JP2015006169A - 分離構造体及び分離方法 - Google Patents
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Abstract
Description
さらに具体的には、血液をFicoll−Paque(密度約1.077g/mL)で分離する例において、不要な細胞(赤血球)は下層に位置し、目的の細胞(がん細胞、白血球など) は上層に位置することになる。つまり、従来の血液細胞を濃縮/分離する方法として採用されている分離構造体は、1つの筒状部材で構成され、仕切り構造などで上層と下層を分ける分離構造体の発想は、基本的に上層に位置する細胞の回収に限定される。
図1に示した態様の分離構造体を使用して、がん細胞の分離を行った。分離構造体は、
詳細には、筒状部材2は内径Φ16mm、縦80mm、容量13mLの円筒状のポリプロ
ピレン製部材である。部材の内面にはウシ血清アルブミン(BSA)をコーティングし、
親水化することで細胞等の非特異吸着を防止してある。また筒状部材2の先細り形状部
分7の傾斜角度は30°であり、筒状部材3との連通開口はΦ2mmである。筒状部材3
は、内径Φ10mm、縦43mm、容量2mLのポリプロピレン製部材である。
を確認した。図5の装置は、電源34、電極基板35及び36を有し、基板間に電圧を印
加することにより細胞37に誘電泳動力38を作用させ、保持孔39内に導入し捕捉する
ものである(特許第4910716号公報参照)。分離された細胞懸濁液を、この装置に供して保持孔に捕捉した細胞を蛍光顕微鏡40で観察した。その結果、保持孔には約400万個の正常白血球とともに、約27個のがん細胞が捕捉され(回収率約90%)、本発明の分離構造体を用いることで、構造体を構成する筒状部材の分離、開口を密閉するキャップの取り外しという簡単な操作により、高い回収率をもって目的とする細胞を分離できる。
実施例1と同様に密度勾配溶液の上へ健常者血液3mLに約30個のがん細胞を混合させた試料と3mLの生理食塩水と75μLの結合剤(商標RosetteSep、StemCell Technologies Inc)の混合液を重層し、遠心分離、回収操作を実施した。
実施例3と同様にして、健常者血液に約30個のヒト乳がん細胞(SKBR3)を混合させた試料、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を実施した。なお、密度差分離における遠心条件は1100〜3000×g、3〜10分間、室温にて実施した。遠心分離後、キャップを取り外すことなく分離構造体を構成する筒状部材2及び3を分離部で分離した後、キャップをはずして密閉を開放することで、上側の筒状部材2の連通開口端(分離部)6より密度勾配溶液の一部とその上に維持された細胞を流出させ、下方に設置したチューブ50で回収するとともに、上側筒状部材の内壁を洗浄し、壁に付着した細胞も同時に回収した。
実施例3と同様にして、健常者血液に約30個のヒト乳がん細胞(SKBR3)を混合させた試料、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を実施した。なお、密度差分離における遠心条件は2000×g、5分間、室温にて実施した。遠心分離後、キャップを取り外すことなく分離構造体を構成する筒状部材2及び3を分離部で分離した後、キャップをはずして密閉を開放することで、上側の筒状部材2の連通開口端(分離部)6より密度勾配溶液の一部とその上に維持された細胞を流出させ、下方に設置したチューブ50で回収するとともに、上側筒状部材の内壁を洗浄し、壁に付着した細胞も同時に回収した。
実施例3と同様にして、健常者血液に約30個のヒト乳がん細胞(SKBR3)を混合させた試料、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を実施した。なお、密度差分離における遠心は2000×g、5分間、回収における遠心は300×g、10分間室温にて実施した。実施例6で使用した分離構造体は、筒状部材2は内径Φ18mm、縦70mm、容量15mLの円筒状のポリプロピレン製部材である。部材の内面にはウシ血清アルブミン(BSA)をコーティングし、親水化することで細胞等の非特異吸着を防止してある。また筒状部材2の先細り形状部分7の傾斜角度は30、50、70°であり、筒状部材3との連通開口はΦ2mmである。筒状部材3は、内径Φ10mm、縦54mm、容量2mLのポリプロピレン製部材である。
実施例3と同様にして、健常者血液に約30個のヒト乳がん細胞(SKBR3)を混合させた試料、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を実施した。なお、密度差分離における遠心は2000×g、5分間、回収における遠心は300×g、10分間室温にて実施した。実施例7では、分離構造体1の筒状部材3に、密度が1.077、1.082、1.084、1,091g/mLの密度勾配溶液を2mL注入した。
実施例3と同様にして、健常者血液に約30個のヒト乳がん細胞(SKBR3)を混合させた試料、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を実施した。実施例9で使用した分離構造体は、筒状部材2は内径Φ18mm、縦70mm、容量15mLの円筒状のポリプロピレン製部材である。部材の内面にはウシ血清アルブミン(BSA)をコーティングし、親水化することで細胞等の非特異吸着を防止してある。また筒状部材2の先細り形状の部分7の傾斜角度は70°であり、筒状部材3との連通開口はΦ2、4、6mmである。筒状部材3は、内径Φ10mm、縦54mm、容量2mLのポリプロピレン製部材である。
図11に示した態様の分離構造体を使用して、がん細胞の分離を行った。分離構造体は、詳細には、キャップ49と筒状部材41、42、43から構成される。筒状部材41は内径Φ20mm、縦60mm、容量11mLの円筒状のポリプロピレン製部材である。また筒状部材41の先細り形状の部分44の傾斜角度は70°であり、筒状部材42との連通開口はΦ2mmである。筒状部材42は内径Φ14mm、縦30mm、容量3mLの円筒状のポリプロピレン製部材である。筒状部材42の先細り形状の部分45の傾斜角度は30°であり、筒状部材43との連通開口はΦ2mmである。筒状部材43は、内径Φ14mm、縦41mm、容量2.5mLのポリプロピレン製部材である。なお部材の内面にはウシ血清アルブミン(BSA)をコーティングし、親水化することで細胞等の非特異吸着を防止してある。
試料として、健常者血液に約30個のがん細胞を混合させた3mLの懸濁液を用い、実施例1と同様に遠心分離操作を実施して細胞を密度勾配溶液と試料の界面に維持した。遠心分離操作の終了後、キャップを取り外すことなく分離構造体を構成する筒状部材を2及び3を分離部で分離した後、図4右に示したようにキャップをはずして密閉を開放することで、上側の筒状部材2の連通開口端(分離部)6より密度勾配溶液の一部とその上に維持された細胞を流出させ、下方に設置したチューブで回収するとともに、上側筒状部材の内壁を洗浄し、壁に付着した細胞も同時に回収した。
比較例1
市販の密度勾配遠心法による血液分離キット(Axis−Shield PoC AS社製、商品名Lymphoprep Tube、密度勾配溶液(Lymphoprep)の密度1.077g/mL)を使用して、実施例1で使用した試料からのヒト乳がん細胞(SKBR3)の分離を実施した。試料をキットに含まれる分離容器の密度勾配溶液の上に重層した後、1100×gで10分間室温にて遠心分離した。遠心分離後、密度勾配溶液と試料の界面(Lymphoprep液の頂部)に維持された細胞を、分離容器を転倒して流出させ、チューブ50に回収するとともに、容器内壁及び分離容器内のフィルターを洗浄し、それらに付着した細胞を同時に回収した。
1100×gでの遠心分離操作の後、密度勾配溶液と試料の界面(密度勾配溶液の頂部)に維持された細胞をピペットで吸引してチューブに回収した以外は実施例1と同様の操作を実施した。その結果、保持孔には約410万個の正常白血球が捕捉されたが、がん細胞は約21個(回収率約71%)にとどまり、遠心分離操作後にピペットによってがん細胞を吸引する操作により、がん細胞の回収率が低下した。この結果から、上側の筒状部材の連通開口より密度勾配溶液の一部とその上に維持された細胞を流出させる本発明によって、安定して高い回収率でがん細胞を回収できることが分かる。
2:筒状部材(上側)
3:筒状部材(下側)
4:キャップ
5:底部
6:連通開口端(分離部)
7:筒状部材の先細り形状部分
21:目的外の成分(細胞等)
22:目的外の成分に対して特異的に結合する物質
23:密度を調整するための物質
24:目的とする成分(細胞等)
31:密度勾配溶液(密度勾配溶液で満たした部分)
32:血液試料と生理食塩水の混合液(重層した混合液の部分)
33:密度勾配溶液と試料の界面
34:交流電源
35:上部電極基板
36:下部電極基板
37:細胞
38:誘電泳動力
39:保持孔
40:蛍光顕微鏡
41:筒状部材(上側)
42:筒状部材(中央)
43:筒状部材(下側)
44:先細り形状(上側の筒状部材)
45:先細り形状(中央の筒状部材)
46:密度勾配溶液(下側の筒状部材を満たした部分)
47:密度勾配溶液(中央の筒状部材を満たした部分)
48:混合液(試料、生理食塩水、結合剤)
49:キャップ
50:50mLチューブ
Claims (2)
- 一端は閉塞して底部を形成し、他端は開口した筒状の構造体と、開口を密閉するキャップからなり、前記構造体は2以上の筒状部材より構成され、分離部にて分離可能であることを特徴とする、分離構造体。
- 液体試料から目的とする成分を分離する方法であって、一端は閉塞して底部を形成し、他端は開口した筒状の構造体と、開口を密閉するキャップからなり、前記構造体は2以上の筒状部材より構成される分離構造体を使用して、密度勾配溶液を前記構造体底部から前記分離部近傍まで満たし、試料を重層して前記開口を密閉した状態で遠心分離する工程と、遠心分離後、開口部の密閉状態を維持したまま前記構造体を分離し、密閉を解いて目的とする細胞等を含む分画を回収する工程からなる、分離方法。
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