CN111596053A - Tpn分子在制备循环肿瘤细胞检测试剂中的用途及检测试剂和试剂盒 - Google Patents

Tpn分子在制备循环肿瘤细胞检测试剂中的用途及检测试剂和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了TPN分子在制备循环肿瘤细胞检测试剂中的用途及包含该TPN分子的检测试剂和试剂盒。本发明的TPN分子具有如下所示的结构，可以作为线粒体荧光探针，基于肿瘤细胞和正常细胞的线粒体差异，用于制备循环肿瘤细胞检测试剂，实现对外周血中少量循环肿瘤细胞的检测，TPN对肿瘤细胞的毒性较低，可很大程度地保留CTC的活性和基因完整性，用于循环肿瘤细胞检测，具有高度灵敏性，可精确检出受试者外周血中的少数循环肿瘤细胞，稳定性佳，准确性好，可为肿瘤患者的临床诊断提供参考。
Figure DDA0001975131210000011

Description

TPN分子在制备循环肿瘤细胞检测试剂中的用途及检测试剂 和试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及TPN分子在制备循环肿瘤细胞检测试剂中的用途及检测试剂和试剂盒。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)主要指为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶而进入外周血循环的肿瘤细胞。透过基底膜进入血液后，少数CTCs能逃避机体的免疫杀伤而存活下来，部分肿瘤细胞团也可以直接从原发灶脱离并进入循环系统，形成循环肿瘤微栓(circulating tumor microemboli，CTM)。这些CTCs和CTM随血液播散后可在其他部位形成新的转移灶，与肿瘤的转移和复发密切相关。因而CTC的检测及分析在微转移灶早期发现、疗效评估与个体化治疗等方面具有重要临床应用价值。
但是，CTCs在外周血中十分稀少，癌症早期大约为每1010(100亿)个血细胞或每108-9个白细胞中存在1个CTC，且在形态和类别上有一定的异质性。目前，较为经典的CTC鉴定方法就是根据显色剂标记的CTC表面蛋白特异性抗体与肿瘤细胞通过抗原抗体反应进行定性、定位和定量，包括由此衍生出的流式细胞术鉴定及包被抗体的CTC芯片等相关鉴定技术，常用的抗体有EpCAM抗体、细胞角蛋白CK-8、CK-18和CK-19、抗肿瘤相关糖蛋白(TAG)或特异性标志物(如HER2、抗乳球蛋白等)等。此外，使用逆转录聚合酶链反应检测的方法,基于组织或肿瘤特异性mRNA的异常表达或某些基因突变后DNA水平的改变，检测这些不表达于正常外周血细胞mRNA，能间接提示CTCs的存在。
对上皮型标志物如蛋白或DNA、mRNA进行免疫荧光分析是CTC鉴定最常用的方法，但这类标志物的缺陷十分突出：
1)受肿瘤类型和肿瘤细胞EMT的影响；
基于抗原抗体结合从而进行鉴定的方法如细胞表面蛋白EpCAM、E钙黏素、细胞角蛋白(CK)等这类标志物检测CTC的特异性欠佳，部分正常内皮细胞也会表达上皮型标志物，甚至有研究表明极少数中性粒细胞也会表达；而且这类标志物只表达在部分上皮源性的恶性肿瘤(癌)中，无法用于间叶组织源性的恶性肿瘤，并且即使是源自上皮组织的恶性肿瘤，研究也证实肿瘤细胞亦会在转移、进展和治疗等情况下发生EMT而导致该类标志物的表达降低甚至缺失，从而导致漏检；
2)影响CTC的下游分析应用；
无论是基于抗体还是荧光原位杂交的CTC鉴定方法，大部分须对CTC进行固定、穿膜等繁琐步骤，固定后的细胞难以单细胞分离，并且会很大程度地影响CTC的活性和DNA/RNA质量，给CTC的单细胞分析或培养带来困难；
3)稳定性欠佳；
基于抗体或荧光原位杂交的CTC鉴定方法操作步骤均较为复杂繁琐，使用的试剂及检测平台成本较高，导致CTC的检测价格水涨船高，且难以控制假阳性。这些缺陷极大地限制了CTC的临床推广应用。
此外，对于使用mRNA对细胞进行鉴定的方法而言，尽管RT-PCR技术的灵敏度已经很高，但由于mRNA的不稳定性、取样时上皮细胞的污染、肿瘤标志物在外周血的非正常表达以及假基因干扰等因素的影响，可导致假阳性。同时该方法无法进行形态学观察以及肿瘤细胞的定量，限制了该技术的应用。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷，本发明提供TPN分子在制备循环肿瘤检测试剂中的用途、检测试剂和试剂盒。
本发明提供如下技术方案：
TPN分子在制备循环肿瘤细胞检测试剂中的用途，所述TPN分子具有式(I)所述结构：
Figure BDA0001975131190000031
根据本发明，所述循环肿瘤细胞检测试剂包括所述TPN分子。
根据本发明，所述TPN分子作为线粒体荧光探针标记待测样品中的循环肿瘤细胞。
根据本发明，所述循环肿瘤细胞的来源并没有特别限定，可用于检测，例如可以为来源于肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌中一种或两种以上的肿瘤细胞。
根据本发明，所述待测样品可以为血液、细胞悬浮液、胸水、腹水、脑脊液中的一种。
根据本发明，所述检测试剂还包括细胞裂解液、细胞重悬液。
进一步地，所述检测试剂还包括CD45分子。
根据本发明，所述检测试剂的使用方法包括如下步骤:将待测样品加入CD45抗体；然后加入所述TPN分子，混匀。
根据本发明，所述检测试剂的使用方法还包括添加TPN分子后，用荧光显微镜检测的步骤。
根据本发明，所述检测试剂的使用方法包括待测样品预处理的步骤；在一个实施方式中，所述待测样品为血液样品，所述预处理包括将血液样品用红细胞裂解液处理、离心、重悬、富集处理。
作为本发明的一种实施方式，所述检测试剂的使用方法包括：(1)血液样品加入红细胞裂解液，静置后离心；弃去上清后加入细胞重悬液混匀后进行富集处理；
(2)回收富集的样品，弃去上清，保留管底液体；加入CD45抗体，混匀后孵育，例如30-45min；然后加入TPN分子，混匀后共同孵育一定时间，例如5-15min；
(3)加入PBS吹打混匀后离心，弃去上清后转移至多孔板中，于荧光显微镜下观察；
(4)在405nm激发波长下进行观察，TPN阳性、细胞体积较大、CD45阴性的细胞，作为样品中CTC的数量。
根据本发明，所述多孔板没有特别限定，可以为本领域已知的用于镜下观察细胞的多孔板，例如各种类型和规格的细胞培养板或者玻片。优选地，所述多孔的细胞培养板可以为96孔板。
本发明还提供一种循环肿瘤细胞检测试剂，其包括上述TPN分子。
本发明进一步提供一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其包括上述检测试剂。
根据本发明的检测试剂盒，所述试剂盒还包括储存所述检测试剂的容器。
进一步地，所述试剂盒还包括使用所述试剂盒的指导说明，例如产品说明书、使用示意图等。
因肿瘤细胞生长活跃，其体内线粒体的数量远多于血液中白细胞的线粒体数量，故本发明使用TPN对血液细胞进行染色时，白细胞的荧光强度较弱，而肿瘤细胞的荧光强度较强，基于二者荧光强度的差异结合CD45抗体对白细胞的区分，从而在血液中检测循环肿瘤细胞。
有益效果
(1)本发明利用TPN靶向线粒体的独特性质基于肿瘤细胞与正常血细胞线粒体差异进行CTC鉴定，不依赖蛋白标志物，不受肿瘤细胞类型、表面标志物以及EMT的限制，可用于泛癌检测，扩展临床应用范围，不易造成CTC漏检。
(2)TPN具有低毒性、高荧光强度、高光稳定性等优点，且TPN可以快速聚集于细胞线粒体中，激活RIM，产生明亮的黄光，使得肿瘤细胞与白细胞可以很好地区分。且TPN对肿瘤细胞的毒性较低，可很大程度地保留CTC的活性和基因完整性，本发明的检测试剂用于检测时无需固定、穿膜等复杂操作，可最大程度保留CTC的活性和基因组完整性，便于CTC的下游单细胞分析以及体外培养。经TPN标记后的CTC可用于下游的单细胞基因组和转录组分析，获得肿瘤病人的分期分型、药物耐受等信息，优于市场上的大多数可能造成CTC基因信息丢失的鉴定方法，具有极高的临床应用价值。
(3)本发明将TPN分子用于循环肿瘤细胞检测，具有高度灵敏性，可精确检出受试者外周血中的少数循环肿瘤细胞，稳定性佳，准确性好，可为肿瘤患者的临床诊断提供参考。
术语定义和说明
术语“循环肿瘤细胞”或“CTCs”，是指从肿瘤脱落并在血液中(即在循环中)存在的肿瘤细胞，包括自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶而进入外周血循环的肿瘤细胞。
术语“样品”或“标本”是指从生物有机体获取或分离的试样，例如来自受试者的血液试样，示例性的生物学试样包括但不限于：生物流体试样、血清、血浆、尿液、唾液、肿瘤组织、肿瘤活检物和/或组织试样等；还包括未处理或预处理的生物学试样。在一些实施方式中，还可以包括来自受试者的细胞，例如来自受试者肿瘤细胞的试样。
术语“癌症”或“肿瘤”是指干扰机体器官和系统的正常功能的不受控的细胞生长，包括良性和恶性。患有癌症或肿瘤的受试者是在受试者体内存在客观上可测量的癌细胞的受试者。
术语“线粒体荧光探针”是指能进入细胞内，选择性与线粒体进行结合的荧光物质。
术语“EMT”是指上皮细胞-间充质转化，包括上皮细胞通过特定转化程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。
术语“RIM”代表Restriction of intramolecular motions，即分子内振转受限，指的是在聚集过程中振动受限和转动受限同时存在时，表现出聚集诱导发光(AIE)效应。
附图说明：
图1：HeLa细胞的荧光图像。A为TPN(0.75×10-6M)染色5分钟，呈黄色荧光；B为MitoTracker red FM(MT，50×10-9M)染色15分钟，呈红色荧光；C为A和B的合并图像，呈橙色荧光；D为HeLa细胞的明场图像。
图2：相同染色条件下(TPN 2μM，CD45 1:50)相同荧光条件下肿瘤细胞及血液白细胞(WBC)的荧光成像效果。
图3：在加标实验中通过TPN鉴定肿瘤细胞；A为肿瘤细胞发出强的黄色荧光，B为预标记的CFDA SE的绿色荧光，C为白细胞(CD45+)呈红色荧光，D为明场图像；比例尺30μm；
图4：A549、H1975、HepG2、SMMC-7721、HT29、MDA-MB-231细胞和白细胞用2μM的TPN染色15分钟的荧光图像；比例尺200μm。
图5：TPN检测H1975细胞和HepG2细胞的回收率分布。
图6：来自27名肺癌患者和10名健康受试者的5mL全血中TPN阳性细胞计数结果；*P<0.05。
图7：PI法检测TPN对HeLa细胞的细胞毒性。
图8：通过MDA(左)和MALBAC(右)从单个A549细胞扩增的10个靶基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。
图9：MDA对A549单细胞扩增后，通过Sanger测序证实有KRAS突变(p.G12S c.34G>A)。
图10：Agilent 2100生物分析仪对单个A549细胞转录组扩增产物的质量评估。
图11：TPN分子和2-NBDG探针对于A594肿瘤细胞的荧光强度对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。此外，应理解，在阅读了本发明所公开的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
TPN分子：TPE-PyN3，溶解于DMSO；在405nm处激发，636nm处具有最大吸收峰，发射明亮黄光。其具有如下所示结构：
Figure BDA0001975131190000071
Mito Tracker Red FM(MT)：线粒体红色荧光染色剂，来源于碧云天公司。
红细胞裂解液：GBiosciences Lot:180607
细胞重悬液：Clearbridge Biomedics公司的Clear
Figure BDA0001975131190000072
重悬液
CD45抗体：BD Bioscience PE-Mouse Antibody Cat:560975
Clear
Figure BDA0001975131190000073
System：购于Clearbridge Biomedics公司
CFDA SE：细胞增殖示踪荧光探针，购于碧云天公司
RPMI1640培养基：来源于Roswell Park Memorial Institute。
实施例1：TPN的线粒体靶向特性检测
在混合物DMSO-H2O(v：v＝1:99)中，TPE-PyN3分子聚集成纳米聚集体并发射具有量子的强黄色荧光，合成时TPE-PyN3产率为9.9％。TPE-PyN3分子与培养细胞HeLa细胞系和非癌性成纤维细胞孵育5分钟后，TPE-PyN3可以选择性积累在细胞线粒体中，发出强烈的黄色荧光(参见图1A)，通过与MT进行共定位来验证TPE-PyN3。衡量两个变量线性关联的Pearson相关系数(Rr；从+1到-1)，用来分析两个荧光通道之间的分布范围。宫颈癌细胞系HeLa细胞和非癌性成纤维细胞3T3细胞共染色后的荧光图像显示TPE-PyN3与线粒体中MT共定位，分别具有Rr＝0.96(HeLa)和0.95(3T3)。这些结果表明TPE-PyN3对线粒体具有高度特异性，可作为细胞的荧光生物探针线粒体形态学成像。
实施例2：TPN对肿瘤细胞和白细胞的区分效果
将肿瘤细胞(H1975肺癌细胞系)先进行CFDA SE(碧云天)10μM 20min预染。
白细胞染色：将全血进行红细胞裂解后，离心弃去上清，取下层白细胞进行重悬，将预染的肿瘤细胞加入。CD45抗体按1:50加入进行染色，30分钟后加入2μM TPN分子共同孵育15min，加入2mLPBS后离心去除上清，将管底剩余约300μL液体放入九十六孔板中进行观察。
根据相同染色条件下(TPN 2μM,CD45 1:50)相同荧光条件下肿瘤细胞及白细胞的荧光成像效果(参见图2)可以看出，肿瘤细胞因线粒体数量较多，生命活动旺盛，可发出明亮黄光，CD45呈阴性；白细胞黄光几乎不可见，CD45阳性。
我们在进一步的实验中观察到：在同样的作用条件下，6种不同肿瘤细胞(A549细胞、H1975细胞、HepG2细胞、SMMC-7721细胞、HT29细胞、MDA-MB-231细胞)的荧光强度均明显强于白细胞，荧光强度差异显著(参见图4)。进一步在少数CFDA SE预标记的肿瘤细胞系模拟添加回收实验中，利TPN阳性结合CD45阴性的判别标准，可在众多的白细胞背景中显著辨别出TPN荧光强度显著增高的肿瘤细胞(参见图3)。
实施例3：采用TPN鉴定循环肿瘤细胞
共收集受试者27份肺癌全血标本，10例健康志愿者血样(血液样品由南方医院检验科提供)。
(1)血液样品使用EDTA抗凝管进行收集，采集5mL血液，加入三倍体积红细胞裂解液，室温放置10min后500g离心10min；弃去上清后加入细胞重悬液混匀后进行Clear
Figure BDA0001975131190000091
System的富集处理；
(2)回收的样品500g离心10min，弃去上清，保留管底200μL液体。以1:50的稀释度加入CD45抗体，混匀后孵育45min；然后加入终浓度为2μM的TPN荧光分子，混匀后共同孵育15min；
(3)加入1mLPBS吹打混匀后进行500g 10min离心，弃去上清后余200μL液体转移至九十六孔板中，于荧光显微镜下观察；
(4)分别在两个波长的荧光通道下观察，其中TPN为405nm，CD45为594nm。TPN阳性、细胞体积较大、CD45阴性的细胞，作为标本中CTC的数量。
在27例肺癌患者全血中，检出TPN阳性且CD45为阴性的CTC数量最多为57个，最少为0个，TPN阳性的个体共19例，阳性率为70.4％。在10份健康志愿者的全血样本中，TPN阳性CTC数量均为0个，癌症患者检出的TPN阳性数量显著高于健康志愿者(参见图6)，提示该方法可用于临床标本CTC的检测鉴定。尽管肺癌患者中仍然有少数样本呈现TPN阴性，但发明人认为是由于CTC在较早期的肿瘤患者外周血中数量极少，且分布不均匀，采血时未采取到含有CTC的血样所致。
实施例4：TPN检测肿瘤细胞系的回收实验
(1)CFDA SE预标记肿瘤细胞：
①使用2mL10μM CFDASE染色的RPMI1640培养基液预标记肿瘤细胞，消化后用改良牛鲍氏计数板进行计数；
收集1mL健康志愿者全血标本于15mL离心管中，取红细胞裂解液向标本中以1:3的比例加入，混匀后上下颠倒，裂解5-10min；
⑤600g离心8min，弃去上清，加入1mLPBS，重悬沉淀后，600g离心8min，弃去上清，加入1mLPBS重悬后即为裂解得到的白细胞；
⑦用改良牛鲍氏计数板分别计数添加了10000个相应肿瘤细胞后的培养基内的细胞浓度，从其中吸取3500个肿瘤细胞(若添加至白细胞中的肿瘤细胞数为100-200个)加入到1.5mLRPMI1640培养基中，轻轻混匀；
⑧分别吸取50μL添加了相应肿瘤细胞后的培养基至九十六孔板中，用普通光学显微镜计数液滴中的肿瘤细胞数量，即为添加入白细胞中肿瘤细胞的实际数量(根据需要加入的细胞数量可以进行肿瘤细胞的添加或稀释)；
⑨用改良牛鲍氏计数板计数白细胞，取30000个白细胞于1.5mLEP管中；
⑩向白细胞中加入50μL相应肿瘤细胞的细胞悬液，用RPMI1640培养基将混合细胞悬液的体积补齐至100μL。
(2)TPN的标记与回收：
①向(1)处理后的的EP管中加入终浓度为2μM的TPN荧光分子，室温避光孵育15min；
②向EP管中加入1mLRPMI1640培养基，5000rpm离心10min，将TPN清洗干净，弃掉上清，剩余约200μL RPMI1640培养基；
③用浸润过含防黏附剂PBS的移液枪头吹打混匀剩下的细胞悬液，吹打至少20次以上，将悬液加入至不透光壁96孔板的孔中，吸取200μL含防黏附剂的PBS清洗管壁，加入至96孔板的另一个孔内，在倒置荧光显微镜下观察结果，计数带有绿色荧光的CFDASE阳性的细胞以及其中TPN阳性的细胞数量，计算回收率。
利用肺癌细胞系H1975细胞和肝癌细胞系HepG2细胞作为代表细胞系，进行了TPN检测肿瘤细胞系的回收实验。进行不同数量的肿瘤细胞系添加回收实验，并且多次重复实验，实验结果显示，TPN检测H1975细胞的回收率范围为90％-100％，TPN检测HepG2细胞的回收率范围为91.9％-100％，可满足TPN检测临床标本CTC的需求，可用于CTC的鉴定。
实施例5：TPN对HeLa细胞的毒性影响
(1)碘化吡啶法检测TPN浓度对HeLa细胞活力的影响
荧光染料PI(碘化丙啶)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色，点亮死亡细胞。
在悬浮细胞中加入如图7所示不同浓度(0μM、1.5μM、3.0μM、4.5μM)的TPN荧光分子，室温避光孵育15min；再加入1mLRPMI1640培养基，5000rpm离心10min，将TPN清洗干净，弃掉上清，剩余200μL混匀加入至96孔板室温下静置2h；以1.5μM的浓度向孔中加入PI染料，在倒置荧光显微镜下观察，计数带有TPN阳性的细胞以及其中PI阳性的死细胞，计算死亡率。
图7为碘化吡啶法检测TPN对于HeLa细胞的杀伤作用，可以看出，当TPN浓度为3μM时，HeLa细胞活力仍维持在95％以上，可见，TPN对肿瘤细胞的毒性较低，可以很大程度保留CTC的活性和基因完整性。
(2)TPN标记后的肿瘤细胞基因组扩增可靠性
利用MDA(选用Qiagen REPLI-g Single Cell Kit(24)试剂盒)和MALBAC(亿康
Figure BDA0001975131190000111
单细胞全基因组扩增试剂盒)两种可用于不同下游基因分析的单细胞基因组扩增方法，按照试剂盒说明书的操作步骤，用A549细胞系测试了这两种扩增方法对用TPN荧光差异鉴定后单个肿瘤细胞的基因组扩增效果。我们对单细胞扩增产物进行了10个不同基因位点的PCR扩增和PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示用MDA和MALBAC试剂盒进行的单细胞扩增的基因覆盖率至少达90％以上(图8)。
此外，将肺癌细胞系A549细胞加入到健康志愿者全血中，利用MDA扩增法将其中的单个A549细胞进行挑取扩增后，对KRAS基因的PCR产物进行测序，测序结果显示其具有A549细胞的KRAS基因特征性突变(p.G12S c.34G>A)(图9)，这验证了单细胞扩增的可靠性。
(3)TPN标记后的细胞转录组测序可靠性利用单个细胞的转录组扩增技术进行进一步确认。利用TPN鉴别后的A549肺癌细胞，对其进行细胞裂解，逆转录合成cDNA第一链以及全长cDNA扩增，用Agilent 2100生物分析仪对单个A549细胞转录组扩增产物的质量评估结果显示单细胞转录组扩增产物的浓度、总量和完整性较好，可用于建库测序，扩增产物可满足下游转录组测序分析的要求(图10).
对比例
将A549肿瘤细胞及裂解后的白细胞分别使用TPN分子以2μM的浓度染色15分钟后加入PBS进行洗涤，进行流式荧光强度分析。同理，将A549肿瘤细胞及裂解后的白细胞分别使用GBICO公司无糖DMEM培养基脱糖三小时后，使用1mM浓度的2-NBDG探针加入染色20分钟，同等方法洗涤后进行流式荧光强度分析。以白细胞的荧光强度作为本底，肿瘤细胞的荧光强度倍数作为对比(图11)。
标记细胞葡萄糖代谢的探针2-NBDG虽然也是一种可用于肿瘤细胞活性检测的探针，但在实际应用过程中，其对肿瘤细胞与白细胞的区分度较差，且需进行较长时间的脱糖步骤。结果表明，本发明的TPN分子与该2-NBDG探针相比，检测速度更快，对于肿瘤细胞和白细胞有更好区分效果，灵敏度更高，具有良好的临床应用前景。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.TPN分子在制备循环肿瘤细胞检测试剂中的用途，其特征在于，所述TPN分子具有式(I)所述结构：
Figure FDA0001975131180000011
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述循环肿瘤细胞检测试剂包括所述TPN分子。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述TPN分子作为线粒体荧光探针标记待测样品中的循环肿瘤细胞。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，所述循环肿瘤细胞来源于肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌中一种或两种以上的肿瘤细胞；
优选地，所述待测样品为血液、细胞悬浮液、胸水、腹水、脑脊液中的一种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于，所述检测试剂包括细胞裂解液、细胞重悬液；
优选地，所述检测试剂还包括CD45分子。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于，所述检测试剂的使用方法包括如下步骤:将待测样品加入CD45抗体；然后加入所述TPN分子，混匀；
优选地，所述检测试剂的使用方法还包括添加TPN分子后，用荧光显微镜检测的步骤。
7.根据权利要求1-6任一项所述的用途，其特征在于，所述检测试剂的使用方法包括待测样品预处理的步骤；优选地，所述待测样品为血液样品，所述预处理包括将血液样品用红细胞裂解液处理、离心、重悬、富集处理。
8.根据权利要求1-7任一项所述的用途，其特征在于，所述检测试剂的使用方法包括：(1)血液样品加入红细胞裂解液，静置后离心；弃去上清后加入细胞重悬液混匀后进行富集处理；
(2)回收富集的样品，弃去上清，保留管底液体；加入CD45抗体，混匀后孵育；然后加入TPN分子，混匀后共同孵育；
(3)加入PBS吹打混匀后离心，弃去上清后转移至多孔板中，于荧光显微镜下观察；
(4)在405nm激发波长下进行观察，TPN阳性、细胞体积较大、CD45阴性的细胞，作为标本中CTC的数量；
优选地，所述多孔板为多孔细胞培养板或玻片；优选地，所述多孔板为96孔板。
9.一种循环肿瘤细胞检测试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的TPN分子。
10.一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求9所述检测试剂；
优选地，所述试剂盒还包括储存所述检测试剂的容器；
优选地，所述试剂盒还包括使用所述试剂盒的指导说明，例如产品说明书、使用示意图。
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