WO2014192919A1 - 分離構造体及び分離方法 - Google Patents

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WO2014192919A1
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separation
cylindrical member
density gradient
density
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篤史 森本
聡文 最上
和樹 飯嶋
泰之 秋山
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東ソー株式会社
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    • G01N2001/4083—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids sedimentation

Definitions

  • the present invention relates to a separation structure that separates a target component from a liquid sample using centrifugal force and a separation method using the separation structure, and particularly preferably a body fluid, a dispersed tissue specimen, or a cultured cell.
  • the present invention relates to a separation structure and a separation method for separating and concentrating cells from a sample containing such cells.
  • a density gradient centrifugation method for separating cells based on their density is known (Patent Document 1).
  • a solution containing cells such as blood is layered on a solution in which a density gradient is formed (hereinafter referred to as “density gradient solution”) and centrifuged, and a layer containing the target cells is collected.
  • density gradient solution a solution in which a density gradient is formed
  • the density gradient solution is a commercially available product (for example, Ficoll-Paque (manufactured by GE Healthcare Bioscience)), a density of about 1.077 g / mL, and a synthetic product having a molecular weight of 400,000 obtained by copolymerizing sucrose and epichlorohydrin.
  • Ficoll has an agglutinating effect on its own, and it can agglomerate red blood cells and granulocytes contained in blood to polymerize and precipitate, making it possible to more effectively separate cells from blood. Can be implemented automatically.
  • a device when performing decantation after centrifugation, a device has been devised to recover the upper liquid without mixing the liquid at the bottom.
  • a centrifuge container a centrifuge tube (Patent Document 2) having a partition structure with a shrink member inside, or a container having a partition by a porous partition plate such as a partition plate, filter, or sieve (Patent Document 3).
  • Patent Document 2 a centrifuge tube having a partition structure with a shrink member inside
  • a container having a partition by a porous partition plate such as a partition plate, filter, or sieve
  • Patent Document 4 Although not used for density gradient centrifugation, there is a report on a filtration device (Patent Document 4) including a laminate of upper and lower chambers and a filter membrane.
  • a separation container having a size and shape that matches the rotor shape of the centrifugal separation means to be used is used, but the separation container is usually closed at one end to form the bottom, and the other end is sealed at the opening. It is generally cylindrical. For this reason, when recovering cells and the like that have moved in the density gradient solution according to the density after the centrifugation operation from the separation container, the pipette tip is inserted from the open end that has been unsealed, and the A thin layer needs to be recovered. However, this operation requires skill, and the recovery rate of the target cells is likely to fluctuate, and the tip of the pipette is inserted into the density gradient solution, so that cells other than the target cells etc. There was a problem that it might be collected.
  • the present invention provides a separation structure that can efficiently recover target cells regardless of the skill level of the operator and the cell density by separating the unnecessary components from the separated cells together with the structure.
  • the purpose is to provide.
  • an object of the present invention is to provide a separation structure that can be collected by a simple operation regardless of the skill level of the operator, regardless of the layer in which the target cell is located.
  • the present invention completed in view of the above object comprises a cylindrical structure having one end closed to form a bottom and the other end opened, and a cap that seals the opening.
  • the structure has two or more cylinders. It is a separation structure characterized in that it is composed of a member and can be separated at the separation portion.
  • the present invention also relates to a separation method for separating a target component from a liquid sample, particularly a method for isolating a target type of cell from two or more types of cells having different densities, wherein the density gradient solution has the structure described above.
  • This is a cell separation method comprising a step of collecting a fraction containing cells and the like.
  • the separation structure and the separation method of the present invention after the centrifugation operation, when collecting the fraction containing the target cells and the like, the separation structure is separated by separating unnecessary fractions together with the separation structure. Only a very simple operation of opening the seal of the tubular member is performed. Therefore, compared to the method of inserting a pipette tip from the open end of the separation container and collecting a very thin fraction on the density gradient solution, skill is unnecessary, and the target cells can be stably recovered. It is possible to produce an effect that the tip of the pipette is inserted into the density gradient solution, and there is little possibility that cells other than the target cells are erroneously collected. Such an effect makes it possible to separate cells that do not depend on the skill of the operator, and it is also possible to automate the separation operation of target cells and the like by machine operation.
  • the separation structure and the separation method of the present invention by adopting a structure comprising two or more separable members, unnecessary components are separated from the structure, and the cell is separated for each target cell type (density). Can be efficiently recovered.
  • the target cells after the centrifugation operation, the target cells can be recovered by a simple operation of detaching this structure regardless of the skill level of the operator regardless of the level of skill of the operator, regardless of the level of the operator's skill. Can do.
  • the shape of the part which reaches the communicating opening end (separation part) of an upper cylindrical member into a taper shape toward a lower cylindrical member depending on the shape, it becomes a lower cylindrical member.
  • the moved component can be prevented from flowing back to the upper cylindrical member, the target cell separation efficiency (recovery rate) can be remarkably improved, and the cylindrical shape is maintained while maintaining the sealed state by the cap.
  • the members are separated, liquid outflow from the opening of the cylindrical member can be prevented.
  • FIG. 1 is a diagram showing one embodiment of the present invention.
  • the separation structure 1 of this example is composed of two cylindrical members 2 and 3.
  • a cylindrical member (upper side) 2 (sometimes referred to as “cylindrical member 2”) constituting the upper portion of the separation structure has an opening (in this figure, the opening is sealed by a sealing cap 4).
  • the cap 4 is only required to be detachably attached to the separation structure 1, and in addition to the cap type (type to be inserted into the cylindrical member 2) shown in FIG.
  • the cylindrical member (lower side) 3 (which may be referred to as “cylindrical member 3”) is closed at one end to form the bottom portion 5.
  • the cylindrical members 2 and 3 are each provided with a communication opening end (separation part) at the opposite end of the opening or the bottom, and when the both members are connected, the internal spaces of both the cylindrical members communicate with each other.
  • One isolation structure is formed. This connection is not limited as long as each cylindrical member can be separated.
  • one (cylindrical member 2) is connected as shown in FIG.
  • a screw or the like is provided, or a joint member for fixing and holding both is attached.
  • the communication opening end (separation part) 6 itself is large enough to pass a high-density component in the sample layered on the density gradient solution, and separates the cylindrical member while maintaining the sealed state by the cap 4. It is sufficient that the liquid held in the cylindrical member 2 does not flow out when it is done.
  • the inner diameter ( ⁇ ) of the communication opening is preferably 1 to 6 mm, and more preferably 2 to 4 mm. Note that a filter or a mesh-shaped filter medium in which a vertical through hole is formed can be installed in either of the communicating openings of the tubular member 2 or the tubular member 3.
  • the shape of the part which reaches the communicating opening end (separation part) 6 of the cylindrical member 2 is tapered toward the cylindrical member 3 (the tapered part 7 of the cylindrical member 2).
  • the component moved to the lower cylindrical member 3 flows back to the upper cylindrical member 2 as shown in Example 3 described later. It is possible to prevent this, and the same effect as providing a filter can be obtained.
  • the separation efficiency (recovery rate) of the target component can be significantly improved according to the inclination angle of the tapered portion 7. Furthermore, when the tubular member is separated while maintaining the sealed state by the cap, liquid outflow from the opening of the tubular member 2 can be prevented.
  • the shape of the portion of the tubular member 2 reaching the communication opening end (separation portion) 6 is preferably a tapered shape.
  • the inclination angle is preferably 5 to 70 °, more preferably 10 to 50 °, and more preferably 20 to 40 °. Is particularly preferred.
  • the inclination angle is preferably 20 ° or more, more preferably 40 ° or more, and particularly preferably 60 ° or more. .
  • the cylindrical member of this example is not particularly limited in terms of dimensions and shape, but all are generally cylindrical.
  • the shape may be a polygonal shape as long as it matches the rotor of the centrifuge used, but a cylinder is particularly preferred from the viewpoint of manufacturing, storage, and the like.
  • the cylindrical members 2, 3 and the cap 4 can be made of a resin such as acrylic, epoxy, polystyrene, synthetic quartz (SiO2) mainly composed of silicon oxide, ceramics, or a metal-based material. From the viewpoint of economic efficiency, and particularly from the problem of discardability after using a biological sample such as blood, a thermoplastic resin such as polypropylene or polystyrene resin is preferred. Further, the member is preferably non-shrinkable. Furthermore, the inner surface of the separation structure (surface on which the sample can come into contact) is hydrophilic from the viewpoint of preventing non-specific adsorption of the target cells or the like, or can be hydrophilized by a separate treatment.
  • a resin such as acrylic, epoxy, polystyrene, synthetic quartz (SiO2) mainly composed of silicon oxide, ceramics, or a metal-based material.
  • a thermoplastic resin such as polypropylene or polystyrene resin
  • the member is preferably non-shrinkable.
  • the treatment for hydrophilization is not particularly limited, and if it is a resin, for example, a method of activating the surface energy of the resin surface by corona discharge treatment to generate a polar group such as a carbonyl group and hydrophilizing, or, for example, An example is a method of improving the hydrophilicity of the surface by irradiating the surface with electrons, ions, or radicals by oxygen plasma treatment and introducing -COOH or -CO.
  • a method of applying a hydrophilic polymer such as polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, poly (hydroxyalkyl) methacrylate, polyacrylamide, or MPC polymer to make the surface hydrophilic can be exemplified.
  • the cylindrical members 2 and 3 and the cap 4 can be integrally formed.
  • the present invention is a sample derived from organs or tissues such as biological samples such as urine, blood, plasma, serum, saliva, semen, feces, sputum, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, cell aggregates, tumors, lymph nodes or arteries. It can be used to separate cells contained in a cell culture medium or the like.
  • the separation method of the present invention may be carried out after preparing a cell suspension according to a normal treatment.
  • the intended cell separation is synonymous with the concentration of the cells.
  • a density gradient solution is a liquid substance that forms a density gradient by itself or by centrifugation. If a density (specific gravity) of a target cell is specified and an appropriate one is selected and used for the separation, Good.
  • selection indicators include nutrient components, pH, and isotonicity. Specifically, sucrose, glycerol, dextran, metrizamide, iodixanol, copolymer of sucrose and epichlorohydrin, colloidal silica particles with polyvinylpyrrolidone coating, sucrose polymer, diatrizoic acid, iohexol, nicodents Examples thereof include ionic or nonionic ones. Examples of commercially available density gradient solutions include GE Healthcare Biosciences trade names Ficoll, Ficoll-Paque or Percoll, Axis-Shield PoC AS trade names Lymphoprep, Polymorphprep, or OptiPrep.
  • the density gradient solution is injected from the bottom portion (bottom portion 5 of the cylindrical member 3) to the vicinity of the communication opening end (separation portion) 6 in the separation structure 1. More specifically, when the separation structure 1 is allowed to stand, the liquid level height of the density gradient solution is higher than the communication port end of the upper cylindrical member 2 (on the cylindrical member 2 side). To do. That is, when a non-target component (cell or the like) in the sample solution is separated into the lower cylindrical member (tubular member 3), the target component (cell) maintained on the density gradient solution is cylindrical. Injection is performed so as to be as high as possible, preferably about 1 mm, while being maintained in the member 2.
  • the sample solution is layered on the density gradient solution, the opening is sealed with the cap 4, and the centrifugation operation is performed. Centrifugation is generally performed at a low speed of about 1000 to 2000 ⁇ g. However, considering the density of the target cells and the density gradient solution to be used, the target cells are placed on the density gradient solution. Select the conditions to be maintained. For example, if the target cell is a tumor cell and centrifugation is performed as described above, the density of the density gradient solution is in the range of 1.060 to 1.095 g / mL depending on the type of tumor cell, physiological penetration. Examples include adjusting the pressure to a range of 200 to 450 mOsm / kg and adjusting the pH to a range of 6.8 to 7.8.
  • the component having a density larger than the density of the density gradient solution is moved into the cylindrical member 3 through the gradient layer of the density gradient solution by the centrifugation operation.
  • target cells having a density smaller than that of the density gradient solution are maintained on the density gradient solution in the cylindrical member 2. Therefore, if the connected cylindrical members are maintained in the state shown in FIG. 1 while maintaining the sealing of the opening, the upper cylindrical member (cylindrical member 2) contains the target cells.
  • the image can be collected. This fraction can be easily collected without requiring any special skill, for example, by dropping the cap 4 by releasing the cap 4 and dropping it downward. On the other hand, the fraction moved into the cylindrical member 3 can be discarded together with the cylindrical member, for example.
  • separation structure of this invention can also be comprised with a 3 or more cylindrical member.
  • one of the cylindrical members is provided with a hermetically sealed opening, and one cylindrical member different from this forms a closed bottom, and other than these, communication openings are provided at both ends. It becomes the cylindrical member which has. If such a cylindrical member is used and the place of separation is changed according to the density of the target cell or the density gradient solution, the cell can be separated for each type (density) of the target cell. Is possible.
  • a separation structure that specifically adopts a configuration including three separable members will be described with reference to FIG. 6, but the present invention is not limited to a configuration including three separable members.
  • the present invention is not limited to a configuration including three separable members.
  • As an effect of using a separation structure that employs a structure consisting of three separable members it is possible to separate the target components (cells, etc.) for each type (density) of the target components (cells, etc.) The density distribution can be confirmed.
  • FIG. 6 first, a sample solution containing a target component (cell or the like) whose density is to be known is injected into a cylindrical member (upper side) 41, and the cylindrical member (center) 42 and the cylinder that are other cylindrical members are injected. After the dense member (lower side) 43 is filled with a density gradient solution having a high density (for example, about 1.086 g / mL), it is centrifuged. The maximum density of the target component (cell or the like) can be found by finding a condition that the target component (cell or the like) can be recovered only by the cylindrical member (upper side) 41 by the above operation.
  • a density gradient solution having a high density (for example, about 1.086 g / mL)
  • the cylindrical member (center) 42 is filled with a density gradient solution having a low density (for example, about 1.030 g / mL), and the cylindrical member (lower side) 43 is filled with a target component (A density gradient solution corresponding to a maximum density condition (for example, about 1.086 g / mL) is filled and centrifuged.
  • a density gradient solution corresponding to a maximum density condition for example, about 1.086 g / mL
  • the minimum density of the target component (cells, etc.) can be determined by finding a condition that allows the target component (cells, etc.) to be recovered only in the cylindrical member 42 (center). In this way, it is possible not only to simply separate the target components (cells etc.) and density gradient solution but also to know the properties (density) of the target components (cells etc.).
  • a substance 22 that specifically binds to a non-target component (such as a cell) 21 may be described as “non-target component 21”
  • a substance for adjusting the density 23 the apparent density (specific gravity) of the non-target component 21 is increased by the combination of the two, and the target component (cell etc.) 24 (“target component 24” ”)
  • target component 24 the target component
  • the apparent density can be reduced by combining a substance that specifically binds with a substance having a relatively low density such as porous silica particles.
  • a substance used for the purpose of adjusting the density for example, polyvinyl compounds such as polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, polyacrylonitrile, polyacrylate, polymethacrylate, and polycarbonate.
  • Representative organic polymers, copolymers such as polystyrene latex, nylon, polyterephthalate, inorganic materials such as glass, silica, zirconia, and biopolymers such as cellulose, dextran, agarose, sepharose, etc.
  • the substance that specifically binds include biopolymers such as antibodies, antigens, peptides, polypeptides, growth factors, cytokines, and lectins.
  • the target component (cell or the like) can be more selectively recovered by further removing the non-target component (cell or the like).
  • the non-target component can be passed through the filter, and the target component can be captured by the filter and concentrated.
  • a target component may be passed through a filter and a non-target component may be captured by the filter.
  • the through-hole formed in the filter can be appropriately adjusted depending on the intended use.
  • the opening has a circular shape, and the pore diameter is from 1 It is 20 ⁇ m, preferably 1 to 10 ⁇ m, particularly preferably 2 to 8 ⁇ m. If the pore size is smaller than 1 ⁇ m, the filter may be clogged, increasing the suction pressure near the filter and destroying the cells. On the other hand, when it becomes larger than 10 ⁇ m, small-diameter cancer cells may pass through the filter and be lost.
  • the pore diameter is from 1 It is 20 ⁇ m, preferably 1 to 10 ⁇ m, particularly preferably 2 to 8 ⁇ m.
  • the pore size is smaller than 1 ⁇ m, the filter may be clogged, increasing the suction pressure near the filter and destroying the cells.
  • it becomes larger than 10 ⁇ m small-diameter cancer cells may pass through the filter and be lost.
  • positioning of a through-hole In order to improve cell separation efficiency, providing many through-holes is preferable.
  • the distance between the through holes (the distance from the center of the opening of a certain through hole to the center point of the opening of another through hole) is equal.
  • the distance between the through holes can be appropriately determined in consideration of the hole diameter of the through hole, but it can be exemplified as 20 ⁇ m or more. More specifically, for example, when the hole diameter is 8 to 10 ⁇ m, the distance between the through holes is particularly preferably about 50 ⁇ m.
  • the filter having the through hole described above include a nickel substrate in which a through hole is formed using an electroforming technique, and a glass or quartz substrate in which a through hole is formed using a laser technique.
  • a through-hole as intended can be formed in a nickel substrate or the like.
  • the filter is preferably hydrophilic. This is because adsorption of components contained in the sample is prevented and clogging or the like hardly occurs due to such properties.
  • the filter may be made of a material that is inherently hydrophilic, or its surface may be hydrophilized by any treatment.
  • the treatment for hydrophilizing the surface such as corona discharge treatment, plasma treatment, hydrophilic polymer coating, and BSA (bovine serum albumin) described in the method for hydrophilizing the separation structure of the present invention. Examples include a method of hydrophilizing the surface by dipping in a protein solution such as OVA (egg white ovalbumin).
  • the target component is bound to the antibody magnetic particle by reacting the component collected after density gradient centrifugation with the antibody magnetic particle, and then the target component is obtained by magnetic force. What is necessary is just to capture an ingredient.
  • the non-target component may be removed by magnetic force.
  • the antibody magnetic particles used at that time are preferably formed of an appropriate material that is non-reactive with the target component. For example, when collecting cancer cells from blood, leukocytes, which are non-target components contained after density gradient centrifugation, are captured by antibody magnetic microparticles.
  • the type of antibody of the antibody magnetic particle for removing the non-target component is selected from antibodies against surface markers that are expressed in the non-target component and not expressed in the target component (cells or the like).
  • CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD13, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD23, CD33, CD34, CD36, CD41 It is preferable to select from CD42, CD45, CD45RA, CD45RO, CD56, CD66b and the like.
  • a binder that binds the non-target components.
  • a binder capable of binding to red blood cells and white blood cells (for example, RosetteSep (manufactured by StemCell Technologies)).
  • the binding agent only needs to be able to bind to one or more white blood cells or red blood cells, or to bind to a cell surface antigen, and can aggregate white blood cells or bind white blood cells to red blood cells. Any antibody may be used.
  • Particles (cell aggregates) that have been increased in density by the binder can be separated from the desired component (eg, cancer cells, etc.) during centrifugation.
  • the cylindrical member 2 is a cylindrical polypropylene member having an inner diameter of 16 mm, a length of 80 mm, and a capacity of 13 mL.
  • the inner surface of the member is coated with bovine serum albumin (BSA) to make it hydrophilic, thereby preventing nonspecific adsorption of cells and the like.
  • BSA bovine serum albumin
  • the inclination angle of the tapered portion 7 of the tubular member 2 is 30 °, and the communication opening with the tubular member 3 is ⁇ 2 mm.
  • the cylindrical member 3 is a polypropylene member having an inner diameter of 10 mm, a length of 43 mm, and a capacity of 2 mL.
  • a density gradient solution 31 (Axis-Shield PoC AS, trade name Lymphoprep) having a density of 1.077 g / mL is applied to the cylindrical member 3 on the lower side of the separation structure. 2 mL was injected (the lower white portion in the figure is the portion filled with the density gradient solution). Specifically, the density gradient solution was injected such that the liquid level height was about 1 mm higher than the communication opening 6 of the upper cylindrical member 2 (therefore, the liquid level was located inside the upper cylindrical member).
  • a mixed solution 32 of 3 mL of blood sample and 3 mL of physiological saline was layered on the density gradient solution (in the figure, the black coating portion is a portion of the mixed solution).
  • the blood sample is a suspension in which about 30 human cancer cells are suspended in the blood of a healthy person obtained by obtaining informed consent.
  • the cancer cells to be added are previously labeled with a fluorescent staining reagent (manufactured by Dojindo Laboratories, Inc., trade name Calcein AM).
  • the cancer cells were statically cultured so that the cell density was about 2 ⁇ 10 5 cells / cm 2, and the cells were detached from the dish with 0.25% trypsin / 1 mM EDTA, and adjusted by limiting dilution. Is.
  • the opening of the separation structure was sealed with a cap 4 (made of polypropylene) and centrifuged at 1100 ⁇ g for 10 minutes at room temperature.
  • the cells were maintained at the density gradient solution / sample interface (the top of the Lymphoprep solution) 33 by the centrifugation operation.
  • the upper cylindrical member 2 is opened by removing the cap and opening the seal as shown in the right of FIG. A part of the density gradient solution and the cells maintained thereon are discharged from the communication opening 6 and collected by a 50 mL tube installed below, and the inner wall of the upper cylindrical member is washed, and the cells attached to the wall are also removed. Collected simultaneously.
  • the collected cell suspension is made up to 30 mL with 0.4% sodium citrate / PBS solution, centrifuged at 300 ⁇ g for 10 minutes at room temperature, and the liquid at the top of the pellet is removed with a pipette. Of cells were resuspended in 30 mL of 300 mM mannitol solution and centrifuged at 300 ⁇ g for 5 minutes at room temperature. This centrifugation operation is for removing cell debris and platelets and concentrating the target cells.
  • Example 1 For the measurement of the collected cells, a method of observing the cells applied to the slide or trapped in the well under a microscope or a flow cytometry method can be used.
  • Example 1 a method was adopted in which the separated cells were captured and measured in holding holes (about 1 million) having a hole diameter of 30 ⁇ m and a depth of 30 ⁇ m provided on the substrate by dielectrophoretic force.
  • the apparatus shown in FIG. 5 has a power source 34 and electrode substrates 35 and 36, and applies a voltage between the substrates to cause a dielectrophoretic force 38 to act on the cells 37, and introduces and captures them in the holding holes 39. (See Japanese Patent No. 4910716).
  • the separated cell suspension was subjected to this apparatus, and the cells captured in the holding holes were observed with a fluorescence microscope 40. As a result, about 27 cancer cells were captured along with about 4 million normal leukocytes in the holding hole (recovery rate of about 90%).
  • the separation structure of the present invention the target cells could be separated with a high recovery rate by a simple operation of separating the cylindrical member constituting the structure and removing the cap that seals the opening.
  • the cylindrical member 2 is a cylindrical polypropylene member having an inner diameter of 18 mm, a length of 70 mm, and a capacity of 15 mL.
  • the inner surface of the member is coated with bovine serum albumin (BSA) to make it hydrophilic, thereby preventing nonspecific adsorption of cells and the like.
  • BSA bovine serum albumin
  • the inclination angle of the tapered portion 7 of the tubular member 2 is 30 °, and the communication opening with the tubular member 3 is ⁇ 2 mm.
  • the cylindrical member 3 is a polypropylene member having an inner diameter of 10 mm, a length of 54 mm, and a capacity of 2 mL.
  • a density gradient solution 31 (product name: Lymphoprep, manufactured by Axis-Shield PoC AS) having a density of 1.077 g / mL is applied to the cylindrical member 3 on the lower side of the separation structure. 2 mL was injected (the lower white portion in the figure is the portion filled with the density gradient solution). Specifically, the liquid level height of the density gradient solution is about 1 mm higher than the communication opening end (separation part) 6 of the upper cylindrical member 2 (therefore, the liquid level is located inside the upper cylindrical member). ) Injected.
  • the coated part is the part of the mixed liquid that is overlaid).
  • the blood sample is a suspension in which about 30 human cancer cells are suspended in the blood of a healthy person obtained by obtaining informed consent.
  • the cancer cells to be added are previously labeled with a fluorescent staining reagent (manufactured by Dojindo Laboratories, Inc., trade name Calcein AM).
  • the cancer cells were statically cultured so that the cell density was about 2 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , then the cells were detached from the dish with 0.25% trypsin / 1 mM EDTA, and adjusted by limiting dilution. Is.
  • the opening of the separation structure was sealed with a cap 4 (made of polypropylene) and centrifuged at 1100 ⁇ g for 10 minutes at room temperature.
  • the cells were maintained at the density gradient solution / sample interface (the top of the Lymphoprep solution) 33 by the centrifugation operation.
  • the upper cylindrical member 2 is opened by removing the cap and opening the seal as shown in the right of FIG.
  • a part of the density gradient solution and the cells maintained thereabove are discharged from the open end (separation part) 6 and collected in a 50 mL tube 50 (hereinafter sometimes referred to as “tube 50”) installed below.
  • tube 50 installed below.
  • the inner wall of the upper cylindrical member was washed, and the cells attached to the wall were also collected at the same time.
  • the collected cell suspension is made up to 30 mL with 0.4% sodium citrate / PBS solution, centrifuged at 300 ⁇ g for 10 minutes at room temperature, and the liquid at the top of the pellet is removed with a pipette. Of cells were resuspended in 30 mL of 300 mM mannitol solution and centrifuged at 300 ⁇ g for 5 minutes at room temperature. This centrifugation operation is for removing cell debris and platelets and concentrating the target cells.
  • Example 1 For the measurement of the collected cells, a method of observing the cells applied to the slide or trapped in the well under a microscope or a flow cytometry method can be used.
  • Example 1 a method was adopted in which the separated cells were captured and measured in holding holes (about 1 million) having a hole diameter of 30 ⁇ m and a depth of 30 ⁇ m provided on the substrate by dielectrophoretic force.
  • the apparatus shown in FIG. 5 has a power source 34 and electrode substrates 35 and 36, and applies a voltage between the substrates to cause a dielectrophoretic force 38 to act on the cells 37, and introduces and captures them in the holding holes 39. (See Japanese Patent No. 4910716).
  • the separated cell suspension was subjected to this apparatus, and the cells captured in the holding holes were observed with a fluorescence microscope 40.
  • Table 1 shows the recovery rates of two types of breast cancer cells (SKBR3, MDA-MB-231), two types of non-small cell lung cancer (PC9, A549), and two types of small cell lung cancer (H69, SBC-1). 74.6 to 92.4%.
  • the number of normal white blood cells mixed with cancer cells was about 4 million.
  • Example 3 Recovery of structure by overturning As a sample, 3 mL of a suspension obtained by mixing approximately 30 human breast cancer cells (SKBR3) with blood of a healthy person was used, and a centrifugation operation was performed in the same manner as in Example 1. Performed to maintain cells at the density gradient solution-sample interface. After completion of the centrifugation operation, the cap 2 is removed, the cylindrical members of the separation structure are turned over without being separated, and a part of the density gradient solution and the cells maintained thereon are allowed to flow out from the opening, and the tube 50 In addition, the inner wall of the upper cylindrical member was washed, and the cells attached to the wall were also collected at the same time. At this time, the pellet mainly containing red blood cells moved to the lower structure by the tapered portion toward the communication opening of the upper cylindrical member of the separation structure flows back to the upper cylindrical member. There was no.
  • Example 1 Using the apparatus shown in FIG. 5, as in Example 1, it was confirmed that the separated cells were target human breast cancer cells. As a result, about 26 cancer cells were captured in the holding hole along with about 4 million normal leukocytes (recovery rate of about 85%).
  • the separation structure of the present invention it was possible to separate the target cells with a high recovery rate by a simple operation of removing the cap for sealing the opening and overturning the structure.
  • Example 4 Basic Principle of Aggregation Method Similar to Example 1, a sample prepared by mixing approximately 30 cancer cells into 3 mL of healthy blood on a density gradient solution, 3 mL of physiological saline, and 75 ⁇ L of binder (Trademark RosetteSep, StemCell Technologies Inc) mixed solution was layered, and centrifugation and recovery operations were performed.
  • binder Trademark RosetteSep, StemCell Technologies Inc
  • Table 2 shows the recovery rates of two types of breast cancer cells (SKBR3, MDA-MB-231), two types of non-small cell lung cancer (PC9, A549), and two types of small cell lung cancer (H69, SBC-1). 76.8 to 91.4%.
  • the separation structure of the present invention was used after the density was increased by binding non-target cells (red blood cells, white blood cells) to each other with a binder, and the density difference from the target cells (cancer cells) was increased. By performing the separation, the target cells could be separated with a high recovery rate and selectivity.
  • Example 5 Optimization of centrifugal conditions in density difference separation
  • SKBR3 human breast cancer cells
  • the liquid was layered on the density gradient solution, and centrifugation and recovery operations were performed.
  • the centrifugation conditions for density difference separation were 1100 to 3000 ⁇ g, 3 to 10 minutes at room temperature. After centrifuging, the cylindrical members 2 and 3 constituting the separation structure are separated by the separation part without removing the cap, and then the cap is removed to open the seal, thereby opening the communication opening end of the upper cylindrical member 2.
  • the collected cell suspension was diluted to 30 mL with 0.4% sodium citrate / PBS solution, and centrifuged at 300 ⁇ g for 10 minutes at room temperature.
  • the liquid at the top of the pellet was removed with a pipette, the cells in the pellet were resuspended in 30 mL of 300 mM mannitol solution, and then centrifuged at 300 ⁇ g for 5 minutes at room temperature.
  • Example 2 Using the apparatus shown in FIG. 5, as in Example 1, it was confirmed that the separated cells were the intended breast cancer cells.
  • Table 3 shows the results of centrifugation conditions and cancer cell recovery.
  • Example 6 Optimization of centrifugation conditions in recovery operation
  • SKBR3 human breast cancer cells
  • a mixture of physiological saline and binder Were layered on the density gradient solution, and centrifugation and recovery operations were performed.
  • the centrifugation conditions in density difference separation were implemented at 2000 xg for 5 minutes at room temperature. After centrifuging, the cylindrical members 2 and 3 constituting the separation structure are separated by the separation part without removing the cap, and then the cap is removed to open the seal, thereby opening the communication opening end of the upper cylindrical member 2.
  • the collected cell suspension was diluted to 30 mL with 0.4% sodium citrate / PBS solution, and centrifuged at 300 to 900 ⁇ g for 5 to 10 minutes at room temperature.
  • the liquid at the top of the pellet was removed with a pipette, the cells in the pellet were resuspended in 30 mL of 300 mM mannitol solution, and then centrifuged at 300 ⁇ g for 5 minutes at room temperature.
  • Example 2 Using the apparatus shown in FIG. 5, as in Example 1, it was confirmed that the separated cells were the intended breast cancer cells.
  • Table 4 shows the results of centrifugation conditions and cancer cell recovery.
  • the recovery rate reaches the maximum of 89.2%, and when the centrifugal acceleration is 300 ⁇ g and the centrifugation time is less than 10 minutes, the cells do not settle sufficiently. At 12 minutes or longer, the recovery rate decreased due to excessive loading and cell death over time.
  • the centrifugal acceleration was set to 900 ⁇ g or more, a remarkable gravity load on the cells was observed, and the recovery rate was greatly reduced.
  • Example 7 Optimization of inclination angle of tapered shape (density gradient solution 1.077 g / mL)
  • a sample obtained by mixing about 30 human breast cancer cells (SKBR3) with healthy human blood, a physiological saline solution, and a binder mixture were layered on the density gradient solution, centrifuged, A recovery operation was performed. Centrifugation in density difference separation was performed at 2000 ⁇ g for 5 minutes, and centrifugation in recovery was performed at 300 ⁇ g for 10 minutes at room temperature.
  • the cylindrical member 2 is a cylindrical polypropylene member having an inner diameter of ⁇ 18 mm, a length of 70 mm, and a capacity of 15 mL.
  • the inner surface of the member is coated with bovine serum albumin (BSA) to make it hydrophilic, thereby preventing nonspecific adsorption of cells and the like.
  • BSA bovine serum albumin
  • the inclination angle of the tapered portion 7 of the cylindrical member 2 is 30, 50, or 70 °, and the communication opening with the cylindrical member 3 is ⁇ 2 mm.
  • the cylindrical member 3 is a polypropylene member having an inner diameter of 10 mm, a length of 54 mm, and a capacity of 2 mL.
  • the separated cells were the intended breast cancer cells.
  • the inclination angle of the tapered portion 7 of the cylindrical member 2 was 30 °, the recovery rate reached the maximum of 86.5%.
  • the cancer cells maintained at the interface between the density gradient solution and the sample on the cylindrical member 2 side (the top of the Lymphoprep solution) are more likely to move to the cylindrical member 3 side.
  • the taper-shaped portion 7 had an inclination angle of 75% at 50 ° and 73% at 70 °.
  • Example 8 Optimization of density gradient solution
  • the density of a mixture of approximately 30 human breast cancer cells (SKBR3) mixed with healthy human blood, physiological saline, and binder Overlaying the gradient solution, centrifugation and recovery operations were performed. Centrifugation in density difference separation was performed at 2000 ⁇ g for 5 minutes, and centrifugation in recovery was performed at 300 ⁇ g for 10 minutes at room temperature.
  • 2 mL of a density gradient solution having a density of 1.077, 1.082, 1.084, or 1,091 g / mL was injected into the cylindrical member 3 of the separation structure 1.
  • Example 1 Using the apparatus shown in FIG. 5, as in Example 1, it was confirmed that the separated cells were the intended breast cancer cells.
  • Table 5 shows the results of density gradient solution density and cancer cell recovery.
  • the recovery rate of cancer cells was improved, and the recovery rate was 96.9% at a density of 1.091 g / mL.
  • Example 9 Optimization of communication opening diameter (specification that liquid can be retained by sealing the cap)
  • SKBR3 human breast cancer cells
  • a physiological saline solution a physiological saline solution
  • a binder mixture a sample obtained by mixing about 30 human breast cancer cells (SKBR3) with healthy human blood, a physiological saline solution, and a binder mixture were layered on the density gradient solution, centrifuged, A recovery operation was performed.
  • the cylindrical member 2 is a cylindrical polypropylene member having an inner diameter of 18 mm, a length of 70 mm, and a capacity of 15 mL.
  • the inner surface of the member is coated with bovine serum albumin (BSA) to make it hydrophilic, thereby preventing nonspecific adsorption of cells and the like.
  • BSA bovine serum albumin
  • the inclination angle of the tapered portion 7 of the tubular member 2 is 70 °, and the communication opening with the tubular member 3 is ⁇ 2, 4, or 6 mm.
  • the cylindrical member 3 is a polypropylene member having an inner diameter of 10 mm, a length of 54 mm, and a capacity of 2 mL.
  • Example 1 using the apparatus shown in FIG. 5, it was confirmed that the separated cells were the intended breast cancer cells.
  • the communication opening was ⁇ 2, 4 mm, the recovery rate was 86, respectively. 2% and 85.5%, while in ⁇ 6mm, the recovery rate was significantly reduced to 72.2%.
  • the separation structure includes a cap 49 and cylindrical members 41, 42, and 43.
  • the cylindrical member 41 is a cylindrical polypropylene member having an inner diameter of 20 mm, a length of 60 mm, and a capacity of 11 mL.
  • the inclination angle of the tapered portion 44 of the cylindrical member 41 is 70 °, and the communication opening with the cylindrical member 42 is ⁇ 2 mm.
  • the cylindrical member 42 is a cylindrical polypropylene member having an inner diameter of 14 mm, a length of 30 mm, and a capacity of 3 mL.
  • the inclination angle of the tapered portion 45 of the cylindrical member 42 is 30 °, and the communication opening with the cylindrical member 43 is ⁇ 2 mm.
  • the cylindrical member 43 is a polypropylene member having an inner diameter of 14 mm, a length of 41 mm, and a capacity of 2.5 mL.
  • the inner surface of the member is coated with bovine serum albumin (BSA) to make it hydrophilic, thereby preventing nonspecific adsorption of cells and the like.
  • BSA bovine serum albumin
  • a density gradient solution (a portion filled with the lower cylindrical member) 46 having a density of 1.077 to 1.086 g / mL was injected into the lower cylindrical member 43 of the separation structure (see FIG. The middle and lower white parts are filled with the density gradient solution).
  • a density gradient solution (central cylindrical member at the center) having a density of 1.030 to 1.086 g / mL is placed on the intermediate cylindrical member (center) 42 (sometimes referred to as the cylindrical member 42) of the separation structure.
  • Density gradient solution 47 was injected 3 mL (the middle hatched portion in the figure is the portion filled with the density gradient solution).
  • the opening of the separation structure was sealed with a cap 49 (made of polypropylene) and centrifuged at 2000 ⁇ g for 5 minutes at room temperature.
  • a cap 49 made of polypropylene
  • the cylindrical members 42 and 43 constituting the separation structure were separated by the separation part without removing the cap, and then the tubular members 41 and 42 were separated by the separation part.
  • only a part of the density gradient solution and the cells in the cylindrical member 42 are allowed to flow out from the communication opening of the cylindrical member 42 and are collected by the tube 50 installed below, and the inner wall of the cylindrical member 42 is washed. Cells attached to the wall were also collected at the same time.
  • Each collected cell suspension is diluted to 30 mL with 0.4% sodium citrate / PBS solution, centrifuged at 300 ⁇ g for 10 minutes at room temperature, and the liquid at the top of the pellet is removed with a pipette.
  • the cells inside were resuspended in 30 mL of 300 mM mannitol solution and centrifuged at 300 ⁇ g for 5 minutes at room temperature. This centrifugation operation is for removing cell debris and platelets and concentrating the target cells.
  • Table 6 shows the density gradient solution density injected into the cylindrical members 42 and 43 and the results of the cancer cell recovery rate from each cylindrical member.
  • each cell type (density) can be obtained for each target cell type (density) by a simple operation of separating each cylindrical member constituting the structure and removing a cap that seals the opening. Can be separated.
  • Example 11 Secondary separation by magnetic beads of fraction after density centrifugation As a sample, 3 mL of a suspension of about 30 cancer cells mixed with healthy blood was used in the same manner as in Example 1. Centrifugation was performed to maintain the cells at the density gradient solution-sample interface. After completion of the centrifugation operation, the cylindrical members 2 and 3 constituting the separation structure are separated at the separation part without removing the cap, and then the cap is removed as shown in the right of FIG. 4 to open the seal.
  • the collected cell suspension was made up to 30 mL with 0.4% sodium citrate / PBS solution, centrifuged at 300 ⁇ g for 10 minutes at room temperature, and the liquid at the top of the pellet was removed with a pipette.
  • the pellet was resuspended in 500 ⁇ L of PBS solution, and 25 ⁇ L of antibody magnetic particles (Dynabeads CD45, Invitrogen) for removing leukocytes were added thereto. Thereafter, the antigen-antibody reaction was carried out at 4 ° C. for 20 minutes with stirring.
  • the collected cell suspension was diluted to 30 mL of a 300 mM mannitol solution and centrifuged at 300 ⁇ g for 5 minutes at room temperature.
  • Table 7 shows the recovery rates of two types of breast cancer cells (SKBR3, MDA-MB-231), two types of non-small cell lung cancer (PC9, A549), and two types of small cell lung cancer (H69, SBC-1). 37.0 to 87.3%.
  • Example 1 Samples used in Example 1 using a commercially available blood separation kit by density gradient centrifugation (Axis-Shield PoC AS, trade name Lymphoprep Tube, density gradient solution (Lymphoprep) density 1.077 g / mL) Of human breast cancer cells (SKBR3) from The sample was layered on the density gradient solution in the separation container included in the kit, and then centrifuged at 1100 ⁇ g for 10 minutes at room temperature.
  • density gradient centrifugation Axis-Shield PoC AS, trade name Lymphoprep Tube, density gradient solution (Lymphoprep) density 1.077 g / mL) Of human breast cancer cells (SKBR3)
  • the collected cell suspension is made up to 30 mL with 0.4% sodium citrate / PBS solution, centrifuged at 300 ⁇ g for 10 minutes at room temperature, and the liquid at the top of the pellet is removed with a pipette. Of cells were resuspended in 30 mL of 300 mM mannitol solution and centrifuged at 300 ⁇ g for 5 minutes at room temperature. This centrifugation operation is for removing cell debris and platelets and concentrating the target cells.
  • the liquid at the top of the pellet was removed with a pipette, and the cells in the pellet were resuspended in 1 mL of 300 mM mannitol solution.
  • the separated cells were target human breast cancer cells.
  • about 4.4 million normal leukocytes were captured in the holding holes, and about 25 cancer cells (recovery rate: about 83%).
  • about 4 million normal leukocytes were captured in the holding hole, and about 14 cancer cells (recovery rate: about 45%) were obtained.
  • the recovery rate of cancer cells greatly fluctuated from operation to operation. From this result, it can be seen that cancer cells can be stably recovered at a high recovery rate by the present invention in which a part of the density gradient solution and cells maintained thereon are flowed out from the communication opening of the upper cylindrical member.
  • Example 2 After centrifugation at 1100 ⁇ g, the same procedure as in Example 1 was performed except that the cells maintained at the interface between the density gradient solution and the sample (the top of the density gradient solution) were aspirated and collected in a tube. Carried out. As a result, approximately 4.1 million normal white blood cells were captured in the holding hole, but only about 21 cancer cells (recovery rate: about 71%), and the operation of aspirating cancer cells with a pipette after centrifugation As a result, the recovery rate of cancer cells decreased. From this result, it can be seen that cancer cells can be stably recovered at a high recovery rate by the present invention in which a part of the density gradient solution and cells maintained thereon are flowed out from the communication opening of the upper cylindrical member.
  • the target component can be efficiently recovered regardless of the skill level of the operator and the density of the component.
  • the present invention can be widely used in separation and concentration of components such as cells. Accordingly, the present invention is useful not only in research studies but also in application fields such as diagnosis and treatment.

Abstract

　一端は閉塞して底部を形成し、他端は開口した筒状の構造体と、開口を密閉するキャップからなり、前記構造体は２以上の筒状部材より構成され、分離部にて分離可能である分離構造体を使用することで、目的細胞等を安定的に、高い回収率で回収可能とする。

Description

分離構造体及び分離方法
　本発明は、遠心力を利用して液体試料から目的とする成分を分離する分離構造体と当該分離構造体を用いた分離方法に関するものであり、特に好適には体液、分散組織標本又は培養細胞のような細胞を含む試料から細胞を分離し、濃縮するための分離構造体及び分離方法に関するものである。
　体液や細胞培養液等の生物学的液体から、又は、組織を懸濁・分散した分散組織標本から細胞のみを分離し、分離した細胞を臨床診断や治療へ応用する研究が進められている。このような応用研究として、例えば、血液や組織から分離した腫瘍細胞について、形態学的分析、組織型分析および遺伝子分析を行い、その知見に基づいて治療薬を選定することが行われている。
　血液等から細胞を分離する方法には、細胞をその密度に基づいて分離する密度勾配遠心法が知られている（特許文献１）。この方法は、密度勾配を形成した溶液（以下、「密度勾配溶液」と記載する）上に血液等の細胞を含む溶液を重層して遠心し、目的とする細胞を含有する層を回収することによって不要な細胞や血液に含まれる他の成分を含まない細胞分画を得るものである。
　密度勾配溶液には、市販のもの（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス社製）、密度約１．０７７ｇ／ｍＬ、ショ糖とエピクロロヒドリンを共重合した分子量４０万の合成品の水溶液）が使用されているが、目的とする細胞、ウイルス、細胞小器官、膜結合顆粒等よりも大きい密度の密度勾配溶液を使用することで、当該細胞等を密度勾配溶液上に維持したまま、他のより密度の大きい成分から分離することができる。Ｆｉｃｏｌｌは、それ自体に凝集作用があり、血液に含まれる赤血球や顆粒球を凝集して高分子化、沈降させることができるため、それを利用することにより血液からの細胞等の分離をより効果的に実施し得る。
　また、密度勾配遠心においては、遠心分離後にデカンテーションを行なう際に、底部の液体を混合することなく上部の液体を回収するための工夫もなされている。例えば、遠心分離用容器として、内部に収縮部材による仕切り構造を有する遠心分離チューブ（特許文献２）や、内部に隔壁板、フィルター又は篩等の多孔性隔壁板による仕切りを有する容器（特許文献３）が報告されている。
　なお、密度勾配遠心に利用されるものではないが、上部と下部チャンバーとフィルターメンブレンの積層体を含む濾過デバイス（特許文献４）についての報告がある。
国際公開第１９９７／０２１４８８号 特許第３３９７７９５号 特表２００２－５３６６３５号 国際公開第２０１２／１５４２５７号
　密度勾配遠心法には、使用する遠心分離手段のローター形状に合致した寸法形状の分離容器を使用するが、分離容器は通常、一端は閉塞して底部を形成し、他端は開口を密閉した概ね円筒状である。そのため、遠心分離操作を終了した後、密度勾配溶液中で密度に応じて移動した細胞等を分離容器から回収するに際しては、密閉を解いた開口端からピペット先端を差し込み、密度勾配溶液上の極めて薄い層を回収する必要がある。しかしながら、この操作には熟練が必要で、目的とする細胞等の回収率が変動しやすく、また、ピペット先端を密度勾配溶液中に差し込んでしまい、目的とする細胞等以外の細胞等を誤って回収してしまうおそれがあるという問題があった。
　そこで、本発明は、分離された細胞のうち、不要成分を構造体ごと切り離すことで、目的の細胞を操作者の熟練度や細胞の密度によらずに効率的に回収し得る分離構造体を提供することを目的とする。
　また、例えば、血液を市販の密度勾配液（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ、密度約１．０７７ｇ／ｍＬ）で分離する場合、遠心後、不要な細胞(赤血球)は下層に位置し、目的の細胞(がん細胞、白血球など) は上層に位置することになる。血液細胞の濃縮や分離に用いられる従来の分離構造体は、仕切り構造などで上層と下層を分けていても、回収するのは基本的に上層に位置する細胞に限定されている。
　そこで、本発明は、目的の細胞がどの層に位置しても操作者の熟練度に関係なく簡便な操作で回収することができる分離構造体を提供することをも目的とする。
　前記目的に鑑みて完成された本発明は、一端は閉塞して底部を形成し、他端は開口した筒状の構造体と、開口を密閉するキャップからなり、前記構造体は２以上の筒状部材より構成され、分離部にて分離可能であることを特徴とする、分離構造体である。また本発明は、液体試料から目的とする成分を分離する分離方法、特に密度の異なる２種以上の細胞群から目的とする一種の細胞を単離する方法であって、密度勾配溶液を前記構造体底部から前記分離部近傍まで満たし、試料を重層して前記開口を密閉した状態で遠心分離する工程と、遠心分離後、開口部の密閉状態を維持したまま前記構造体を分離し、目的とする細胞等を含む分画を回収する工程からなる細胞分離方法である。
　本発明の分離構造体及び分離方法は、遠心分離操作の後、目的とする細胞等が含まれる分画を回収するにあたり、分離構造体ごと不要な分画を分離し、分離構造体を構成する筒状部材の密閉を開放する、という極めて簡単な操作を行うのみである。従って、分離容器の開口端からピペット先端を差し込み、密度勾配溶液上の極めて薄い分画を回収する方法と比較して、熟練が不要となる、目的とする細胞等を安定的に回収し得る、ピペット先端を密度勾配溶液中に差し込んでしまい、目的とする細胞等以外の細胞等を誤って回収するおそれが少ない、という効果を奏することができる。このような効果により、操作者の熟練に依存しない細胞の分離が可能となり、目的とする細胞等の分離操作を機械操作によって自動化することも可能となる。
　また本発明の分離構造体及び分離方法において、２以上の分離可能な部材からなる構成を採用することにより、不要成分を構造体ごと切り離し、目的とする細胞の種類（密度）毎に、当該細胞を効率的に回収することが可能となる。しかも、遠心分離操作の後、目的の細胞が分離液の上層/中層/下層のいずれの層に位置しても操作者の熟練度に関係なく本構造体の切り離しという簡便な操作で回収することができる。
　さらに、上側の筒状部材の連通開口端（分離部）に至る部分の形状を、下側の筒状部材に向かって先細り形状とする態様においては、その形状によって、下側の筒状部材に移動した成分が上側の筒状部材に逆流することを防止でき、また、目的細胞の分離効率（回収率）を顕著に向上させることができ、さらには、キャップによる密閉状態を維持したまま筒状部材を分離した際に、筒状部材の開口部からの液体流出を防止することができる。
本発明の分離構造体を説明するための図である。 本発明の分離方法を説明するための図である。 本発明の分離方法を説明するための図である。 本発明の実施例１で用いた分離構造体を示す図である。 本発明の実施例１、２及び比較例で実施した細胞の測定方法を説明するための図である。 本発明の実施例１０で用いた分離構造体を示す図である。 本発明の実施例１０の分離方法を説明するための図である。
　以下、図面に基づき本発明を詳細に説明する。
　図１は、本発明の一態様を示した図である。本例の分離構造体１は、２及び３の２つの筒状部材からなる。分離構造体の上部を構成する筒状部材（上側）２（「筒状部材２」と記載することがある）は開口を有し（本図では密閉用のキャップ４により開口を密閉した状態を示すが、キャップ４は、分離構造体１に脱着可能に取りつけられればよく、図１に示したキャップ式（筒状部材２へ挿入する形式）の他、ねじ込み式、シール式などが例示できる）、筒状部材（下側）３（「筒状部材３」と記載することがある）は、一端が閉塞して底部５を形成している。
　筒状部材２及び３は、それぞれ開口又は底部の反対の端に連通開口端（分離部）が設けられ、該両部材が連結された場合に両筒状部材の内部空間が連通し、全体として一つの分離構造体を形成する。この連結は、各筒状部材を分離し得るようなものであればよく、例えば各連通開口を互いに嵌合するような態様のほか、図１に示したように一方（筒状部材２）を他方（筒状部材３）に挿入するようにする、ねじ等を設ける、又は、両者を固定保持するジョイント部材を取りつける等が例示できる。
　連通開口端（分離部）６それ自体は、密度勾配溶液の上に重層された試料中の密度の大きい成分が通過する大きさであり、キャップ４による密閉状態を維持したまま筒状部材を分離したときに筒状部材２に保持された液体が流出しない寸法であればよい。連通開口の内径（Φ）は、１～６ｍｍが好ましく、２～４ｍｍがさらに好ましい。なお、筒状部材２又は筒状部材３の連通開口のいずれかには、垂直貫通孔が形成されたフィルター又はメッシュ状の濾材を設置することができる。かかるフィルター等の設置により、例えば遠心分離操作後に構造体が倒れたり、遠心分離手段への移送に伴い振動が加えられたときに、密度勾配溶液と試料とが混合されてしまうことや、遠心分離操作後に筒状部材２に維持された密度の小さい成分と筒状部材３に移動した密度の大きい成分とが混合されてしまうことを防止することが可能となる。
　なお本例では、筒状部材２の連通開口端（分離部）６に至る部分の形状を、筒状部材３に向かって先細り形状（筒状部材２の先細り形状部分７）としてある。筒状部材２を連通開口に向かってこのような形状とすることにより、後述する実施例３で示したように、下側の筒状部材３に移動した成分が上側の筒状部材２に逆流することを防止でき、フィルターを設けるのと同様の効果を得ることができる。また、後述する実施例７で示したように、先細り形状部分７の傾斜角に応じて目的の成分の分離効率（回収率）を顕著に向上させることができる。さらには、キャップによる密閉状態を維持したまま筒状部材を分離した際に、筒状部材２の開口部からの液体流出を防止することができる。このような複数の効果が期待できることから、筒状部材２の連通開口端（分離部）６に至る部分の形状は、先細り形状であることが好ましい。上層（筒状部材２）から目的の成分を回収する場合には、当該傾斜角は５～７０°であることが好ましく、１０～５０°であることがより好ましく、２０～４０°であることが特に好ましい。下層（筒状部材３）から目的の成分を回収する場合には、当該傾斜角は２０°以上であることが好ましく、４０°以上であることがより好ましく、６０°以上であることが特に好ましい。
　本例の筒状部材は、寸法や形状について特に制限はないが、いずれも概ね円筒状である。また形状については、使用する遠心分離手段のローターに合致する形状であれば多角形状であってもよいが、製造、保管等の観点から円筒が特に好ましい。
　筒状部材２、３及びキャップ４は、アクリル、エポキシ、ポリスチレン等の樹脂、酸化ケイ素を主成分とした合成石英（ＳｉＯ２）、セラミックス又は金属系材料等で構成することができるが、加工性や経済性の観点、そして特に血液等の生体試料を使用した後の廃棄性の問題からポリプロピレン、ポリスチレン樹脂の熱可塑性樹脂が好ましい。また、部材は、非収縮性であることが好ましい。さらに、分離構造体の内面（試料が接触し得る面）は、目的とする細胞等の非特異的な吸着を防止する観点から親水性であるか、又は、別途の処理により親水化可能なものであることが好ましい。親水化のための処理は、特に制限されず、樹脂であれば、例えばコロナ放電処理により樹脂表面の表面エネルギーを活性化してカルボニル基等の極性基を生成して親水化する方法や、また例えば酸素プラズマ処理により電子・イオン・ラジカルを表面に照射し、－ＣＯＯＨや－ＣＯを導入して表面の親水性を向上させる方法を例示できる。また例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレート、ポリアクリルアミド、ＭＰＣポリマーなどの親水性ポリマーを塗布して表面を親水化する方法を例示できる。筒状部材２、３及びキャップ４はそれぞれ一体成形することができる。
　次に、上記説明した分離構造体を使用する本発明の分離方法について説明する。本発明は、例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、髄液、羊水等の生体試料、細胞の凝集物、腫瘍、リンパ節又は動脈といった器官や組織に由来する試料、細胞培養液等に含まれる細胞を分離するために使用することができる。器官や組織については、通常の処理に従って細胞懸濁液を調製後、本発明の分離方法を実施すればよい。なお、本明細書において、目的とする細胞の分離は当該細胞の濃縮と同義である。すなわち、遠心分離操作の後に、密度勾配溶液の上に維持される分画又は密度勾配溶液を通過してその下方に移動する分画に含まれる目的とする細胞等を回収することは、それ以外の分画に含まれる目的外成分の除去による、目的とする細胞等の濃縮にほかならない。
　密度勾配溶液は、それ自身で又は遠心分離によって密度勾配を形成する液体状の物質であり、目的とする細胞の密度（比重）を特定し、その分離に適当なものを選択して使用すればよい。選択の指標としては、例えば栄養成分、ｐＨ、等張性等を例示できる。具体的にはショ糖、グリセロール、デキストラン、メトリザミド、イオディキサノール、ショ糖とエピクロロヒドリンの共重合体、ポリビニルピロリドンの被膜をもつコロイド状シリカ粒子、スクロースポリマー、ジアトリゾ酸、イオヘキソール、ニコデンツ等のイオン性又は非イオン性のものが例示できる。市販されている密度勾配溶液として、ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス社製の商品名Ｆｉｃｏｌｌ、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ又はＰｅｒｃｏｌｌ、Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ　ＰｏＣ　ＡＳ社製の商品名Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ又はＯｐｔｉＰｒｅｐを例示できる。
　密度勾配溶液は、分離構造体１において、その底部（筒状部材３の底部５）から連通開口端（分離部）６近傍まで注入する。より具体的には、分離構造体１を静置した場合に、密度勾配溶液の液面高さが上側の筒状部材２の連通口端より高くなる（筒状部材２側になる）ようにする。すなわち、試料溶液のうち、目的外の成分（細胞等）を下側の筒状部材（筒状部材３）に分離した際に、密度勾配溶液上に維持された目的成分（細胞）を筒状部材２に維持された状態で分離できる程度、好ましくは１ｍｍ程度、高くなるよう注入する。
　その後、試料溶液を密度勾配溶液の上に重層し、開口部をキャップ４で密閉し、遠心分離操作を行う。遠心分離操作は、一般には１０００から２０００×ｇ程度の低速で実施すればよいが、目的とする細胞の密度や使用する密度勾配溶液の密度を勘案し、目的とする細胞が密度勾配溶液の上に維持される条件を選択する。例えば目的とする細胞が腫瘍細胞であり、上記のような遠心を行うのであれば、腫瘍細胞の種類に応じて密度勾配溶液の密度を１．０６０～１．０９５ｇ／ｍＬの範囲、生理学的浸透圧を２００～４５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲、そしてｐＨを６．８～７．８の範囲に調整することが挙げられる。
　遠心分離操作により、密度勾配溶液の密度より大きな密度を有する成分は、密度勾配溶液の勾配層を通過して筒状部材３中に移動する。一方、密度勾配溶液より小さな密度の目的とする細胞は、筒状部材２内の密度勾配溶液の上に維持される。そこで開口部の密閉を維持したまま連結された筒状部材を図１で示した状態となるように分離すれば、上側の筒状部材（筒状部材２）中に目的とする細胞を含む分画を回収することができる。この分画は、例えばキャップ４を取り外すことによって密閉状態を開放することで下方へ滴下させる等すれば、特別の熟練を要することなく容易に回収できる。一方、筒状部材３中に移動した分画については、例えば当該筒状部材とともに廃棄等することができる。
　以上、図１に示した態様に従って本発明を説明したが、本発明の分離構造体は３以上の筒状部材で構成することも可能である。この場合、筒状部材の一つは密閉される開口が設けられたものであり、これとは異なる一つの筒状部材は閉塞した底部を形成するものであり、これら以外は両端に連通開口を有する筒状部材となる。このような筒状部材を用い、目的とする細胞の密度や密度勾配溶液の密度に応じて分離する場所を変更すれば、目的とする細胞の種類（密度）毎に、当該細胞を分離することが可能となる。
　以下に具体的に３つの分離可能な部材からなる構成を採用する分離構造体について図６を用いて説明するが、本発明は、３つの分離可能な部材からなる構成に限られるものではない。３つの分離可能な部材からなる構成を採用する分離構造体を用いる効果として、目的とする成分（細胞等）の種類（密度）毎に分離可能であること、目的とする成分(細胞等)の密度分布を確認できることなどが挙げられる。
　図６において、まず筒状部材（上側）４１に密度を知りたい目的とする成分（細胞等）を含む試料溶液を注入し、それ以外の筒状部材である筒状部材（中央）４２及び筒状部材(下側)４３に密度が高い（例えば、約１．０８６ｇ／ｍＬ）密度勾配溶液を満たした後、遠心分離をする。前記操作により、前記目的とする成分(細胞等)を筒状部材(上側)４１にのみ回収することができる条件を見出すことで目的とする成分(細胞等)の最大密度が分かる。
　続いて、筒状部材（中央）４２に密度が低い（例えば、約１．０３０ｇ／ｍＬ）密度勾配溶液を満たし、筒状部材(下側)４３に前記検討で知り得た目的とする成分(細胞等)の最大密度条件（例えば、約１．０８６ｇ／ｍＬ）に相当する密度勾配溶液を満たして、遠心分離をする。前記同様に目的とする成分(細胞等)を筒状部材４２（中央）にのみ回収することができる条件を見出すことで目的とする成分(細胞等)の最小密度が分かる。このようにして、目的とする成分(細胞等)と密度勾配溶液の密度関係で単純に分離するだけでなく、目的とする成分(細胞等)の性質（密度）をも知ることができる。
　本発明においては、目的とする成分（細胞等）に特異的に結合する物質を添加し、又は、目的外の成分（細胞等）に特異的に結合する物質を添加することにより、目的とする成分を更に効率的に分離することができる。図２に示すように、目的外の成分（細胞等）２１（「目的外の成分２１」と記載することがある）に対して特異的に結合する物質２２と、密度を調整するための物質２３との結合物を予め試料に添加すれば、両者の結合によって目的外の成分２１の見かけ上の密度（比重）が大きくなり、目的とする成分（細胞等）２４（「目的とする成分２４」と記載することがある）との差がはっきりとするため、両者を効率的に分離することが可能になる。なお、特異的に結合する物質と多孔質シリカ粒子等の比較的密度が小さい物質を結合させれば、見かけ上の密度を小さくすることができる。このように、密度を調整する目的で使用する物質としては、前記多孔質シリカ粒子に加え、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリド、ポリアクリロニトリル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリカルボネート等のポリビニル化合物に代表される有機ポリマー、ポリスチレンラテックス、ナイロン、ポリテレフタレート等の共重合体、ガラス、シリカ、ジルコニア等の無機材料、セルロース、デキストラン、アガロース、セファロース等の生体ポリマーが挙げられ、目的とする細胞等と特異的に結合する物質としては、例えば、抗体、抗原、ペプチド、ポリペプチド、成長因子、サイトカイン、レクチン等の生体高分子が挙げられる。
　また本発明の分離構造体で分離後、目的外成分（細胞等）を更に除去することで、目的とする成分（細胞等）をより選択的に回収することできる。例えば、密度勾配遠心後の溶液をフィルターに通すことで目的外成分をフィルター通過させ、目的とする成分をフィルターに捕捉し、濃縮することができる。逆に目的とする成分をフィルター通過させ、目的外成分をフィルター捕捉してもよい。フィルターに形成する貫通孔は、使用用途によって適宜調整することができるが、例えば、がん細胞（約２０μｍ）をフィルターに捕捉する場合、開口部が円形となるものが好ましく、その孔径は１から２０μｍ、好ましくは１から１０μｍ、特に好ましくは２から８μｍである。孔径が１μｍより小さいとフィルターに目詰まりが発生することでフィルター付近の吸引圧が上昇し、細胞が破壊されることがある。一方で１０μｍより大きくなると、小径のがん細胞がフィルターを通過し取りこぼす可能性がある。貫通孔の数や配置については特に制限はないが、多数の貫通孔を設けることが細胞分離効率を向上する上で好ましい。多数の貫通孔を設ける場合、貫通孔間の距離（ある貫通孔の開口部の中心から、他の貫通孔の開口部の中心点までの距離）を等間隔とすることが好ましい。貫通孔間の距離は貫通孔の孔径を考慮して適宜決定することができるが、２０μｍ以上とすることを例示できる。より具体的には、例えば孔径が８から１０μｍである場合には、貫通孔間の距離を５０μｍ程度とすることが特に好ましい。
　上記説明した貫通孔を形成したフィルターの具体例としては、電鋳技術を用いて貫通孔を形成したニッケル基板や、レーザー技術を用いて貫通孔を形成したガラスや石英基板が挙げられる。いずれの技術によっても、ニッケル基板等に意図した通りの貫通孔を形成することができる。
　フィルターは、親水性であることが好ましい。かかる性質により、試料に含まれる成分の吸着が防止され、目詰まり等が発生し難いからである。この目的のためには、本来親水性である材料でフィルターを製造してもよいし、その表面を任意の処理によって親水化してもよい。表面親水化のための処理に特別の制限はなく、例えば、本発明の分離構造体の親水化方法にて説明したコロナ放電処理、プラズマ処理、親水性ポリマー塗布、およびＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やＯＶＡ（卵白オボアルブミン）等のタンパク質溶液に浸漬して表面を親水化する方法が挙げられる。
　また目的成分をより選択的に分離するには、例えば、密度勾配遠心後に回収した成分と抗体磁性粒子とを反応させることで目的とする成分を抗体磁性粒子結合させた後、磁力によって目的とする成分を捕捉すればよい。逆に目的外成分に抗体磁性粒子結合させた後、磁力によって目的外成分を除去してもよい。その際に用いる抗体磁性粒子は、目的とする成分に対しては非反応性である適切な材料により形成されていることが好ましい。例えば、血液中からがん細胞を回収する場合、密度勾配遠心分離後に含まれる目的外成分である白血球を抗体磁気微粒子で捕捉する。その目的外成分を除去するための抗体磁性粒子の抗体の種類は、目的外成分で発現しており、目的とする成分（細胞等）に発現していない表面マーカーに対する抗体から選択する。例えば、血液から白血球を除去する場合はＣＤ１，ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ５，ＣＤ７，ＣＤ８，ＣＤ１０，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１３，ＣＤ１４，ＣＤ１６，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２２，ＣＤ２３，ＣＤ３３，ＣＤ３４，ＣＤ３６，ＣＤ４１，ＣＤ４２，　ＣＤ４５，ＣＤ４５ＲＡ，ＣＤ４５ＲＯ，ＣＤ５６，ＣＤ６６ｂ等から選択することが好ましい。
　更には２以上の目的外の成分が存在する場合、目的外の成分同士を結合する結合剤を用いて濃縮することも可能である。例えば、血液中から極微量のがん細胞を分離する場合や一部の白血球成分を分離する場合、赤血球および白血球と結合可能な結合剤（例えば、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））を用いて濃縮することができる。結合剤は、一つまたはそれ以上の白血球や赤血球と結合可能であるか、細胞の表面抗原と結合するものであればよく、白血球を凝集させるか、または、白血球を赤血球に結合させることができる抗体であればよい。結合剤によって密度が大きくなった粒子（細胞凝集体）は、遠心分離中に、目的とする成分（例えば、がん細胞など）から分離され得る。
　以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
　［実施例１］基本原理
　図１に示した態様の分離構造体を使用して、がん細胞の分離を行った。分離構造体は、詳細には、筒状部材２は内径Φ１６ｍｍ、縦８０ｍｍ、容量１３ｍＬの円筒状のポリプロピレン製部材である。部材の内面にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をコーティングし、親水化することで細胞等の非特異吸着を防止してある。また筒状部材２の先細り形状部分７の傾斜角度は３０°であり、筒状部材３との連通開口はΦ２ｍｍである。筒状部材３は、内径Φ１０ｍｍ、縦４３ｍｍ、容量２ｍＬのポリプロピレン製部材である。
　図３に模式的に示したように、分離構造体の下側の筒状部材３に、密度が１．０７７ｇ/ｍＬの密度勾配溶液３１（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ　ＰｏＣ　ＡＳ社製、商品名Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）を２ｍＬ注入した（図中下部の白抜き部分が密度勾配溶液で満たした部分である）。詳しくは密度勾配溶液の液面高さが、上側の筒状部材２の連通開口６よりも約１ｍｍ高くなるように（従って液面は、上側筒状部材の内部に位置する）注入した。続いて密度勾配溶液の上に、３ｍＬの血液試料と３ｍＬの生理食塩水の混合液３２を重層した（図中、黒塗部分が重層した混合液の部分である）。なお、血液試料は、インフォームドコンセントを得て取得した健常者血液に約３０個のヒトがん細胞を懸濁した懸濁液である。添加する当該がん細胞はあらかじめ蛍光染色試薬（株式会社同仁化学研究所製、商品名ＣａｌｃｅｉｎＡＭ）で標識している。また、当該がん細胞は、細胞密度が約２×１０５個/ｃｍ２になるように静置培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡにより細胞をディッシュから剥離し、限界希釈により調整したものである。
　試料注入後、分離構造体の開口をキャップ４（ポリプロピレン製）で密閉し、１１００×ｇで１０分間、室温にて遠心分離した。遠心分離操作により、図４左に示したように、密度勾配溶液と試料の界面（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ液の頂部）３３に細胞は維持された。キャップを取り外すことなく分離構造体を構成する筒状部材２及び３を分離部で分離した後、図４右に示したようにキャップをはずして密閉を開放することで、上側の筒状部材２の連通開口６より密度勾配溶液の一部とその上に維持された細胞を流出させ、下方に設置した５０ｍＬチューブで回収するとともに、上側筒状部材の内壁を洗浄し、壁に付着した細胞も同時に回収した。
　回収した細胞の懸濁液を０．４％クエン酸ナトリウム／ＰＢＳ溶液で３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで１０分間室温にて遠心分離し、ペレットの頂部の液体をピペットで取り出し、ペレット中の細胞を３００ｍＭのマンニトール溶液３０ｍＬに再懸濁し、３００×ｇで５分間室温にて遠心分離した。この遠心分離操作は、細胞破片及び血小板を除去し、目的とする細胞を濃縮するためのものである。
　回収した細胞の測定には、スライドへ塗布もしくはウェルへ捕捉した細胞を顕微鏡観察する手法やフローサイトメトリー法などを用いることができる。本実施例１では、分離した細胞を誘電泳動力によって基板上に備えた孔径Φ３０μｍ、深さ３０μｍの保持孔（約１００万個）に捕捉して測定する手法を採用した。
　図５に示した装置を使用して、分離された細胞が目的とするヒト乳がん細胞であることを確認した。図５の装置は、電源３４、電極基板３５及び３６を有し、基板間に電圧を印加することにより細胞３７に誘電泳動力３８を作用させ、保持孔３９内に導入し捕捉するものである（特許第４９１０７１６号公報参照）。分離された細胞懸濁液を、この装置に供して保持孔に捕捉した細胞を蛍光顕微鏡４０で観察した。その結果、保持孔には約４００万個の正常白血球とともに、約２７個のがん細胞が捕捉された（回収率約９０％）。本発明の分離構造体を用いることで、構造体を構成する筒状部材の分離、開口を密閉するキャップの取り外しという簡単な操作により、高い回収率をもって目的とする細胞を分離できた。
　［実施例２］各種がん細胞での検証
　実施例１と同様の操作を行い、がん細胞の分離を行った。分離構造体は、詳細には、筒状部材２は内径Φ１８ｍｍ、縦７０ｍｍ、容量１５ｍＬの円筒状のポリプロピレン製部材である。部材の内面にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をコーティングし、親水化することで細胞等の非特異吸着を防止してある。また筒状部材２の先細り形状部分７の傾斜角度は３０°であり、筒状部材３との連通開口はΦ２ｍｍである。筒状部材３は、内径Φ１０ｍｍ、縦５４ｍｍ、容量２ｍＬのポリプロピレン製部材である。
　図３に模式的に示したように、分離構造体の下側の筒状部材３に、密度が１．０７７ｇ／ｍＬの密度勾配溶液３１（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ　ＰｏＣ　ＡＳ社製、商品名Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）を２ｍＬ注入した（図中下部の白抜き部分が密度勾配溶液で満たした部分である）。詳しくは密度勾配溶液の液面高さが、上側の筒状部材２の連通開口端（分離部）６よりも約１ｍｍ高くなるように（従って液面は、上側筒状部材の内部に位置する）注入した。続いて密度勾配溶液の上に、３ｍＬの血液試料と３ｍＬの生理食塩水の混合液（血液試料と生理食塩水の混合液（重層した混合液の部分））３２を重層した（図中、黒塗部分が重層した混合液の部分である）。なお、血液試料は、インフォームドコンセントを得て取得した健常者血液に約３０個のヒトがん細胞を懸濁した懸濁液である。添加する当該がん細胞はあらかじめ蛍光染色試薬（株式会社同仁化学研究所製、商品名ＣａｌｃｅｉｎＡＭ）で標識している。また、当該がん細胞は、細胞密度が約２×１０５個／ｃｍ２になるように静置培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ　ＥＤＴＡにより細胞をディッシュから剥離し、限界希釈により調整したものである。
　試料注入後、分離構造体の開口をキャップ４（ポリプロピレン製）で密閉し、１１００×ｇで１０分間、室温にて遠心分離した。遠心分離操作により、図４左に示したように、密度勾配溶液と試料の界面（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ液の頂部）３３に細胞は維持された。キャップを取り外すことなく分離構造体を構成する筒状部材２及び３を分離部で分離した後、図４右に示したようにキャップをはずして密閉を開放することで、上側の筒状部材２の連通開口端（分離部）６より密度勾配溶液の一部とその上に維持された細胞を流出させ、下方に設置した５０ｍＬチューブ５０（「チューブ５０」と記載することがある）で回収するとともに、上側筒状部材の内壁を洗浄し、壁に付着した細胞も同時に回収した。
　回収した細胞の懸濁液を０．４％クエン酸ナトリウム／ＰＢＳ溶液で３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで１０分間室温にて遠心分離し、ペレットの頂部の液体をピペットで取り出し、ペレット中の細胞を３００ｍＭのマンニトール溶液３０ｍＬに再懸濁し、３００×ｇで５分間室温にて遠心分離した。この遠心分離操作は、細胞破片及び血小板を除去し、目的とする細胞を濃縮するためのものである。
　回収した細胞の測定には、スライドへ塗布もしくはウェルへ捕捉した細胞を顕微鏡観察する手法やフローサイトメトリー法などを用いることができる。本実施例１では、分離した細胞を誘電泳動力によって基板上に備えた孔径Φ３０μｍ、深さ３０μｍの保持孔（約１００万個）に捕捉して測定する手法を採用した。
　図５に示した装置を使用して、分離された細胞が目的とするがん細胞であることを確認した。図５の装置は、電源３４、電極基板３５及び３６を有し、基板間に電圧を印加することにより細胞３７に誘電泳動力３８を作用させ、保持孔３９内に導入し捕捉するものである（特許第４９１０７１６号公報参照）。分離された細胞懸濁液を、この装置に供して保持孔に捕捉した細胞を蛍光顕微鏡４０で観察した。２種の乳がん細胞（ＳＫＢＲ３，ＭＤＡ－ＭＢ－２３１），２種の非小細胞肺がん（ＰＣ９，Ａ５４９），２種の小細胞肺がん（Ｈ６９，ＳＢＣ－１）の回収率は表１に示すように７４．６～９２．４％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　なお、がん細胞とともに混入する正常白血球は約４００万個であった。本発明の分離構造体を用いることで、構造体を構成する筒状部材の分離、開口を密閉するキャップの取り外しという簡単な操作により、様々な細胞種を高い回収率をもって分離できた。
　［実施例３］構造体の転倒による回収
　試料として、健常者血液に約３０個のヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）を混合させた３ｍＬの懸濁液を用い、実施例１と同様に遠心分離操作を実施して細胞を密度勾配溶液と試料の界面に維持した。遠心分離操作の終了後、キャップ２を取り外し、分離構造体の各筒状部材を分離することなく転倒させて開口から密度勾配溶液の一部とその上に維持された細胞を流出させ、チューブ５０に回収するとともに、上側筒状部材の内壁を洗浄し、壁に付着した細胞も同時に回収した。この際、分離構造体の上側の筒状部材の、連通開口に向かう先細り形状の部分によって、下側の構造体に移動した、主に赤血球を含むペレットが上側の筒状部材側へ逆流することはなかった。
　図５に示した装置を使用して、実施例１と同様に、分離された細胞が目的とするヒト乳がん細胞であることを確認した。その結果、保持孔には約４００万個の正常白血球とともに、約２６個のがん細胞が捕捉された（回収率約８５％）。本発明の分離構造体を用いることで、開口を密閉するキャップの取り外し、構造体の転倒という簡単な操作により、高い回収率をもって目的とする細胞を分離できた。
　［実施例４］凝集法の基本原理
　実施例１と同様に密度勾配溶液の上へ健常者血液３ｍＬに約３０個のがん細胞を混合させた試料と３ｍＬの生理食塩水と７５μＬの結合剤（商標ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ）の混合液を重層し、遠心分離、回収操作を実施した。
　図５に示した装置を使用して、実施例１と同様に、分離された細胞が目的とするがん細胞であることを確認した。２種の乳がん細胞（ＳＫＢＲ３，ＭＤＡ－ＭＢ－２３１），２種の非小細胞肺がん（ＰＣ９，Ａ５４９），２種の小細胞肺がん（Ｈ６９，ＳＢＣ－１）の回収率は表２に示すように７６．８～９１．４％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお、がん細胞とともに混入する正常白血球は約３０万個であった。結合剤で目的外の細胞（赤血球、白血球）を互いに結合することで密度を高くし、目的の細胞（がん細胞）との密度差を大きくしたうえで、本発明の分離構造体を用いた分離を行うことにより、高い回収率と選択性をもって目的とする細胞を分離できた。
　［実施例５］密度差分離における遠心条件の最適化
　実施例３と同様にして、健常者血液に約３０個のヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）を混合させた試料、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を実施した。なお、密度差分離における遠心条件は１１００～３０００×ｇ、３～１０分間、室温にて実施した。遠心分離後、キャップを取り外すことなく分離構造体を構成する筒状部材２及び３を分離部で分離した後、キャップをはずして密閉を開放することで、上側の筒状部材２の連通開口端（分離部）６より密度勾配溶液の一部とその上に維持された細胞を流出させ、下方に設置したチューブ５０で回収するとともに、上側筒状部材の内壁を洗浄し、壁に付着した細胞も同時に回収した。
　回収した細胞の懸濁液を０．４％クエン酸ナトリウム／ＰＢＳ溶液で３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇ、１０分間室温にて遠心分離した。ペレットの頂部の液体をピペットで取り出し、ペレット中の細胞を３００ｍＭのマンニトール溶液３０ｍＬに再懸濁した後、３００×ｇで５分間室温にて遠心分離した。
　図５に示した装置を使用して、実施例１と同様に、分離された細胞が目的とする乳がん細胞であることを確認した。表３に遠心条件とがん細胞回収率の結果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　密度差分離での遠心条件が２０００×ｇ、５分間の場合に、回収率が最大の８８．１％に達し、それ以上に遠心加速度を上昇させると細胞への負荷が大きくなり、回収率は低下した。
　［実施例６］回収操作における遠心条件の最適化
　実施例３と同様にして、健常者血液に約３０個のヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）を混合させた試料、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を実施した。なお、密度差分離における遠心条件は２０００×ｇ、５分間、室温にて実施した。遠心分離後、キャップを取り外すことなく分離構造体を構成する筒状部材２及び３を分離部で分離した後、キャップをはずして密閉を開放することで、上側の筒状部材２の連通開口端（分離部）６より密度勾配溶液の一部とその上に維持された細胞を流出させ、下方に設置したチューブ５０で回収するとともに、上側筒状部材の内壁を洗浄し、壁に付着した細胞も同時に回収した。
　回収した細胞の懸濁液を０．４％クエン酸ナトリウム／ＰＢＳ溶液で３０ｍＬまでメスアップし、３００～９００×ｇ、５～１０分間室温にて遠心分離した。ペレットの頂部の液体をピペットで取り出し、ペレット中の細胞を３００ｍＭのマンニトール溶液３０ｍＬに再懸濁した後、３００×ｇで５分間室温にて遠心分離した。
　図５に示した装置を使用して、実施例１と同様に、分離された細胞が目的とする乳がん細胞であることを確認した。表４に遠心条件とがん細胞回収率の結果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　回収時の遠心条件が３００×ｇ、１０分間の場合に、回収率が最大の８９．２％に達し、遠心加速度３００×ｇで遠心時間１０分未満の場合には十分に細胞が沈降せず、１２分以上になると過度な負荷と経時的な細胞死滅により回収率が低下した。また遠心加速度を９００×ｇ以上にすると細胞への顕著な重力負荷が認められ、回収率は大きく低下した。
　［実施例７］先細り形状の傾斜角度の最適化（密度勾配溶液１．０７７ｇ／ｍＬ）
　実施例３と同様にして、健常者血液に約３０個のヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）を混合させた試料、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を実施した。なお、密度差分離における遠心は２０００×ｇ、５分間、回収における遠心は３００×ｇ、１０分間室温にて実施した。実施例６で使用した分離構造体は、筒状部材２は内径Φ１８ｍｍ、縦７０ｍｍ、容量１５ｍＬの円筒状のポリプロピレン製部材である。部材の内面にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をコーティングし、親水化することで細胞等の非特異吸着を防止してある。また筒状部材２の先細り形状部分７の傾斜角度は３０、５０、または７０°であり、筒状部材３との連通開口はΦ２ｍｍである。筒状部材３は、内径Φ１０ｍｍ、縦５４ｍｍ、容量２ｍＬのポリプロピレン製部材である。
　図５に示した装置を使用して、実施例１と同様に、分離された細胞が目的とする乳がん細胞であることを確認した。筒状部材２の先細り形状部分７の傾斜角度が３０°の場合に、回収率が最大の８６．５％に達した。傾斜角度が大きくなるに従い、筒状部材２側の密度勾配溶液と試料の界面（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ液の頂部）に維持されたがん細胞が筒状部材３側へ移動しやすくなるため、筒状部材２の先細り形状部分７の傾斜角度が５０°で７５％へ、７０°で７３％へと回収率が低下した。
　［実施例８］密度勾配溶液の最適化
　実施例３と同様にして、健常者血液に約３０個のヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）を混合させた試料、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を実施した。なお、密度差分離における遠心は２０００×ｇ、５分間、回収における遠心は３００×ｇ、１０分間室温にて実施した。実施例７では、分離構造体１の筒状部材３に、密度が１．０７７、１．０８２、１．０８４、または１，０９１ｇ／ｍＬの密度勾配溶液を２ｍＬ注入した。
　図５に示した装置を使用して、実施例１と同様に、分離された細胞が目的とする乳がん細胞であることを確認した。表５に密度勾配溶液の密度とがん細胞回収率の結果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　密度勾配溶液の密度の上昇に伴い、がん細胞回収率は向上し、密度が１．０９１ｇ／ｍＬで回収率は９６．９％であった。
　［実施例９］連通開口径の最適化（キャップ密閉で液体保持できる仕様）
　実施例３と同様にして、健常者血液に約３０個のヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）を混合させた試料、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を実施した。実施例９で使用した分離構造体は、筒状部材２は内径Φ１８ｍｍ、縦７０ｍｍ、容量１５ｍＬの円筒状のポリプロピレン製部材である。部材の内面にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をコーティングし、親水化することで細胞等の非特異吸着を防止してある。また筒状部材２の先細り形状の部分７の傾斜角度は７０°であり、筒状部材３との連通開口はΦ２、４、または６ｍｍである。筒状部材３は、内径Φ１０ｍｍ、縦５４ｍｍ、容量２ｍＬのポリプロピレン製部材である。
　遠心分離後、キャップを取り外すことなく分離構造体を構成する筒状部材２及び３を分離部で分離した際、連通開口がΦ２または４ｍｍでは筒状部材２に保持された液体が流出しなかったが、Φ６ｍｍではわずかに流出が認められた。
　図５に示した装置を使用して、実施例１と同様に、分離された細胞が目的とする乳がん細胞であることを確認したところ、連通開口がΦ２、４ｍｍの場合、それぞれ回収率が８６．２％、８５．５％であったのに対し、Φ６ｍｍでは７２．２％と回収率の顕著な低下が認められた。
　［実施例１０］三分割構造体の使用例
　図６に示した態様の分離構造体を使用して、がん細胞の分離を行った。分離構造体は、詳細には、キャップ４９と筒状部材４１、４２、４３から構成される。筒状部材４１は内径Φ２０ｍｍ、縦６０ｍｍ、容量１１ｍＬの円筒状のポリプロピレン製部材である。また筒状部材４１の先細り形状の部分４４の傾斜角度は７０°であり、筒状部材４２との連通開口はΦ２ｍｍである。筒状部材４２は内径Φ１４ｍｍ、縦３０ｍｍ、容量３ｍＬの円筒状のポリプロピレン製部材である。筒状部材４２の先細り形状の部分４５の傾斜角度は３０°であり、筒状部材４３との連通開口はΦ２ｍｍである。筒状部材４３は、内径Φ１４ｍｍ、縦４１ｍｍ、容量２．５ｍＬのポリプロピレン製部材である。なお、部材の内面にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をコーティングし、親水化することで細胞等の非特異吸着を防止してある。
　分離構造体の下側の筒状部材４３には、密度が１．０７７～１．０８６ｇ／ｍＬの密度勾配溶液（下側の筒状部材を満たした部分）４６を２．５ｍＬ注入した（図中下部の白抜き部分が密度勾配溶液で満たした部分である）。続いて、分離構造体の中間の筒状部材（中央）４２（筒状部材４２と記載することがある）に密度が１．０３０～１．０８６ｇ／ｍＬの密度勾配溶液（中央の筒状部材を満たした部分）４７（「密度勾配溶液４７」と記載することがある）を３ｍＬ注入した（図中中間の斜線部分が密度勾配溶液で満たした部分である）。最後に密度勾配溶液４７の上に、健常者血液に約３０個のヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）を混合させた３ｍＬの試料と３ｍＬの生理食塩水、７５μＬの結合剤の混合液（試料、生理食塩水、結合剤）４８（混合液４８と記載することがある）を重層した（図中、黒塗部分が重層した混合液の部分である）。
　試料注入後、分離構造体の開口をキャップ４９（ポリプロピレン製）で密閉し、２０００×ｇで５分間、室温にて遠心分離した。図７に示したように遠心分離後、キャップを取り外すことなく分離構造体を構成する筒状部材４２及び４３を分離部で分離し、続いて筒状部材４１及び４２を分離部で分離した。これにより筒状部材４２の連通開口より密度勾配溶液の一部と筒状部材４２内の細胞のみを流出させ、下方に設置したチューブ５０で回収するとともに、筒状部材４２の内壁を洗浄し、壁に付着した細胞も同時に回収した。最後にキャップをはずして密閉を開放することで、筒状部材４１の連通開口より密度勾配溶液の一部と筒状部材４１内の細胞を流出させ、前記した操作と同様に下方に設置したチューブ５０で回収するとともに、筒状部材４１の内壁を洗浄し、壁に付着した細胞も同時に回収した。
　回収した各々の細胞懸濁液を０．４％クエン酸ナトリウム／ＰＢＳ溶液で３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで１０分間室温にて遠心分離し、ペレットの頂部の液体をピペットで取り出し、ペレット中の細胞を３００ｍＭのマンニトール溶液３０ｍＬに再懸濁し、３００×ｇで５分間室温にて遠心分離した。この遠心分離操作は、細胞破片及び血小板を除去し、目的とする細胞を濃縮するためのものである。
　図５に示した装置を使用して、実施例１と同様に、分離された細胞が目的とする乳がん細胞であることを確認した。表６に筒状部材４２及び４３に注入した密度勾配溶液の密度と各筒状部材からのがん細胞回収率の結果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本発明の分離構造体を用いることで、構造体を構成する各筒状部材の分離、開口を密閉するキャップの取り外しという簡単な操作により、目的とする細胞の種類（密度）毎に、当該細胞を分離することが可能となった。
　［実施例１１］密度遠心分離後画分の磁気ビーズによる二次分離
　試料として、健常者血液に約３０個のがん細胞を混合させた３ｍＬの懸濁液を用い、実施例１と同様に遠心分離操作を実施して細胞を密度勾配溶液と試料の界面に維持した。遠心分離操作の終了後、キャップを取り外すことなく分離構造体を構成する筒状部材を２及び３を分離部で分離した後、図４右に示したようにキャップをはずして密閉を開放することで、上側の筒状部材２の連通開口端（分離部）６より密度勾配溶液の一部とその上に維持された細胞を流出させ、下方に設置したチューブで回収するとともに、上側筒状部材の内壁を洗浄し、壁に付着した細胞も同時に回収した。
　回収した細胞の懸濁液を０．４％クエン酸ナトリウム／ＰＢＳ溶液で３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで１０分間室温にて遠心分離し、ペレットの頂部の液体をピペットで取り出した。ペレットは５００μＬのＰＢＳ溶液に再懸濁し、これに白血球を除去するための抗体磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　ＣＤ４５，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２５μＬ添加した。その後、攪拌しながら２０分、４℃で抗原抗体反応を行った。反応後の容器を磁石に設置することで、容器壁面に抗体磁性粒子と結合した白血球を捕捉して除去すると同時に、がん細胞が含まれる溶液を回収した。回収した細胞懸濁液は３００ｍＭのマンニトール溶液３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで５分間室温にて遠心回収した。
　図５に示した装置を使用して、実施例１と同様に、分離された細胞が目的とするがん細胞であることを確認した。２種の乳がん細胞（ＳＫＢＲ３，ＭＤＡ－ＭＢ－２３１），２種の非小細胞肺がん（ＰＣ９，Ａ５４９），２種の小細胞肺がん（Ｈ６９，ＳＢＣ－１）の回収率は表７に示すように３７．０～８７．３％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　なお、がん細胞とともに混入する正常白血球は約２００万個であった。本発明の分離構造体を用いた分離および抗体磁性粒子を用いた白血球の除去により、高い回収率と選択性をもって目的とする細胞を分離できた。
　［比較例１］
　市販の密度勾配遠心法による血液分離キット（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ　ＰｏＣ　ＡＳ社製、商品名Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ　Ｔｕｂｅ、密度勾配溶液（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）の密度１．０７７ｇ／ｍＬ）を使用して、実施例１で使用した試料からのヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）の分離を実施した。試料をキットに含まれる分離容器の密度勾配溶液の上に重層した後、１１００×ｇで１０分間室温にて遠心分離した。遠心分離後、密度勾配溶液と試料の界面（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ液の頂部）に維持された細胞を、分離容器を転倒して流出させ、チューブ５０に回収するとともに、容器内壁及び分離容器内のフィルターを洗浄し、それらに付着した細胞を同時に回収した。
　回収した細胞の懸濁液を０．４％クエン酸ナトリウム／ＰＢＳ溶液で３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで１０分間室温にて遠心分離し、ペレットの頂部の液体をピペットで取り出し、ペレット中の細胞を３００ｍＭのマンニトール溶液３０ｍＬに再懸濁し、３００×ｇで５分間室温にて遠心分離した。この遠心分離操作は、細胞破片及び血小板を除去し、目的とする細胞を濃縮するためのものである。
　前記遠心分離操作後、ペレットの頂部の液体をピペットで取り出し、ペレット中の細胞を３００ｍＭのマンニトール溶液１ｍＬに再懸濁した。図５に示した装置を使用して、実施例１と同様に、分離された細胞が目的とするヒト乳がん細胞であることを確認した。その結果、保持孔には約４４０万個の正常白血球が捕捉され、がん細胞は約２５個（回収率約８３％）であった。また同様の操作を再度実施した結果、保持孔には約４００万個の正常白血球が捕捉され、がん細胞は約１４個（回収率約４５％）であった。このように操作毎にがん細胞の回収率が大きく変動した。この結果から、上側の筒状部材の連通開口より密度勾配溶液の一部とその上に維持された細胞を流出させる本発明によって、安定して高い回収率でがん細胞を回収できることが分かる。
　［比較例２］
　１１００×ｇでの遠心分離操作の後、密度勾配溶液と試料の界面（密度勾配溶液の頂部）に維持された細胞をピペットで吸引してチューブに回収した以外は実施例１と同様の操作を実施した。その結果、保持孔には約４１０万個の正常白血球が捕捉されたが、がん細胞は約２１個（回収率約７１％）にとどまり、遠心分離操作後にピペットによってがん細胞を吸引する操作により、がん細胞の回収率が低下した。この結果から、上側の筒状部材の連通開口より密度勾配溶液の一部とその上に維持された細胞を流出させる本発明によって、安定して高い回収率でがん細胞を回収できることが分かる。
　本発明の分離構造体を利用した分離方法によれば、操作者の熟練度や成分の密度によらずに、目的の成分を効率的に回収し得る。本発明は、細胞などの成分の分離、濃縮において、広く利用することができる。従って、本発明は、試験研究のみならず、診断や治療などの応用分野においても有用である。
１：分離構造体
２：筒状部材（上側）
３：筒状部材（下側）
４：キャップ
５：底部
６：連通開口端（分離部）
７：筒状部材の先細り形状部分
２１：目的外の成分（細胞等）
２２：目的外の成分に対して特異的に結合する物質
２３：密度を調整するための物質
２４：目的とする成分（細胞等）
３１：密度勾配溶液（密度勾配溶液で満たした部分）
３２：血液試料と生理食塩水の混合液（重層した混合液の部分）
３３：密度勾配溶液と試料の界面
３４：交流電源
３５：上部電極基板
３６：下部電極基板
３７：細胞
３８：誘電泳動力
３９：保持孔
４０：蛍光顕微鏡
４１：筒状部材（上側）
４２：筒状部材（中央）
４３：筒状部材（下側）
４４：先細り形状（上側の筒状部材）
４５：先細り形状（中央の筒状部材）
４６：密度勾配溶液（下側の筒状部材を満たした部分）
４７：密度勾配溶液（中央の筒状部材を満たした部分）
４８：混合液（試料、生理食塩水、結合剤）
４９：キャップ
５０：５０ｍＬチューブ

Claims (2)

  1. 　一端は閉塞して底部を形成し、他端は開口した筒状の構造体と、開口を密閉するキャップからなり、前記構造体が２以上の筒状部材より構成され、分離部にて分離可能であることを特徴とする、分離構造体。
  2. 　液体試料から目的とする成分を分離する方法であって、密度勾配溶液を底部から分離部近傍まで満たし、試料を重層し、かつ、キャップで開口を密閉した状態の請求項１に記載の分離構造体を使用して遠心分離する工程と、遠心分離後、開口部の密閉状態を維持したまま前記分離構造体を分離部にて分離し、目的とする成分を含む分画を回収する工程からなる、分離方法。
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