CN105849559A - 用于检测循环肿瘤细胞(ctcs)的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测体液优选血液和淋巴液中循环肿瘤细胞(CTC)的方法。特别是，用于检测体液中循环肿瘤细胞的方法包括检测细胞已经封装在分离体积的所述体液之内的pH变化和/或至少一种选自乳酸、乳酸根离子、质子中的分子的浓度变化的步骤。

Description

用于检测循环肿瘤细胞(CTCS)的方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测体液优选血液和淋巴液中循环肿瘤细胞(CTC)的方法和装置。特别是，用于检测体液中循环肿瘤细胞的方法，包括如下步骤：检测细胞已经封装在分离体积的所述体液之内的pH变化和/或至少一种选自乳酸、乳酸根离子、质子中的分子的浓度变化的步骤。
背景技术
现在，人们普遍同意在医学领域中检测和计数CTC的可能性可以带来重要的信息。
特别是，该信息可以用于界定许多形式的癌症的诊断、治疗和监测体系。
用于分离和检测来自血液的CTC的一些已知方法包括，例如，使用涂覆有能够识别特定细胞表面标志物的特异性抗体的磁珠。基于抗体/表面标志物相互作用的技术的商业示例包括由Veridex制造的Cell Search SystemTM。
然而，表面蛋白作为用于分离和检测CTC的靶的使用遇到了不同的问题，例如缺乏CTC上的独特生物标志物，仅仅分离/检测EpCAM+上皮细胞以及不可能使用分离的细胞用于进一步分析。由于分离/检测需要纯化的抗体这样的事实，与这方法相连的进一步的问题是速度慢(使用Cell Search SystemTM每天仅可以进行8个分析)和成本高(每个材料分析仅约350$，650$包括进行分析的技术援助[由Istituto Oncologico Veneto,Padova提供数据])。
用于检测CTC的其它已知方法利用物理性质(例如尺寸或硬度)以从非肿瘤细胞中区别肿瘤细胞。但是，这些方法还没有得到临床验证。
用于检测CTC的当前技术的综述可以在“Circulating Tumour Cells:LiquidBiopsy of Cancer,C.Alix-Panabieres and K.Pantel,Clinical Chemistry 59:1,110-118(2013)；和“Techniques for Label-Free Separation of Circulating TumourCells:from Historical Foundations to Recent Developments”,C.Jin et al,LabChip,2013,DOI:10.1039/C3LC50625H中找到。
因此，对能够克服现有技术中所描述的方法的缺点，能够改善循环肿瘤细胞的检测的替代方法，存在着巨大的需求。
发明内容
然后，本发明所解决的技术问题是，通过使用能够克服上述缺点的替代方法，提供能够检测和分离体液中的CTC的方法。
引起本发明的部分工作已经接受了来自欧洲研究委员会根据欧盟第七框架计划(FP7/2007-2013)/ERC第269051号项目拨款协议的资金。
本发明基于以下观察：肿瘤细胞的生物化学与正常细胞的不同。更具体地说，在需氧条件下大多数癌细胞表现出称为Warburg效应的现象(Koppenol,W.H.,P.L.Bounds,andC.V.Dang,Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancermetabolism.Nat Rev Cancer,2011.11(5):p.325-37)，即，与具有低速糖酵解、线粒体中丙酮酸的氧化和不产生乳酸盐的正常细胞相比，甚至在氧存在下胞浆中快速糖酵解与乳酸产生。为了避免细胞内pH的酸化，应当将糖酵解产生的酸由肿瘤细胞经由如V-ATP酶、Na+/H+交换器(NHE)、碳酸酐酶、质子联单羧酸转运蛋白MCT、C1-/HCO3-交换器和ATP合成酶的几个质子转运蛋白排出。这些转运蛋白的活性增加会导致正常的细胞内外pH梯度的反转，从而使癌细胞产生细胞外微环境的显著酸化，而它们在内部保持正常的或微碱性pH值。
在对于肿瘤细胞系代谢的相对近期的研究中，表明单个肿瘤细胞每小时分泌高达3.68×10-13摩尔的酸(DeBerardinis,R.J等人,“Beyond aerobic glycolysis:transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds therequirement for protein and nucleotide synthesis”,Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(49):p.19345-50)。
由于质子在血浆中被极度稀释，无法直接检测诸如血液的体液中由稀少肿瘤细胞分泌的酸。
虽然无法检测细胞外环境中这种变化，发明人已观察到，当在非常小体积中分离肿瘤细胞时，可显著检测到所述体积内的化学成分的变化和由肿瘤细胞的不同生物化学的化学成分的变化。
因此，在一个方面，本文所描述的发明涉及一种如权利要求1中所定义的用于检测循环肿瘤细胞的方法。
更特别地，用于检测体液中循环肿瘤细胞(CTC)的方法方法包括以下步骤：
-将细胞封存在约10pL至10nL体积的所述体液中；
-将所述体积在4℃至37℃温度下温育至少1分钟；
-检测所述经过温育的体积内的pH变化和/或至少一种选自乳酸、乳酸根离子、质子的分子的浓度变化，
其中，相对于所述温育步骤之前相同体积测定的pH值和/或浓度，所述pH的降低和/或所述至少一种分子的浓度的增加表明所述体液中存在循环肿瘤细胞。
从本发明的同一实施方案的以下详细描述来看，本发明的其它优点和特征将是显而易见的。
附图说明
图1a和1b分别示出用于实施根据本发明的方法的实施方案的微流体芯片和荧光传感装置；
图2a和2b分别示出，微流体装置中(静止的)紧密堆积的乳液的荧光显微照片和通过微流体装置内的液滴内含有的肿瘤(A549)细胞的横截面，示出了来自液滴的荧光；和
图3示出了来自含有肿瘤细胞(A549)和白血细胞(PBMC)的液滴中pH敏感染料的荧光强度的比较，示出了每滴的平均荧光强度、沿X轴的分散数据以更好地可视化数据点。
图4荧光酶乳酸测定。左上角，明亮的液滴封装癌细胞，大部分液滴的是空的，而在右边两个含有细胞的液滴封装PBMC(外周血单核细胞)。请注意，一个以上PBMC存在于液滴内，与具有仅一个单个癌细胞的液滴相比，这未使得液滴更明亮。
图5A-5D示出在580/630发射比(比越高，pH越低)记录在y轴上并且峰宽在x轴上的情况下，曲线图中癌细胞和白血细胞的不同分布。具体地，图5A是指白血细胞；图5B是指三阴性乳腺癌细胞；图5C是指来自乳腺转移癌的细胞；图5D是指来自结肠直肠腺癌的细胞。
图6A-6B示出在580/630发射比(比越高，pH越低)记录在y轴上的情况下，曲线图中循环卵巢癌细胞和白血细胞的不同分布。
具体实施方案
本发明涉及用于检测体液中循环肿瘤细胞(CTC)的方法和装置。
用于检测循环肿瘤细胞(CTC)的方法
如上面已经显示的，用于检测体液中循环肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：
-将细胞封装在约10pL至10nL体积的所述体液中；
-将所述经过分离的体积在4℃至37℃温度下温育至少1分钟；
-检测所述经过温育的体积内的pH变化和/或至少一种选自乳酸、乳酸根离子、质子的分子的浓度变化，
其中相对于所述温育步骤之前对相同体积测定的pH值和/或浓度，所述pH的降低和/或所述至少一种分子的浓度的增加表明所述体液中存在循环肿瘤细胞。
本发明的方法还可包括用水或含盐缓冲液稀释所述体积的体液的步骤。
在本发明的优选实施方案中，经过分离的体积是基于液滴的微流体装置内的液滴的形式。在本说明书中，表述“经过分离的体积”和“经过封装的体积”是可互换的。
液滴微流体装置能够操纵皮升液滴形式的离散流体包并满足对在较低的成本、较高的吞吐量和较高的灵敏度下可以进行测定的需要。该技术非常适于连续地进行操作和操纵，如封装和筛选。特别是，液滴微流体装置能够使用基于荧光的技术或质谱法筛选各个液滴以将液滴与其他液它区分出来，以存储它们，以将它们再注射到其它微流体装置，以将液体与其它液滴融合以及以在液滴中培养细胞。因此，通过将例如来自1mL至10mL血液的所有细胞封装到各个液滴中，可以容易地将CTC分离，从而提供廉价的诊断应用和用于进一步研究的单细胞。
具体地，液滴可以是微流体装置中的水性乳液的一部分。在一个实施方案中液滴在油包水乳液(W/O乳液)中，但原则上也可使用双乳液。可以在芯片上或单独形成乳液。由于Warburg效应主要在需氧条件下发生，使用帮助储存溶解氧的氟化油作为乳液的油组分可能是有利的。此外，可以将表面活性剂加入到该氟化油中。如现有技术所描述的那些合适的氟化油如，例如，来自3MTM的FC-77和FC-40。
如上所述，实施本发明的方法以检测体液中的CTC。在本发明的实施方案中，所述体液选自包括血液、血清、淋巴液、胸膜液、腹膜液、脑脊液的组。在优选的实施方案中，所述体液是血液。
在每毫升血液可以含有约4-11×106白血细胞和109红血细胞的情况下，该方法还可以包括除去红血细胞以加速吞吐量的步骤。
本发明的方法还包括温育经过分离的(经过封装的)体积的步骤。更具体而言，温育的步骤可以在室温至37℃的温度下进行。
温育时间可以是至少一分钟至48小时。特别是，在乳酸或pH检测的情况下可以是至少一分钟。这些时间可以随着管理细胞的条件(例如：培养基)的调整而变化。温育步骤可以在芯片上或芯片外进行。
分泌到100pL的体积中的质子(在水中乳酸部分离解成乳酸阴离子和H+)的影响的粗略计算表明，即使一段短时期的温育后，经过分离的体积的pH降低。特别是，发明人观察到1h中每100pL体积约3.68×10-13摩尔的H+分泌将导致大约3.68mM浓度变化，如果从纯水1开始，在温育1小时后将导致pH从pH 7降低至pH 2.4。
如前所述，根据本文所描述的方法的一个实施方案，可通过在温育步骤后检测经过分离的体积内的pH值的变化显示体液中CTC的存在。这种变化可以通过使用本领域技术人员已知的适合于检测pH值变化的任何技术来检测。
pH值变化可通过pH指示剂来确定。
pH指示剂可是pH敏感染料或pH改变时改变其吸收/发射光谱的指示剂。这些指示剂的例子是在酸性pH下发绿荧光的pHrodoTM Green(Life Technologies)，在酸性pH下580nm和640nm之间的荧光的比增加的-4F 5-(和-6)羧酸(Life Technologies)和聚集以形成微晶的pH敏感无机盐。
此外，该方法还可以包括由染料的激发波长中的激光照射经过温育的体积以检测pH指示剂的信号的步骤。可以理解的是，即使在该实施方案中，照射后pH值的改变是发射的信号的函数。
如上所述，通过测定经过温育的体积内的至少一种选自乳酸、乳酸根离子和质子(在水中乳酸部分离解成乳酸盐阴离子和H+的乳酸)的分子的浓度也可进行CTC检测。浓度可以通过使用本领域技术人员已知的对于这样的目的的任何技术来测定。例如，可以通过荧光指示剂(Cell Technology公司的氟代乳酸检测试剂盒)测定乳酸。
更进一步可选择的检测可以基于液滴的机械性能和/或基于检测内容物粘度的变化，在这种情况下，指示剂可以包括经受pH诱导聚合的单体。根据所监测的分泌(或吸收)，也可以采用其它指示剂。
为了例如培养循环肿瘤细胞或从遗传或蛋白质组学角度进行表征或用于药物筛选目的，该方法还可以包括分选出包括所检测的CTC的经过分离的体积的步骤。
用于检测循环肿瘤细胞(CTC)的装置
本文中还公开了用于检测循环肿瘤细胞(CTC)的装置。
特别是，用于检测体液中循环肿瘤细胞的装置包括：
-用于将细胞封装在大约10pL至10nL的体积中的装置；
-用于检测所述经过温育的体积内的pH变化和/或至少一种选自乳酸、乳酸根离子、质子的分子的浓度变化的装置。
在本发明的一个实施方案中，所述用于分离所述体积的装置是基于液滴的微流体装置。
如上所述参照所述方法，液滴的体积可在pL至nL范围内，例如小于10nL、5nL、1nL或500pL；在实施方案中，优选的体积是100pL级。在微流体装置中，通道的最大尺寸优选小于1000、500、300、200或100μm。
在一个实施方案中，液滴是在微流体装置内的油包水乳液(W/O乳状液)的水性液滴。可以在芯片上或单独形成乳状液。由于Warburg效应主要在需氧条件下发生，使用有助于存储溶解氧的氟化油作为乳液的油组分可能是有利的。优选将表面活性剂加入到氟化油中。如现有技术所述的那些合适的氟化油如，例如，来自3MTM的FC-77和FC-40。
在本发明的一个实施方案中，所述用于检测的装置包括pH敏感染料和/或随着pH值变化改变其吸收光谱的指标剂。这些指示剂的例子是在酸性pH下发绿荧光的pHrodoTMGreen(Life Technologies)，在酸性pH下580nm和640nm之间的荧光的比增加的-4F 5-(和-6)羧酸(Life Technologies)和聚集以形成微晶的pH敏感无机盐。
在本发明的一个实施方案中，所述用于检测的装置可以是能够测定所述经过温育的体积内所述经过温育的体积内的至少一种选自乳酸、乳酸根离子和质子的分子的浓度(在水中乳酸部分离解成乳酸阴离子和H+)的装置。例如可以通过荧光指示剂(由CellTechnology公司提供的氟乳酸检测试剂盒)测定乳酸。
在一个实施方案中，检测工具还可以直接包括在液滴内。
液滴内pH值变化的检测也可以通过使液滴通过包括传感装置(例如荧光传感装置)的微流体装置中的通道来进行。
此外，为了检测pH指示剂的信号，该装置可包括能够发射在荧光团的激发范围内的波长的激光。可以理解的是，即使在本实施方案中，照射后pH值的改变是发射的信号的函数。该装置可以包括检测器，如光电倍增管。
实验实施例
1.材料
PhRodo Green(Invitrogen Inc.)，pH敏感染料，在酸性pH下荧光绿
氟乳酸检测试剂盒(Cell Technology,Inc.)
D-葡萄糖(Sigma-Aldrich)
HFE-7500(3M Inc)
FC-40(3M)，氟化油
PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液
去离子水中0.9％NaCl溶液
PDMS(聚二甲基硅氧烷)试剂盒(Dow Corning)
SNARF-5F或4F(Invitrogen)
2.溶液
油相：HFE-7500中2％(w/w)SS01(氢氟乙醚溶剂)
染料存储液：DI(去离子)水中1mg/ml pHrodo Green(Invitrogen Inc.)；
染料存储液：2mM SNARF-5F或4F；
葡萄糖存储液：DI水中0.5M葡萄糖；
pHrodo Green温育缓冲液：将PBS和0.9％NaCl以体积比1:3和1:5混合(缓冲液离子(HPO4 2-和H2PO4)浓度约3和2mM)。每毫升所得缓冲溶液中添加50μL葡萄糖存储液和20μL染料存储液(终浓度25mM葡萄糖和20μg/ml pHrodo Green)；
SNARF-5F或4F的温育缓冲液：HBSS，10mM葡萄糖，Joklik改性EMEM。
3.细胞
A549细胞(人肺癌，Hubrecht实验室)为DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基，培养基)+10％胎牛血清培养10分钟中的培养物，用0.25％胰蛋白酶-EDTA分离并重新悬浮于温育缓冲液中。
通过聚蔗糖(Ficoll，注册商标)密度梯度分离来分离外周血单核细胞(PBMC)。以抗凝血剂获取来自全血的血沉棕黄色层，稀释约4.5倍。将聚蔗糖加入到血的下部，在室温下在800g离心细胞25分钟。除去中间相并洗涤两次(在650g下10min和在550g下5min)。最后，将细胞重新悬浮于无血清RPMI(Roswell Park Memorial Institute培养基)。
4.PDMS装置制造
使用光刻法制造PDMS复制的母模。将SU8-2025的25μm厚层旋涂于硅片上，烘烤，通过透明掩膜曝光，再烘烤并显影。制造商建议的处理条件用于整个过程。
将PDMS预聚物和交联剂以质量比10:1(w/w)混合；将混合物倒在母模上，脱气并在65℃固化至少2小时。
从母模上分离复制品，使用钝的皮下注射针在储层上钻孔。PDMS复制品用肥皂水和乙醇洗涤并用氮气吹干。用氧等离子体处理和粘合干净的载玻片和干净的PDMS复制品。用引入微流体通道(足以完全润湿整个微流体网络)中的FC-40中1％(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)-1-三氯硅烷使装置硅烷化，然后将该装置在95℃下保持至少30分钟。
5.检测
静态液滴的观察：利用Olympus IX81倒置落射荧光显微镜进行荧光测量。显微镜配备xCite 120Q灯(Lumen Dynamics Group Inc.)、过滤器组和iXon 897相机(Andor)。
流动液滴的观察：如图1所示，利用Olympus IX71倒置显微镜逐个分析流动液滴。将激光(Cube,Coherent Inc.)光束扩张(～10倍)并将其集中在检测通道的中间。通过PMT检测器(H8249,Hamamatsu)检测受激发的液滴的荧光信号。
6.检测pH值变化
对癌细胞和白血细胞分别评价pH值。在一个实验中，将30至50μL温育缓冲液中的细胞悬浮液在T型接合微流体装置中乳化(高度：25μm；连续相通道和分散相通道的宽度均为20μm)。分散相流速为120μL/h；连续相流量为600μL/h。将乳液收集在塑料瓶中，随后在37℃温育1小时。为了观察，将液滴a)放置在显微镜载玻片上，或b)注入微流体装置中。该检测由PhrodoGreen或SNARF-5F或SNARF-4F进行。首先荧光增加同时pH降低，SNARF改变它们的吸收光谱，同时pH值变化，更特别地，当pH降低时在580nm处荧光增加，在640nm处荧光降低。因此，580/630比越高，pH值越低。使用倒置落射荧光显微镜检测荧光。
结果
结果显示于图5e 6和下表1。
特别地，如上面已经指出的，580/630比越高，pH值越低。癌细胞在7.4至6.4范围内而白血细胞没有下降至低于pH值7.0。
表1
580/630比 pH值
1 7.4
1.5 7.0
2 6.8
2.5 6.6
3 6.4
3.5 6.2
4 6
4.5 5.8
5 5.6
5.5 5.22
参照图6A-6B，可以理解的是，在相对于具有血细胞检测癌细胞中阈值x<7且y>1.5提供100％特异性。
7.检测乳酸分泌
使用癌细胞(A549)和来自红血细胞裂解溶液的白血细胞的混合悬浮液评价乳酸分泌。使用三通道架构微流体回路：一个通道带来细胞悬浮液，一个通道带来乳酸测定的酶，一个通道带来油相。在4℃下进行乳化步骤以停止细胞新陈代谢以避免由癌细胞的整个溶液的乳酸盐污染。使用该微流体装置，我们只能在封装微滴中后将细胞暴露于乳酸测定的酶，以避免封装前的非特异性活化。乳化后15分钟在室温下拍摄照片。
结果
由于在含有细胞的液滴中pH变化的荧光示于图2。含有A549肿瘤细胞的液滴与空液滴是可区别的。在单独的实验中，在葡萄糖存在下温育PBMC。A549和PBMC的比较示于图3中：从荧光显微照片中手动选择空的液滴和含细胞的液滴，对空液滴的测量包括在对两个实验进行的比较中。两种细胞类型都显示pH值降低(荧光强度增加)，但是在A549肿瘤细胞的情况下，这基本上更显著。
在乳酸测定的情况下，类似结果可以在图4中看到。
因此，可以理解的是，本文所描述的方法的实施方案使检测和快速计数CTC的无抗体方法便利。本公开的目的方法的实施方案可以用于预后、治疗监测和治疗诊断应用。例如，为了分层和/或治疗的实时监测以及为了评估转移性复发和/或转移发展的风险，可以采用该方法。
目前为止已经参考优选的实施方案描述了本发明。意图在于，可以存在参考同一发明核心的其它实施方案，所有都落入如下所列的权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于检测体液中循环肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：
-将细胞封装在约10pL至10nL体积的所述体液中；
-将所述体积在4℃至37℃温度下温育至少1分钟；
-检测所述经过温育的体积内的pH变化和/或至少一种选自乳酸、乳酸根离子、质子的分子的浓度变化，
其中，相对于在所述温育步骤之前对相同体积测定的pH和/或浓度，所述pH的降低和/或所述至少一种分子的浓度的增加表明所述体液中存在循环肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述体积是基于液滴的微流体装置内的液滴形式。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述液滴是W/O乳液中的水性液滴。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述乳液的油组分是氟化油，优选地是添加了表面活性剂的氟化油。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，还包括用水或含盐的缓冲液稀释所述体积的步骤。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述体液选自包括血液、血清、淋巴液、胸膜液、腹膜液、脑脊液的组。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述pH变化通过使用pH指示剂来检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述pH指示剂是pH敏感染料或随着pH变化而改变其吸收/发射光谱的指示剂。
9.根据权利要求7或8所述的方法，还包括：由发射可见光波长的激光照射所述经过温育的体积的步骤；所述变化是所述经过照射的体积的发射信号的函数。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述温育步骤在4℃至37℃温度下进行并且持续至少1分钟的温育时间。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111423971A (zh) * 2020-04-17 2020-07-17 南京鼓楼医院 一种用于循环肿瘤细胞捕获的聚合物微球及其制备方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10697972B2 (en) 2016-01-12 2020-06-30 Bioatla, Llc Diagnostics using conditionally active antibodies
EP3403098B1 (en) * 2016-01-12 2021-09-22 BioAtla, Inc. Diagnostics using conditionally active antibodies
EP3214446A1 (en) * 2016-03-03 2017-09-06 Medcom Advance, S.A. Apparatus and method for detection of tumour cells and circulating tumour cells
FR3050212B1 (fr) * 2016-04-15 2020-09-25 Chu Montpellier Procede de detection et/ou de caracterisation de cellules tumorales et appareil associe
AU2018320264B2 (en) * 2017-08-21 2024-08-15 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Methods of diagnosing and treating lung cancer
IT202000016429A1 (it) * 2020-07-07 2022-01-07 Univ Degli Studi Udine Metodo per la valutazione dell’attivita’ metabolica di una cellula non-tumorale

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101213455A (zh) * 2005-06-24 2008-07-02 埃佩多夫阵列技术股份有限公司 用于检测和/或定量细胞在响应外在刺激时的等级分子变化的方法和工具
CN101395472A (zh) * 2006-01-17 2009-03-25 协乐民公司 预测生物系统反应的方法
US20110059861A1 (en) * 2009-09-08 2011-03-10 Nodality, Inc. Analysis of cell networks
WO2012137207A1 (en) * 2011-04-06 2012-10-11 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Methods of monitoring and analyzing metabolic activity profiles diagnostic and therapeutic uses of same

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2680532C (en) * 2006-04-18 2017-03-21 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based pyrosequencing
JP5547071B2 (ja) * 2007-08-09 2014-07-09 セルラ・インコーポレイテッド 関連付け多パラメーター単一細胞測定および残留する生物学的材料の回収のための方法および装置
WO2011112827A2 (en) * 2010-03-12 2011-09-15 The General Hospital Corporation Amplifying rare cell surface markers

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101213455A (zh) * 2005-06-24 2008-07-02 埃佩多夫阵列技术股份有限公司 用于检测和/或定量细胞在响应外在刺激时的等级分子变化的方法和工具
CN101395472A (zh) * 2006-01-17 2009-03-25 协乐民公司 预测生物系统反应的方法
US20110059861A1 (en) * 2009-09-08 2011-03-10 Nodality, Inc. Analysis of cell networks
WO2012137207A1 (en) * 2011-04-06 2012-10-11 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Methods of monitoring and analyzing metabolic activity profiles diagnostic and therapeutic uses of same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LINAS MAZUTIS ET AL.: "Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics", 《NATURE PROTOCOLS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111423971A (zh) * 2020-04-17 2020-07-17 南京鼓楼医院 一种用于循环肿瘤细胞捕获的聚合物微球及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
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