JP2017502312A - 循環腫瘍細胞(ctc)の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
今日では、CTCを検出し、数えることができれば、医療分野において重要な情報をもたらし得ることは、広く認められている。
特に、この情報は、多くの形態の癌の診断、治療およびモニタリングの体系的方法を定義するために使用することができる。
よって、本発明により解決される技術的課題は、上記の欠点を克服することができる代替的アプローチを使用することによって、体液中のCTCを測定し、単離することができる方法を提供することである。
細胞外環境のこの変化は、検出することはできないが、発明者らは、腫瘍細胞が、非常に小さな分量中に隔離される場合、この分量中で化学組成物の変化および腫瘍細胞の異なる生化学の結果を、有意に検出できることを見出した。
より具体的には、体液中の循環腫瘍細胞(CTC)の測定方法は、
約10pL〜10nLの量の該体液中に細胞を封入するステップ;
この量の体液を、4℃〜37℃の温度で、少なくとも1分間、インキュベートするステップ;
該インキュベートされたこの量の体液内でのpHの変化および/または、乳酸、乳酸塩イオン、プロトンから選択される少なくとも1つの分子の濃度の変化を測定するステップを含み、
該インキュベーションステップ前に同じ量の体液について測定したpHおよび/または濃度に対する、該pHの低下および/または該少なくとも1つの分子の濃度の増加は、該体液中の循環腫瘍細胞の存在を示す。
本発明は、体液中の循環腫瘍細胞(CTC)を測定する方法および装置に関する。
既に上記したように、体液中の循環腫瘍細胞の測定方法は、
約10pL〜10nLの量の該体液に細胞を封入するステップ;
該隔離された量の体液を、4℃〜37℃の温度で少なくとも1分間インキュベートするステップ;
該インキュベートされた量の体液内でのpHの変化および/または、乳酸、乳酸塩イオンおよびプロトンから選択される少なくとも1つの分子の濃度の変化を測定するステップを含み、
該インキュベーションステップ前に同じ量の体液について測定したpHおよび/または濃度に対する、該pHの低下および/または該少なくとも1つの分子の濃度の増加は、該体液中の循環腫瘍細胞の存在を示す。
本発明の好ましい実施形態において、該隔離された量の体液は、液滴ベースのマイクロ流体装置内での液滴の形態である。本明細書中において、表現「隔離された量の体液(isolated volume)」および「封入された量の体液(encapsulated volume)」は相互に交換可能である。
インキュベーションステップは、チップ上またはチップなしのいずれかでも実施できる。
pH指示薬は、pH感受性色素またはpHが変化するとその吸収/発光スペクトルを変化させる指標物質であり得る。これらの指示薬の例は、pHrodo(登録商標)グリーン(Life Technologies)(これは酸性pHで緑の蛍光を発する)、SNARF(登録商標)−4F 5―(および−6)カルボン酸(Life Technologies)(これは、580nmおよび640nmの蛍光の比が酸性pHで増加する)、およびpH感受性無機塩(これらは凝集して微結晶を形成する)である。
本明細書中では循環腫瘍細胞(CTC)を測定するための装置も開示される。
特に、体液中の循環腫瘍細胞を検出する装置は、
約10pL〜10nLの量の液で細胞を封入する手段;および
該インキュベートされた当該量の液内でのpHの変化および/または、乳酸、乳酸塩イオン、プロトンから選択される少なくとも1つの分子の濃度の変化を検出する手段を備える。
本発明の1つの実施形態において、当該量の液を隔離するための前記手段は、液滴ベースのマイクロ流体装置である。
液滴内でのpH値の変化の測定はまた、感知装置、例えば、蛍光センシング装置を含むマイクロ流体装置におけるチャネルに液滴を通すことによって実施することもできる。
1.材料
PhRodo Green(Invitrogen Inc.)、pH感受性色素、酸性pHでの蛍光グリーン
フルオロ乳酸検出キット(Cell Technology, Inc.)
D−グルコース(Sigma−Aldrich)
HFE−7500(3M Inc)
FC−40(3M)、フッ素化オイル
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)緩衝液
DI水中の0.9% NaCI 溶液
PDMS(ポリジメチルシリコーン)キット(Dow Corning)
SNARF−5Fまたは4F(Invitrogen)
油相:HFE−7500(ハイドロフルオロエーテル溶媒)における2%(w/w)のSS01
色素ストック:DI(脱イオン)水中の1mg/mlのpHrodoグリーン(Invitrogen Inc.);
色素ストック:2mMのSNARF−5Fまたは4F;
グルコースストック:DI水中の0.5Mグルコース;
pHrodoグリーンのためのインキュベーション緩衝液:PBSおよび0.9%NaClを体積比で1:3および1:5(緩衝性イオン(HPO4 2−およびH2PO4)の約3および2mMの濃度)で混合した。50μLのグルコースストックおよび20μLの色素ストック溶液を得られた緩衝溶液の各々1mLに添加した(最終濃度25mMのグルコースおよび20μg/mlのpHrodoグリーン);
SNARF−5Fまたは4Fのためのインキュベーション緩衝液:HBSS、10mMのグルコース、Joklikの改変EMEM。
A549細胞(ヒト肺がん、Hubrecht lab)を10分、+10%ウシ胎児血清でDMEM(Dulbeccoの改変イーグル培地、培地)中で培養し、0.25%トリプシン−EDTAを使用して分離し、インキュベーション緩衝液中に再懸濁した。
末梢血単核細胞(PBMC)をFicoll(登録商標)の密度勾配分離によって単離した。抗凝固剤を含む全血からバッフィーコートを採取し、約4.5倍に希釈する。Ficollを血液の下に添加し、細胞を室温で25分間、800gで遠沈する。中間相を除去し、2回洗浄した(650gで10分、および550gで5分)。最後に、細胞を無血清RPMI(Roswell Park Memorial Institute培地)中に再懸濁する。
フォトリソグラフィーは、PDMSの複製のためのマスターを製造するために使用された。SU8−2025の25μm厚さの層は、シリコン・ウエハー上で回転され、焼かれ、透明性マスクを通して曝露され、再び焼かれ、現像された。製造者が提案する処理条件は、全体のプロセスのために使用された。
複製をマスターから剥離し、容器は鈍い皮下注射針を使用して穴をあけた。PDMSの複製を石鹸水とエタノールで洗浄し、窒素を吹付け乾燥した。清潔なガラススライドおよび清潔なPDMSの複製を酸素プラズマで処理し、結合した。装置をFC−40中で1%の(トリデカフルオロ−1,1,2,2−テトラヒドロオクチル)−1−トリクロロシランでシラン化し、マイクロ流体チャネルに(マイクロ流体ネットワーク全体を完全に湿らせるのに十分なように)導入され、次にその装置を95℃で少なくとも30分間保持した。
静止している液滴の観察:オリンパスIX81倒立落射蛍光顕微鏡を蛍光測定のために使用した。顕微鏡は、xCite 120Qランプ(Lumen Dynamics Group Inc.)、フィルターセット、およびiXon 897カメラ(Andor)が装備されていた。
流れる液滴の観察:図1に示されるように、オリンパスIX71倒立顕微鏡が流れる液滴の1つ1つを分析するために使用された。レーザー(Cube、Coherent Inc.)ビームが拡大され(約10倍)、検出チャネルの真ん中に焦点が絞られた。励起された液滴の蛍光シグナルは、PMT検出器(H8249、Hamamatsu)によって検出された。
pH値が癌性の細胞および白血球細胞について別々に評価された。1つの実験において、インキュベーション緩衝液中の30〜50μLの細胞懸濁液は、T結合マイクロ流体装置で乳化された(高さ:25μm;連続相チャネルおよび分散相チャネルの幅は、20μmであった)。分散相の流速は120μL/時間であった;連続相の流速は、600μL/時間であった。懸濁液はプラスチックバイアルに回収され、その後1時間、37℃でインキュベートした。観察のために、液滴は、a)顕微鏡スライド上に置かれ、またはb)マイクロ流体装置中に注入された。検出をPhrodoGreenまたはSNARF−5Fまたは4Fによって実施した。最初、pH低い間は、蛍光が増加し、pHが変化すると、SNARFは吸収スペクトルを変化させる。より具体的には、pHが低下していくと、580nmで蛍光が増加し、640nmで蛍光が低下する。したがって、580/630の比が高くなるほど、pHが低い。蛍光は、倒立落射蛍光顕微鏡を使用して検出された。
結果を図5および6、ならびに以下の表1に示す。
特に、上記で既に指摘したように、580/630比が高くなるほど、pHが低くなる。白血球細胞がpH7.0以下とならないのに対し、癌細胞は、7.4〜6.4の範囲である。
乳酸分泌は、赤血球溶解液からの癌細胞(A549)および白血球細胞の混合懸濁液を使用して評価された。3チャネル構造のマイクロ流体回路を使用した:1つのチャネルは、細胞懸濁液をもたらし、1つは乳酸塩アッセイのための酵素をもたらし、1つは油相をもたらす。乳化ステップは、細胞代謝を停止して癌細胞による全溶液の乳酸汚染を回避するため、4℃で実施された。封入前の非特異的な活性化を避けるために、マイクロ流体装置を用いることで、マイクロ液滴への封入の後でのみ、乳酸アッセイの酵素に細胞をさらすことができた。写真を、乳化の15分後に室温で撮影した。
細胞を含む液滴でのpH変化による蛍光を図2に示す。A549腫瘍細胞を含む液滴は、空の液滴から区別される。別の実験において、PBMCをグルコースの存在下、インキュベートした。A549とPBMCの比較を図3に示す:空の液滴および細胞含有液滴は、人により蛍光顕微鏡写真から選択され、空の液滴の測定は、両方の実験の比較のために含められた。両方の細胞型は、pHの減少(蛍光強度の増加)を示すが、これは、A549腫瘍細胞の場合、非常により顕著である。
乳酸アッセイの場合、類似の結果を図4で見ることができる。
Claims (10)
- 体液中の循環腫瘍細胞を測定する方法であって、
約10pL〜10nLの量の該体液に細胞を封入するステップ;
該量の体液を、4℃〜37℃の温度で少なくとも1分間インキュベートするステップ;
該インキュベートされた該量の体液内でのpHの変化および/または、乳酸、乳酸塩イオンおよびプロトンから選択される少なくとも1つの分子の濃度の変化を測定するステップを含み、
該イキュベーションステップ前に同じ量の体液について測定したpHおよび/または濃度に対する、該pHの低下、および/または該少なくとも1つの分子の濃度の増加は、該体液中の循環腫瘍細胞の存在を示す、測定方法。 - 前記量の体液は、液滴ベースのマイクロ流体装置内での液滴の形態である、請求項1に記載の方法。
- 前記液滴は、W/Oエマルション中の水性液滴である、請求項2に記載の方法。
- 前記エマルションの油成分は、フルオラス油であり、好ましくは界面活性剤が添加されている、請求項3に記載の方法。
- さらに、水または塩含有緩衝液で、前記量の体液を希釈するステップを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体液は、血液、血清、リンパ液、胸水、腹水、脳脊髄液を含む群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記pHの変化は、pH指示薬を使用して検出される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記pH指示薬は、pH感受性色素またはpHが変化するとその吸収/発光スペクトルが変化する指標物質である、請求項7に記載の方法。
- 可視波長を発光するレーザーによって、前記インキュベートされた前記量の体液を照射するステップをさらに含み;前記変化は、前記照射された前記量の体液の発光信号の関数である、請求項7または8に記載の方法。
- 前記インキュベーションステップは、4℃および37℃の温度で、少なくとも1分の培養時間で実施される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
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