaaaaaaaaa cccatatgac tataacagag 90
<210> 24
<211> 88
<212> DNA
<213> plp_CD45_2(人工序列)
<220>
<223> “5phos”表示该寡核苷酸序列5'端进行磷酸化修饰
<400> 24
/5phos/aggaaattgt tcctcgtcta aaaaaaaaaa aaacctcaat gctgctgctg tactacaaaa 60
aaaaaaaaag ttcttagggt aacagagg 88
<210> 25
<211> 90
<212> DNA
<213> plp_CD45_3(人工序列)
<220>
<223> “5phos”表示该寡核苷酸序列5'端进行磷酸化修饰
<400> 25
/5phos/gtactgggga gaaggaaagc aaaaaaaaaa aaaacctcaa tgctgctgct gtactacaaa 60
aaaaaaaaaa gaccaggaaa tctgtgctca 90
<210> 26
<211> 90
<212> DNA
<213> plp_CD45_4(人工序列)
<220>
<223> “5phos”表示该寡核苷酸序列5'端进行磷酸化修饰
<400> 26
/5phos/gaaggaaagc aaacatatgg aaaaaaaaaa aaaacctcaa tgctgctgct gtactacaaa 60
aaaaaaaaaa tctgtgctca gtactgggga 90
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Cy3(人工序列)
<400> 27
agtagccgtg actatcgact 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Cy5(人工序列)
<400> 28
agtagccgtg actatcgact 20
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> FITC(人工序列)
<400> 29
cctcaatgct gctgctgtac tac 23

Claims (10)

1.一种肝癌循环肿瘤细胞标志物，其特征在于，所述标志物为脂代谢相关信号通路分子。
2.根据权利要求1所述的一种肝癌循环肿瘤细胞标志物，其特征在于，所述脂代谢相关信号通路分子为APOB和/或ALB。
3.权利要求1或2任一项所述的肝癌循环肿瘤细胞标志物在制备肝癌循环肿瘤细胞鉴定和/或预后预测产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在制备肝癌循环肿瘤细胞鉴定产品时，所述肝癌循环肿瘤细胞标志物为APOB和/或ALB。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在制备肝癌循环肿瘤细胞预后预测产品时，所述肝癌循环肿瘤细胞标志物为APOB。
6.一种肝癌循环肿瘤细胞鉴定和/或预后预测产品，其特征在于，所述产品以脂代谢相关信号通路分子为检测指标。
7.一种肝癌循环肿瘤细胞鉴定和/或预后预测产品，其特征在于，所述产品包括用于检测肝癌循环肿瘤细胞中的脂代谢相关信号通路分子的引物。
8.根据权利要求6或7所述的一种肝癌循环肿瘤细胞鉴定和/或预后预测产品，其特征在于，所述脂代谢相关信号通路分子为APOB和/或ALB。
9.根据权利要求7所述的一种肝癌循环肿瘤细胞鉴定和/或预后预测产品，其特征在于，所述产品采用原位锁式滚环扩增技术，所述引物包括逆转录引物、锁式探针和检测探针。
10.根据权利要求9所述的一种肝癌循环肿瘤细胞鉴定和/或预后预测产品，其特征在于，所述逆转录引物包括如SEQ ID NO:1-3所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO:4-9所示的核苷酸序列，所述锁式探针包括如SEQ ID NO:14-16所示的核苷酸序列和/或如SEQ IDNO:17-22所示的核苷酸序列，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:27-29所示。
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