JP2017129425A - 抗癌剤の評価方法 - Google Patents
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Abstract
Description
抗癌剤を患者から得た生物試料に適用する抗癌剤適用工程と、
生物試料から腫瘍細胞を濃縮する濃縮工程と、
前記濃縮工程で得られた前記濃縮液に含まれる生体試料を基板上に展開する展開工程と、
前記基板上に展開した腫瘍細胞に存在する抗癌剤の作用部を標識して、光強度を検出する検出工程と、
検出された光強度に基づき、抗癌剤の効果を決定する評価工程、
を備えることを特徴とする抗癌剤の評価方法に関する。
抗癌剤を投与された患者から得られた生物試料から腫瘍細胞を濃縮する濃縮工程と、
前記濃縮工程で得られた前記濃縮液に含まれる生体試料を基板上に展開する展開工程と、
前記基板上に展開した腫瘍細胞に存在する抗癌剤の作用部を標識して、光強度を検出する検出工程と、
検出された光強度に基づき、抗癌剤の効果を決定する評価工程、
を備えることを特徴とする抗癌剤の評価方法に関する。
抗癌剤適用工程は、患者から得た生物試料に対し、抗癌剤を適用するin vitroの工程である。抗癌剤の適用の前に生物試料を、希釈、濃縮、培養などの前処理にかけていてもよい。本発明では、抗癌剤の適用工程は、抗癌剤の評価が可能となる範囲で任意の段階で行われてもよい。一例として、濃縮工程の前に抗癌剤適用工程が行われてもよいし、濃縮工程の後に抗癌剤適用工程が行われてもよく、また展開工程の後に抗癌剤適用工程が行われてもよい。適用される抗癌剤の濃度は、適用する抗癌剤の種類に応じて任意に設定することができる。例えば、通常の処方に従いその抗癌剤が患者に投与された場合に達成できる血中濃度と同程度の濃度、またはそれ以上若しくはそれ以下の濃度を設定することができるが、これらの濃度に限定されるものではない。
濃縮工程は、生物試料中から生きた腫瘍細胞の検出を容易にするために分離及び/又は濃縮をする工程である。濃縮方法は、生物試料中から生きた腫瘍細胞以外の成分を低減することで生きた腫瘍細胞をより選択的に回収できれば特に制限はない。例えば、腫瘍細胞と腫瘍細胞以外の成分とのサイズの違いを利用して分離濃縮するフィルター法、細胞表面の抗体発現プロファイルの違いを利用し、抗体磁性粒子で濃縮する磁気ビーズ法、細胞間の比重差を利用した比重法が例示できる。なかでも比重法は、短時間で選択的に生きた腫瘍細胞を濃縮できることから特に好ましい。
本発明おける比重分離では、腫瘍細胞と腫瘍細胞以外の成分が比重差によって分離できれば特に制限はない。密度勾配溶液は、それ自身で又は遠心分離によって密度勾配を形成する液体状の物質であり、目的とする細胞の密度(比重)を特定し、その分離に適当なものを選択して使用すれば良い。選択の指標としては、例えば栄養成分、pH、等張性等を例示できる。具体的にはショ糖、グリセロール、デキストラン、メトリザミド、イオディキサノール、ショ糖とエピクロロヒドリンの共重合体、ポリビニルピロリドンの被膜をもつコロイド状シリカ粒子、スクロースポリマー、ジアトリゾ酸、イオヘキソール、ニコデンツ等のイオン性又は非イオン性のものが例示できる。市販されている密度勾配溶液として、GEヘルスケア バイオサイエンス社製の商品名Ficoll、Ficoll−Paque又はPercoll、Axis−Shield PoC AS社製の商品名Lymphoprep、Polymorphprep又はOptiPrepが例示できる。
展開工程は、濃縮工程を経て得られた濃縮液を基板上に展開することにより行われる。濃縮液を展開することで、濃縮液に含まれる細胞を検出に適した間隔で基板上に分布させることができる。非凝集状態で展開させることが好ましく、展開前に濃縮液を十分に懸濁しておくことが好ましい。展開工程は、細胞を検出に適した間隔で基板上に分布させることができれば任意の手法を用いることができ、単に濃縮液を基板上に適用するのみであってもよいが、必要に応じてさらなる処理を行ってもよい。一例として、濃縮液を基板上に適用後に、振動や誘導泳動力をあたえることにより、細胞を展開することもできる。細胞を均一に展開するために、基板上に保持孔があけられていることが好ましく、各保持孔につき、概ね一個の細胞を配置することで、その後の検出工程にて標的細胞の検出が容易になる。所望される細胞の展開密度に応じて、濃縮液中の細胞数を計数し、適切な細胞数が展開されるように希釈されてもよく、また展開に供する濃縮液を計量して展開することもできる。
保持孔内へ細胞を捕捉する方法としては、誘電泳動力を利用する。この誘電泳動力により、生きた細胞を数秒程度の極めて短い時間で多数の保持孔に捕捉することができる。誘電泳動力を細胞に作用させるには、収容部及び保持孔を懸濁液で満たした状態で、保持孔の部分に電気力線が集中するような交流電界をかければよい。かかる交流電界を印加するための構成として、図2の構造体の他に図3に示すように、前記基板の前記保持孔側の表面に、互いに異なる保持孔に対応する位置にそれぞれ配置される一対の電極(櫛状電極18)を構成する電極16、17が設けられ、前記保持孔は、前記保持孔の上表面から前記基板上の櫛状電極まで延在する、という構成を採用することができる。いずれの構成の場合も、保持孔の底部に電極を露出させ、2つの電極の間に所定の波形を有する交流電圧を印加することで、誘電泳動力により懸濁液中の細胞を保持孔内へ捕捉することが可能である。また保持孔をアレイ状に配置することで、電極間に印加した電圧によって生じる電界がすべての保持孔にほぼ均等に生じることになり、すべての保持孔に対して同じように細胞を誘導し捕捉することができる。
検出工程は、基板上に展開された腫瘍細胞に存在する抗癌剤の作用部を標識して、光強度を検出する工程である。この検出は、腫瘍細胞に存在する作用部を、標識物質で標識し、標識に応じた光源を導入して、光強度を検出することができる。検出工程では、腫瘍細胞以外の細胞から、腫瘍細胞を識別するための検出を同時に行ってもよい。腫瘍細胞を識別するために、腫瘍細胞に特異的に発現する物質や非腫瘍細胞に特異的に発現する物質などの標識物質により標識して検出してもよいし、腫瘍細胞のサイズ、形状などの外観により識別を行うこともできる。
検出工程において、腫瘍細胞に存在する作用部の光強度を検出後に、検出された光強度に基づき、抗癌剤の効果を決定することができる。作用部に結合する標識物質は、抗癌剤の該作用部への結合性に応じて、作用部への結合できなくなり、標識物質からの光強度が変化するからである。例えば、抗癌剤が、腫瘍細胞表面に存在する作用部に作用(結合)することで、作用部がマスキングされると、標識物質が作用部に結合できず光強度が低下する。また、抗癌剤が、腫瘍細胞表面に存在する作用部に作用(結合)することで、特定物質が内在化(Internalization)し、増殖シグナルを抑制するような薬効を示す場合も、抗癌剤適用後に標識物質は作用部に作用できず、光強度は減少する。したがって、抗癌剤の適用後に、腫瘍細胞の特定物質に結合した標識物質からの光強度が減少していれば、抗癌剤が作用部に作用可能であり、それにより薬効が高いとと判断することができる。
血液試料は、インフォームドコンセントを得て取得した健常者血液3mlに約3000個のヒト乳癌細胞(SKBR3)を添加した懸濁液を、抗癌剤未適用試料として用いた。同様にして、健常者血液3mlに10μg/mLのトラスツマブ(ハーセプチン)で3時間処理した約3000個のヒト乳癌細胞(SKBR3)を混合させた懸濁液を、抗癌剤適用試料として用いた。
前記交流電圧を印加しながら、1個の保持孔に概ね1個の細胞が捕捉された収容部に0.01%ポリ−L−リジンを含む300mMマンニトール水溶液を導入し、3分静置後、前記交流電圧の印加を停止し、収容部の溶液を吸引除去した。続いて、収容部へ細胞膜透過試薬を導入し、10分静置することで細胞膜を透過させた。その後、収容部の溶液を吸引除去し、PBSを導入し、収容部内に残留した細胞膜透過試薬を洗浄した。
一方で、抗癌剤適用試料では、図7Bに示すようにCKは陽性であるが、HER2標識による光強度が著しく低下した細胞が検出された。
実施例1と同様にして、健常者血液3mlに約1000個のヒト大腸癌細胞(WiDr)を混合させた試料を、抗癌剤未適用試料とし、健常者血液3mlに、20μg/mLのパニツムマブ(ベクティビックス)で2時間処理した約1000個のヒト大腸癌細胞(WiDr)を混合させた試料を、抗癌剤適用試料として用いた。
2 筒状部材(上側)
3 筒状部材(下側)
4 キャップ
5 底部
6 連通開口端(分離部)
7 保持孔(貫通孔)
8 構造体
9 基板
10 上蓋基板
11 絶縁膜
12 遮光膜
13 収容部
14 導入口
15 排出口
16 電極(+)
17 電極(−)
18 櫛状電極
19 交流電源
20 光
21 検出部
22 導電線
23 細胞
24 誘電泳動力
25 密度勾配溶液
26 混合液
27 界面
Claims (9)
- 患者に対する抗癌剤の薬効を評価する方法であって、以下の:
患者から取得された生物試料に抗癌剤を適用する抗癌剤適用工程と、
前記生物試料から腫瘍細胞を濃縮する濃縮工程と、
前記濃縮工程で得られた前記濃縮液に含まれる細胞を基板上に展開する展開工程と、
前記基板上に展開した腫瘍細胞に存在する抗癌剤の作用部を標識して、光強度を検出する検出工程と、
検出された光強度に基づき、抗癌剤の薬効を決定する評価工程と、
を含む、前記方法。 - 患者に対する抗癌剤の薬効を評価する方法であって、以下の:
抗癌剤を投与された患者から得られた生物試料から腫瘍細胞を濃縮する濃縮工程と、
前記濃縮工程で得られた前記濃縮液に含まれる生体試料を基板上に展開する展開工程と、
前記基板上に展開した腫瘍細胞に存在する抗癌剤の作用部を標識して、光強度を検出する検出工程と、
検出された光強度に基づき、抗癌剤の効果を決定する評価工程、
を含む、前記方法。 - 前記濃縮工程が、比重法であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の抗癌剤の評価方法。
- 前記濃縮工程が、一端は閉塞して底部を形成し、他端は開口した筒状の構造体と、開口を密閉するキャップからなり、前記構造体は2以上の筒状部材より構成され、分離部にて分離可能である分離構造体を用いることを特徴とする、請求項3に記載の抗癌剤の評価方法。
- 前記抗癌剤が分子標的薬であることを特徴とする、請求項1〜4いずれか一項に記載の抗癌剤の評価方法。
- 前記腫瘍細胞が、血中循環腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項1〜5いずれか一項に記載の抗癌剤の評価方法。
- 前記作用部が、HER2、EGFRから構成される群から選択される、請求項1〜6いずれか一項に記載の抗癌剤の評価方法。
- 前記作用部がHER2である場合に、抗癌剤が、ラパチニブ、トラスツズマブ、及びペルツズマブからなる群から選ばれる1以上の薬剤である、請求項7に記載の評価方法。
- 前記作用部がEGFRである場合に、抗癌剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、パニツムマブからなる群から選ばれる1以上の薬剤である、請求項7に記載の評価方法。
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