ITRM20130700A1 - Metodo per il rilevamento di cellule tumorali circolanti - Google Patents
Metodo per il rilevamento di cellule tumorali circolantiInfo
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Description
"METODO PER IL RILEVAMENTO DI CELLULE TUMORALI
CIRCOLANTI"
CAMPO TECNICO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un metodo ed ad un apparato per rivelare cellule tumorali circolanti (CTC) in fluidi biologici, preferibilmente nel sangue e nel liquido linfatico.
In particolare, il metodo per rivelare le cellule tumorali circolanti in un liquido corporeo comprende un passaggio di rivelazione di un cambiamento del pH e/o di una concentrazione di almeno una molecola scelta tra acido lattico e ioni lattici all’interno di un volume isolato di detto fluido corporeo in cui è stata incapsulata una cellula.
STATO DELLA TECNICA NOTA DELL’INVENZIONE
Oggigiorno, c’è consenso diffuso circa la possibilità che rivelare e contare le cellule tumorali circolanti CTC possa condurre ad importanti informazioni in campo medico.
In particolare, queste informazioni possono essere usate per definire una diagnosi, un trattamento e un sistema di monitoraggio di molte forme di cancro.
Alcune procedure note per isolare e rivelare le CTC da sangue includono, ad esempio, l’uso si sfere magnetiche rivestite con specifici anticorpi in grado di riconoscere specifici marcatori di superficie. Esempio di tecnologie commerciali basate sull’interazione marcatori di superficie/anticorpi includono CellSearch System<TM>prodotto da Veridex.
Tuttavia, l’uso di proteine di superficie come marcatori per isolare e rivelare CTC soffre di diversi problemi che sono, ad esempio, una mancanza di biomarcatori unici sulle CTC, l’esclusiva rivelazione/isolamento delle cellule epiteliali e l’impossibilità di usare le cellule isolare per le successive analisi. Di conseguenza con le procedure note basate sull’interazione marcatore di superficie/anticorpo sono isolate sia cellule non tumorali che CTC. Ulteriori problemi legati a questo approccio sono la bassa velocità (con CellSearch System<TM>possono essere eseguite solamente 8 analisi al giorno) e l’alto costo (circa 350$ solamente di materiale ad analisi, 650$ incluso l’assistenza tecnica per effettuare l’analisi [Dati dell’Istituto Oncologico Veneto, Padova]) dovuto al fatto che sono richiesti anticorpi purificati per l’isolamento/rivelazione.
Altri metodi noti per rivelare le CTC usano le proprietà fisiche (come dimensioni e durezza) per discriminare le cellule tumorali da cellule non tumorali. Questi metodi, tuttavia, non sono stati ancora validati clinicamente.
U’analisi dell’attuale tecnologia per le rivelazione delle CTC può essere trovata in: “Circulating Tumour Cells: Liquid Biopsy of Cancer, C. Alix-Panabieres and K. Pantel, Clinical Chemistry 59: 1,110-118 (2013); e “Techniques for Label-Free Separation of Circulating Tumour Cells: from Historical Foundations to Recent Developments”, C. Jin et al, Lab Chip, 2013, DOI:10.1039/C3LC50625H.
Pertanto, c’è un’enorme bisogno di sviluppare approcci alternative capaci di migliorare la rivelazione delle Cellule Circolanti Tumorali e che permetta di superare gli svantaggi dei metodi descritti nello stato della tecnica nota.
SOMMARIO DELL’INVEZIONE
Il problema tecnico risolto dalla presente invenzione è dunque quello di fornire un metodo ed un apparato che permettano di rivelare e isolare le CTC da un fluido corporeo usando un approccio alternative che consenta di superare gli svantaggi sopra menzionati.
Parte del lavoro che ha condotto a questa invenzione ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio Europeo per la ricerca nell'ambito del Settimo Programma dell'Unione europea European (European Union’s Seventh Framework Programme/FP7/2007-2013)/ERC) accordo concesso no.269051
L’invenzione si basa sull’osservazione che la biochimica delle cellule tumorali è differente da quella delle cellule normali. Più in particolare, in condizione aerobiche molte cellule cancerose mostrano un fenomeno noto come effetto Warburg, (Koppenol, W.H., P.L. Bounds, and C.V. Dang, Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancer metabolism. Nat Rev Cancer, 2011. 11(5): p.325-37), che è, elevato tasso di glicolisi nel citosol con produzione di lattato anche in assenza di ossigeno, rispetto a cellule normali che hanno un basso tasso di glicolisi, di ossidazione di piruvato nei mitocondri e nessuna produzione di lattato. Al fine di evitare l’acidificazione del pH intracellulare, l’acido prodotto glicoliticamente deve essere espulso dalle cellule tumorali attraverso diversi trasportatori di protoni, come V-ATPase, lo scambiatore Na+/H+ (NHE), l’anidrasi carbonica, il trasportatore monocarbossilato protone legato MCT, gli scambiatori C1-/HCO3 e ATP sintetasi. L’aumentata attività di questi trasportatori causa la reversione dei normali gradienti di pH intracellulare così che le cellule cancerose producono un’acidificazione significativa dell’ambiente extra cellulare mantenendo internamente un pH normale o leggermente alcalino.
In uno studio relativamente recente sul metabolism della linea cellular tumorale, è stato mostrato che le single cellule tumorali secernano fino a 3.68x10<-13>moli di acido per ora (DeBerardinis, R.J., et al., “Beyond aerobic glycolysis: transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis”, Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(49): p.19345-50).
La secrezione degli acidi da parte delle rare cellule tumorali nel fluido corporeo come sangue non può essere rilevata direttamente poiché i protoni diventano infinitamente diluiti nel plasma.
Sebbene questo cambiamento nll’ambiente cellular non può essere rilevato gli inventori hanno osservato che quando una cellula tumorale è isolate in un volume molto piccolo possono essere rilevati in maniera significativa cambiamenti nella composizione chimica all’interno di detto volume isolate e risultanti dalle differenze biochimiche della cellula tumorale.
Pertanto, in un aspetto l’invenzione qui descritta si riferisce ad un metodo per rivelare cellule tumorali circolanti come definito nella rivendicazione 1.
In un altro aspetto l’invenzione si riferisce ad un apparato per rivelare le cellule tumorali circolanti come definito nella rivendicazione 10.
Più in particolare, il metodo per rivelare cellule tumorali cirolanti (CTC) in un fluido corporeo comprende i seguenti passaggi:
- incapsulare una cellula in un volume di circa da 10 pL a 10 nL di detto fluido; - incubare detto volume ad una temperature di da 4°C a 37°C per almeno un minuto;
-rivelare un cambiamento nel pH e/o in una concentrazione di almeno una molecola scelta tra acido lattico e ioni lattato all’interno di detto volume incubato, in cui una diminuzione di detto pH e/o un aumento della concentrazione di detta almeno una molecola, rispetto ad un pH e/o ad una concentrazione determinate per lo stesso campione prima del passaggio di incubazione, indica la presenza di cellule tumorali circolanti in detto fluido corporeo.
L’apparato per rivelare le cellule tumorali circolanti in un fluido corporeo comprende invece:
-mezzi per incapsulare una cellula in un volume di circa da 10 pL a 10 nL di detto fluido
-mezzi per rivelare un cambiamento nel pH e/o in una concentrazione di almeno una molecola scelta tra acido lattico, ioni lattato all’interno di detto volume incubato.
La presente invenzione fornisce alcuni vantaggi rilevanti come la possibilità di usa direttamente le cellule isolate per le analisi successive grazie al fatto che nessun anticorpo marcato è usato per la loro rivelazione.
In altre parole, l’apparato per la rivelazione e l’isolamento delle CTC qui descritto non comporta alcuna modifica biochimica/molecolare delle CTC e pertanto, esse possono essere usate in analisi successive senza il rischio di alterazione dei risultati finali.
Altri vantaggi e caratteristiche della presente invenzione saranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliate di alcune forme di realizzazione dell’invenzione.
BRVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI.
Le figure 1a e 1b mostrano, rispettivamente, un chip microfluidico e un sensore di fluorescenza per implementare una forma di realizzazione del metodo secondo la presente invenzione;
Le figure 2a e 2b mostrato rispettivamente un micrografo di una emulsion strettamente impacchettata (stazionaria) in un dispositivo microfluidico, e un sezione trasversale di una cellula tumorale (A549) contenuta all’interno di una goccia nel dispositivo microfluidico, illustrante la fluorescenza derivante dalla goccia; e ,
La figura 3 mostra un paragone dell’intensità di fluorescenza da un colorante pH-sensibile nelle gocce contenenti cellule tumorali (A549) e cellule bianche del sangue (PBMCs), che mostra l’intensità media di fluorescenza per goccia, diperdendo i dati lungo l’asse delle X per meglio visualizzare i punti dei dati.
La figura 4 saggio fluorescente enzimatico per il lattato. La parte in alto a sinistra, goccia più luminosa, ha incapsulato una cellula tumorale, la maggioranza delle gocce sono vuote, mentre le due gocce contenenti le cellule sulla destra incapsulano PBMC (cellule mononucleate del sangue periferiche). Si noti che più di una PBMC è presente all’interno delle gocce, e questo non rende la goccia più lucente rispetto alle goccie con una sola cellula cancerosa.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE.
L’invenzione si riferisce ad un metodo e ad un apparato per la rivelazione di cellule tumorali circolanti (CTC) in fluidi biologici.
Metodo per rivelare le cellule tumorali circolanti (CTC)
Il metodo per rivelare le cellule tumorali circolanti in un fluido corporeo, come già sopra indicato, comprende i seguenti passaggi: - incapsulare una cellula in un volume di circa da 10 pL a 10 nL di detto fluido;
- incubare detto volume ad una temperature di da 4°C a 37°C per almeno un minuto;
-rivelare un cambiamento nel pH e/o in una concentrazione di almeno una molecola scelta tra acido lattico e ioni lattato all’interno di detto volume incubato, in cui una diminuzione di detto pH e/o un aumento della concentrazione di detta almeno una
molecola, rispetto ad un pH e/o ad una concentrazione determinate per lo stesso campione prima del passaggio di incubazione, indica la presenza di cellule tumorali circolanti in detto fluido corporeo.
Il metodo dell’invenzione può anche comprendere un passaggio di diluizione del volume del fluido corporeo con acqua o tamponi contenenti sali.
In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il volume isolato è in forma di una goccia all’interno di un dispositivo microfluidico a base di gocce. Nella presente descrizione l’espressione “volume isolato” e volume incapsulato” sono intercambiabili.
Il dispositivo micro fluidico a gocce consente la manipolazione di pacchetti fluidici discrete in forma di gocce di picolitri e affronta il bisogno di costi più bassi, più alta resa e più alta sensibilità a cui i saggi possono essere effettuati. La tecnica è ben adottata per effettuare operazioni e manipolazioni in serie, come incapsulazione e esami. In particolare, il dispositivo microfluidico a gocce consente di esaminare gocce single usando tecniche basate sulla florescenza o spettrometria di massa, di selezionare le gocce da altre gocce, di conservarle, di ri-iniettarle in altri dispositivi microfluidici, di fondere le gocce con altre gocce e coltivare le cellule nelle gocce. Così, mediante l’incapsulazione di tutte le cellule a partire da 1 mL di sangue in single gocce, le TCT possono essere isolate fornendo applicazioni diagnostiche non costose e cellule singole per studi successivi.
In particolare, le gocce possono essere parte di una emulsione acquosa in un dispositivo microfluidico. In una forma di realizzazione la goccia è in una emulsione acqua in olio (emulsione A/O), ma in principio può essere usata anche una doppia emulsione. L’emulsione può essere formata sul chip o separatamente, Poiché l’effetto di Warburg si verifica principalmente in condizione aerobiche, può essere vantaggioso utilizzare come componente oleosa dell’emulsione un olio di fluoro che aiuta a conservare l’ossigeno dissolto. Inoltre, può essere aggiunto un tensioattivo all’olio di fluoro. Idoneo olio di fluoro sono come quelli descritti nello stato della tecnica nota come, ad esempio, , FC-77 e FC-40 della 3M<TM>.
Il metodo dell’invenzione, come sopra indicato, è effettuato per rivelare le CTC nei fluidi corporei. In una forma di realizzazione dell’invenzione, detto fluido corporeo è scelto nel gruppo comprendente sangue, siero, fluido linfatico, fluido della pleura, fluido peritoneale, fluido cerebrospinale. In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il fluido corporeo è sangue.
Nel caso del sangue che può contenere circa 1-5 x 10<5>di cellule bianche del sangue per ml e 10<9>di cellule del sangue rosse, il metodo può anche comprendere un passaggio di rimozione delle cellule rosse del sangue allo scopo di accelerare la resa.
Il metodo dell’invenzione comprende anche un passaggio di incubazione del volume isolato (incapsulato). Più in particolare, il passaggio di incubazione può essere effettuato ad una temperatura da a temperatura ambiente a 37°C.
Il periodo di incubazione può essere da almeno un minuto a 48h. in particolare, esso può essere di almeno un minute nel caso del lattato o, secondo il nostro primo esperimento, 20 minuti o più nel caso della rivelazione del pH. Questi tempi possono variare settando le condizioni (ad esempio: i terreni/mezzi) in cui le cellule sono maneggiate.
Il passaggio di incubazione può essere effettuato o sul chip o fuori dal chip.
Un calcolo approssimativo dell’influenza dei protoni secreti (acido lattico si dissocia parzialmente in acqua in anione lattato e H<+>) in un volume di 100 pL mostra che anche dopo un breve periodo di incubazione, il pH del volume isolato diminuisce. In particolare, gli inventori hanno osservato che una secrezione di circa 3.68 x 10<-13>moli per 100 pL di volume in 1 h risulterebbe in un cambiamento di concentrazione di circa 3.68 mM, che se si inizia con acqua pura, condurrebbe ad una goccia di pH da pH 7 a pH 2.4 dopo un’ora di incubazione.
Come menzionato precedentemente, second una forma di realizzazione del metodo qui descritto la presenza di CTC in un fluido biologic può essere dimostrata rilevando un cambiamento nel valore del pH all’interno del volume isolato dopo il passaggio di incubazione. il cambiamento può essere rilevato usando qualsiasi tecnica nota al tecnico del settore essere idonea a rivelare un cambiamento nei valori del pH. Il cambiamento nei valori del pH può essere determinato mediante un indicatore di pH. L’indicatore di pH può essere sa un colorante sensibile al pH sia un indicatore che cambia il suo spettro di assorbimento/emissione mentre il pH cambia. Esempi di questi indicatori sono pHrodo™ Green (Life Technologies), che emana fluorescenza verde a pH acido, SNARF®-4F acido 5-(e-6)Carbossilico (Life Technologies), con un rapporto tra 580nm e 640nm di fluorescenza che aumenta a pH acido, e sali inorganici sensibili al pH che si aggregano a formare microcristalli.
Inoltre, il metodo può comprendere anche un passaggio di irradiazione del volume incubato mediante un laser nella lunghezza d’onda di eccitazione del colorante allo scopo di rivelare il segnale dell’indicatore del pH. Si noterà che, anche in questa forma di realizzazione, il cambiamento nei valori di pH è funzione del segnale messo dopo l’irradiazione.
Come sopra indicato, la rivelazione delle CTC può essere anche effettuata determinando la concentrazione di almeno una molecola scelta tra acido lattice e ioni lattato (l’acido lattice si dissocia parzialmente in acqua in ione lattato e H<+>) all’interno del volume incubato. La concentrazione può essere determinata usando una qualsiasi tecnica nota alla persona esperta per tale scopo. In via esemplificativa, l’acido lattice può essere determinate con indicatori di fluorescenza (Fluoro lactate detection kit by Cell Technology, Inc.).
In aggiunta, in maniera alternative la rivelazione può essere basata sulle proprietà meccaniche di una goccia e/o sulla rivelazione di un cambiamento della viscosità dei contenuti, in tal caso l’indicatore può comprendere un monomero che va incontro a polimerizzazione pH indotta. A seconda della secrezione (o assorbimento) monitorata possono essere utilizzati anche altri indicatori.
Il metodo può anche comprendere un passaggio di selezione del volume isolato comprendente la rivelazione delle CTC allo scopo, ad esempio, di coltivare le cellule tumorali circolanti, o per caratterizzarle da un punto di vista genetic o proteomico, o per scopi di selezione di farmaci.
Apparato per rivelare le cellule tumorali circolanti (CTC)
Oggetto della presente invenzione è anche un apparato per la rivelazione delle cellule tumorali circolanti (CTC).
In particolare, l’apparato per la rivelazione delle cellule tumorali circolanti in un fluido corporeo comprende:
-mezzi per incapsulare una cellula in un volume di circa da 10 pL a 10 nL di detto fluido
-mezzi per rivelare un cambiamento nel pH e/o in una concentrazione di almeno una molecola scelta tra acido lattico, ioni lattato all’interno di detto volume incubato.
Come già descritto sopra con riferimento al metodo, il volume di una goccia può essere nell’intervallo da pL a nL, ad esempio meno di 10 nL, 5 nL, 1 nL o 500 pL; un volume preferito è, in forme di realizzazione, dell’ordine di 100 pL. In un dispositivo microfluidico la dimensione massina di un canale è preferibilmente minore di 1,000, 500, 300, 200 o 100 micrometri.
In una forma di realizzazione la goccia è una goccia acquosa in una emulsione acqua in olio (emulsione A/O) all’interno del dispositivo microfluidico.
L’emulsione può essere formata sul chip o separatamente, Poiché l’effetto di Warburg si verifica principalmente in condizione aerobiche, può essere vantaggioso utilizzare come componente oleosa dell’emulsione un olio di fluoro che aiuta a conservare l’ossigeno dissolto. Preferibilmente, viene aggiunto un tensioattivo all’olio di fluoro. Idoneo olio di fluoro sono quelli descritti nello stato della tecnica nota come, ad esempio, , FC-77 e FC-40 della 3M<TM>.
In un forma di realizzazione dell’invenzione detti mezzi di rivelazione comprendono un colorante sensibile al pH sia un indicatore che cambia il suo spettro di assorbimento/emissione mentre il pH cambia. Esempi di questi indicatori sono pHrodo™ Green (Life Technologies), che emana fluorescenza verde a pH acido, SNARF®-4F acido 5-(e-6)Carbossilico (Life Technologies), con un rapporto tra 580nm e 640nm di fluorescenza che aumenta a pH acido, e sali inorganici sensibili al pH che si aggregano a formare microcristalli.
In una forma di realizzazione dell’invenzione detti mezzi di rivelazione sono capaci di determinare la concentrazione di almeno una molecola scelta tra cido lattice, ioni lattato all’interno del volume incubato (l’acido lattico si dissocia parzialmente in acqua in anione lattato e H<+>). In via esemplificativa, l’acido lattice può essere determinate con indicatori di fluorescenza (Fluoro lactate detection kit by Cell Technology, Inc.).
In una forma di realizzazione, i mezzi di rivelazione possono essere includi direttamente nelle gocce.
La rivelazione dei cambiamenti dei valori del pH all’interno della goccia possono essere effettuati passando le gocce attraverso un canale nel dispositivo microfluidico che comprende un sensore, ad esempio, un sensore della fluorescenza.
Inoltre, l’apparato può comprendere un laser capace di emettere lunghezza d’onda nell’intervallo di eccitazione del fluoroforo allo scopo di rivelare il segnale dell’indicatore di pH. Si noterà che, anche in questa forma di realizzazione, il cambiamento nei valori di pH è funzione del segnale emesso dopo l’irradiazione. L’apparto può inoltre comprendere un rivelatore come un fotomoltiplicatore.
ESEMPI SPERIMENTALI
Materiali
Phrodo Green (Invitrogen Inc.), colorante sensibile al pH, verde fluorescente a pH acido
Fluoro Lactate Detection Kit (Cell Technology, Inc.)
D-glucosio (Sigma-Aldrich)
HFE-7500 (3M Inc)
FC-40 (3M), olio fluorinato
Tampone PBS (phosphate-buffered saline)
0.9% soluzione NaCI in acqua DI
PDMS (polidimetilisilicone) kit (Dow Corning)
Soluzioni
Fase oleosa: 2% (w/w) di SS01 in HFE-7500 (un solvente idrofluroetere)
Stock di colorante: 1 mg/ml pHrodo Green (Invitrogen Inc.) in water (deionizzata) DI; Stock di glucosio: 0.5 M glucosio in DI acqua;
Tamponi di incubazione: PBS e 0.9% NaCI sono stati miscelati in un rapporto volumetrico 1:3 e 1:5 (concentrazione degli ioni tamponi (HPO4<2->and H2PO4) approsimativamente 3 and 2 mM).50 µL della stock di glucosio e 20 µL delle soluzioni della stock di colorante sono state aggiunte ad ogni mL di soluzione tampone risultante (concentrazione finale 25 mM di glucosio e 20 µg/ml di pHrodo Green).
Cellule
Cellule A549 (carcinoma del polmone umano, Hubrecht lab) sono state culture in DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, un mezzo di coltura) 10 min a 10% siero fetale bovino, staccate utilizzando 0,25% tripsina-EDTA e risospese nel tampone di incubazione.
Le cellule mononucleate del sangue (PBMC) sono state isolate mediante separazione su gradiente di densità Ficoll (marchio registrato). Lo strato leucocitario dal sangue completo di anticoagulante è preso e diluito a circa 4.5x. Ficoll viene aggiunto sotto il sangue e le cellule sono depositate a temperatura ambiente per 25 minuti mediate rotazione a 800g. L’interfase viene rimossa e lavata due volte (10 min a 650g, e 5 min a 550g). Infine, le cellule sono risospese in RPMI senza siero (Roswell Park Memorial Institute Culture medium).
Fabbricazione del dispositivo PDMS
La fotolitografia è stata usata per fabbricare una master per la replica PDMS. Uno strato di 25 micron di spessore di SU8-2025 è stato depositato sui wafer di silicio, cotto, esposto tramite maschera di trasparenza, nuovamente cotto e sviluppato. Per l'intero processo sono state utilizzate le condizioni di trasformazione suggerita dal produttore.
Il pre-polimero PDMS e l’agente reticolante sono stati miscelati in un rapporto di massa di 10:1 (w / w), una miscela è stata versata su un maestro, degassata e cotta a 65C per almeno 2 ore.
La replica è stata staccata dal master e serbatoi erano forati usando un ago ipodermico smussato. Una replica PDMS è stata lavata con acqua e sapone ed etanolo, ed essiccata con azoto. Un vetrino pulito e una replica PDMS pulita sono stati trattati con plasma di ossigeno e incollati. Il dispositivo è stato silanizzato con 1% (Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl)-1-triclorosilano in FC-40, che è stato introdotto in canali microfluidici (sufficiente a bagnare completamente tutta la rete microfluidica) e poi il dispositivo è stato mantenuto a 95 C per almeno 30 min.
Rivelazione
Osservazione di gocce statiche: un microscopio Olympus IX81 a epifluorescenza invertito è stato utilizzato per misure di fluorescenza. Il microscopio è stato dotato di lampada XCITE 120Q (Lumen Dynamics Group Inc.), set di filtri GFP (Semrock) e Ixon 897 fotocamera (Andor).
Osservazione di goccioline che scorrono: Come mostrato nella Figura 1, un microscopio invertito Olympus IX71 è stato utilizzato per analizzare goccioline che scorrono uno per uno. Un fascio laser (cubo, Coherent Inc.) è stato ampliato (~ 10x) e concentrato fino a metà del canale di rilevamento. Il segnale di fluorescenza delle goccioline eccitate è stato rilevato da un rivelatore PMT (H8249, Hamamatsu).
Rivelazione cambiamento pH
Il valore di pH è stato valutato separatamente per le cellule cancerose e globuli bianchi. In un esperimento da 30 a 50 ml di sospensione cellulare in tampone di incubazione sono stati emulsionati in un dispositivo microfluidico ad incrocio a T (altezza: 25 micron; le larghezze dei canali di fase continua e disperdente erano 20 micron). La portata della fase dispersa era di 120 ml / h, la portata della fase continua è 600µL / h. L'emulsione è stata raccolta in un flacone di plastica e successivamente incubata a 37 ° C per 1 h. Per le osservazione di goccioline sono state a) poste sul vetrino da microscopio o b) iniettate in un dispositivo microfluidico. La fluorescenza è stata rilevata utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito.
Rivelazione della secrezione di acido lattico
La secrezione di acido lattico è stata valutata utilizzando sospensioni miste di cellule tumorali (A549) e globuli bianchi da una soluzione di sangue rosso di cellule lisate. E’ stata utilizzata un’architettura circuitale microfluidica a tre canali: un canale portando la sospensione cellulare, uno portando gli enzimi per il saggio del lattato e uno portando fase oleosa. Il passaggio di emulsionare è stato eseguito a 4 ° C per fermare il metabolismo cellulare per evitare la contaminazione del lattato dell'intera soluzione dalle cellule tumorali. Con questo dispositivo microfluidico potremmo esporre cellule agli enzimi del saggio del lattato solo dopo l'incapsulamento nelle micro-goccioline, per evitare l'attivazione aspecifica prima dell'incapsulamento. Le immagini sono state prese 15 minuti dopo l’emulsionamento, a temperatura ambiente.
Resultati
La fluorescenza dovuta al cambiamento del pH nella cella contenente goccioline è mostrata in Figura 2. Goccioline contenenti una cellula tumorale A549 sono distinguibili da goccioline vuote. In un esperimento separato PMBCs sono state incubate in presenza di glucosio . Un confronto tra A549 e PMBCs è mostrato in Figura 3: goccioline vuoti e contenenti cellule sono state selezionate manualmente da micrografie fluorescenza, e le misurazioni delle goccioline vuote sono state incluse per il confronto per entrambi gli esperimenti . Entrambi i tipi di cellule mostrano diminuzione del pH (aumento d’intensità di fluorescenza), ma questo è sostanzialmente più marcata nel caso delle cellule tumorali A549.
Nel caso del dosaggio del lattato, risultati analoghi può essere visti in figura 4.
Si può pertanto comprendere che nelle forme di realizzazione del metodo e l'apparecchiatura qui descritta facilitano un metodo privo di anticorpi per la rivelazione e il conteggio rapido delle CTC. Forme di realizzazione del metodo oggetto della presente descrizione possono essere utilizzati per la prognosi e anche per il monitoraggio della terapia e applicazioni teranositche. Ad esempio, il metodo può essere impiegato per la stratificazione e / o monitoraggio in tempo reale delle terapie nonché per la stima del rischio di recidiva metastatica e / o progressione metastatica .
La presente invenzione è stata fin qui descritta con riferimento a forme di realizzazione preferite. S’intende che vi possono essere altre forme di realizzazione che si riferiscono al medesimo nucleo inventivo, tutte rientranti nell'ambito di protezione delle rivendicazioni sotto riportate.
Claims (16)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la rivelazione di cellule tumorali circolanti in un fluido corporeo comprendente i seguenti passaggi: - incapsulare una cellula in un volume di circa da 10 pL a 10 nL di detto fluido; - incubare detto volume ad una temperature di da 4°C a 37°C per almeno un minuto; -rivelare un cambiamento nel pH e/o in una concentrazione di almeno una molecola scelta tra acido lattico e ioni lattato all’interno di detto volume incubato, in cui una diminuzione di detto pH e/o un aumento della concentrazione di detta almeno una molecola, rispetto ad un pH e/o ad una concentrazione determinate per lo stesso campione prima del passaggio di incubazione, indica la presenza di cellule tumorali circolanti in detto fluido corporeo.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto volume è in forma di un goccia all’interno un dispositivo microfluidico a base di gocce.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 2, in cui detta goccia è un goccia acquosa in una emulsione A/O.
- 4. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui la componente oleosa di detta emulsione è un olio di fluoro, preferibilmente con l’aggiunta di un tensioattivo.
- 5. Metodo seconda una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, ulteriormente comprendente un passaggio di diluizione di detto volume con acqua o tamponi contenenti sale.
- 6. Metodo seconda una qualsiasi delle rivendicazioni da 1-5, in cui ditto fluido corporeo è scelto nel gruppo comprendente sangue, siero, fluido linfatico, fluido peritoneale, fluido cerebrospinale.
- 7. Metodo seconda una qualsiasi delle rivendicazioni da 1-6, in cui detto cambiamento di pH è rilevato usato un indicatore di pH.
- 8. Metodo secondo la rivendicazione 7, in cui detto indicatore di pH è un colorante sensibile al pH o un indicatore che cambia il suo assorbimento/emissione mentre il pH cambia. 9. Metodo secondo la rivendicazione 7 o 8, comprendente inoltre un passaggio di irradiazione di detto volume incubato con un laser che emette lunghezze d’onde nel visibile, detto cambiamento essendo funzione di un segnale emesso di detto volume di irradiazione.
- 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui detto passaggio di incubazione è effettuato ad una temperature da 4°C e 37°C e per un periodo di incubazione di almeno un minuto.
- 10. Apparato per rivelare le cellule tumorali circolanti in un fluido corporeo comprende invece: -mezzi per incapsulare una cellula in un volume di circa da 10 pL a 10 nL di detto fluido -mezzi per rivelare un cambiamento nel pH e/o in una concentrazione di almeno una molecola scelta tra acido lattico, ioni lattato all’interno di detto volume incubato.
- 11. Apparato secondo la rivendicazione 10, in cui detti mezzi per isolare è un dispositivo microfluidico basato su gocce.
- 12. Apparato secondo la rivendicazione 11, in cui detto dispositivo comprende gocce acquose in una emulsione A/O.
- 13. Apparato secondo la rivendicazione 12, in cui la componente oleosa di detta emulsione è un olio di fluoro, preferibilmente con l’aggiunta di un tensioattivo.
- 14. Apparato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni, in cui detti mezzi di rivelazione comprendono un indicatore di pH è un colorante sensibile al pH o un indicatore che cambia il suo assorbimento/emissione mentre il pH cambia.
- 15. Apparato secondo la rivendicazione 14, comprendente inoltre un laser capace di emettere lunghezze d’onda nell’intervallo delle lunghezze di eccitazione del fluoro cromo.
- 16. Apparato secondo la rivendicazione 14 o 15, comprendente inoltre un rivelatore come un fotomoltiplicatore.
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