JP2020076762A - 細胞に結合可能な担体の製造方法 - Google Patents
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
担体が有する官能基とブロッキング剤が有する官能基とを静電相互作用させる工程を含む、担体をブロッキング剤でブロッキングする方法であって、
ブロッキング剤または担体が有する官能基が、水中におけるpKa値5以下の官能基である、方法である。
(1)血液試料中に含まれる赤血球を破砕または除去する工程
(2)前記(1)の工程後の溶液から、前記第七の態様に記載の方法で製造した白血球に結合可能な担体を用いて、白血球を除去する工程、
(3)(2)の工程後の溶液に含まれる希少細胞を光学的に検出する工程
さらに本発明の第九の態様は、採取手段で前記第八の態様に記載の方法で検出した希少細胞を採取する工程をさらに含む、血液試料中に含まれる希少細胞の採取方法である。
血液試料中に含まれる赤血球を破砕(溶血)または除去する工程と、
前記赤血球の破砕/除去工程後の溶液から、本発明の方法で製造した白血球に結合可能な担体を用いて、白血球を除去する工程と、
白血球除去工程後の溶液に含まれる希少細胞を光学的に検出する工程と、
を含む方法で行なえばよい。
(1) BSA修飾磁性粒子の作製(その1)
(1−1)表面にカルボキシ基を有した磁性粒子溶液(Magnosphere MS300/Carboxyl、1.0%スラリー、JSRライフサイエンス社製)450μLを0.01M MES(2−Morpholinoethanesulfonic acid)バッファー(pH6.0)550μLに添加した。
[a]1.8%(w/v)タンパク質低吸着ポリマー(Blockmaster CE510、分子量5000、JSRライフサイエンス社製)を含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)
[b]1.2%(w/v) Blockmaster CE510を含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)
[c]0.6%(w/v) Blockmaster CE510を含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)
[d]0.2%(w/v) Blockmaster CE510を含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)
[e]1.8%(w/v)タンパク質低吸着ポリマー(Blockmaster CE210、分子量2000、JSRライフサイエンス社製)を含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)
[f]0.9%(w/v) Blockmaster CE210を含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)
[g]0.45%(w/v) Blockmaster CE210を含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)
(1−7)ブロッキング終了後、以下に示すいずれかの保存液を用いてBSA修飾磁性粒子を保存した。保存は以下に示すいずれかの保存液1mLで1回洗浄後、当該保存液184μLで再懸濁した。
[a]から[d]0.2%(w/v) Blockmaster CE510を含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)
[e]から[g]0.2%(w/v) Blockmaster CE210を含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)
(2)BSA修飾磁性粒子への非特異吸着の検討
(2−1)以下に示す方法により、本検討に用いる試料を調製した。
(2−1−1)インフォームドコンセントを取得した健常者血液3mLに安定化剤0.45mLを添加し、室温で10分以上放置した。なお前記安定化剤は、イミダゾリジニル尿素2.3g、分子量6000のポリエチレングリコール(PEG)2.3g、およびエチレンジアミン四酢酸(EDTA)30mgを、溶液として30mLになるよう、超純水で溶解することで調製した。
(2−1−2)前記放置後の試料に対して、0.9%(w/v)塩化アンモニウムと0.1%(w/v)炭酸水素カリウムとを含む溶血液で90mLまでメスアップ後、900×gで10分間、25℃で遠心分離した。当該操作により赤血球が破壊(溶血)される。(2−1−3)遠心後の上清を除去した後、細胞を含むペレットを、ポリエチレングリコールを結合したBSA(PEG−BSA)(BSAとして0.1%(w/v))を含むPBS(リン酸緩衝生理食塩水)30mLで再懸濁した。なお前記PEG−BSAは、一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がN−ヒドロオキシスクシンイミドエステル基である、分子量5000のポリエチレングリコール(mPEG−NHS)と、ウシ血清アルブミン(BSA)(300mg、0.3mmol)とを、炭酸水素ナトリウム緩衝液(0.1M、15mL)に溶解させ、当該溶液を25℃近傍で3時間撹拌し、分画分子量10000の透析膜を用いて、純水への溶液置換を3日間行なうことで調製した。なお前記調製の際、mPEG−NHSとBSAとのモル比(mPEG−NHS/BSA)を2となるようにした。
(2−1−4)再懸濁液を600×gで5分間、25℃で遠心分離後、上清を除去し、PEG−BSA(BSAとして0.1%(w/v))を含むPBSで懸濁することで、本検討に用いる試料を得た。試料中に含まれる白血球数は、白血球数算定用染色液(チュルク染色液、ナカライテスク社製)を用いて算出した。
(1)BSA修飾磁性粒子の作製(その2)
(1−1)実施例1の(1−1)から(1−3)に記載の方法で調製したEDCを結合させた磁性粒子を0.01M MESバッファー1mLで1回洗浄し、0.01M MESバッファー180μLに再懸濁後、10μg/100μLウシ血清アルブミン(BSA)水溶液20μLを添加し、37℃で3時間振とうすることでEDCを介してBSAと磁性粒子とを共有結合させた(すなわち磁性粒子にBSAを修飾させた)。
[h]2.0%(w/v) BSAを含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)(磁性粒子にBSAが物理吸着することでブロッキング)
[i]1.8%(w/v) Blockmaster CE510を含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)(磁性粒子に残存しているEDCがTris−HClバッファーによりヒドロキシ基に変換され、当該ヒドロキシ基とCE510が有するアミノ基との静電相互作用によりブロッキング)
[j]1.8%(w/v) Blockmaster CE510および2.0%(w/v)BSAを含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)(前記[h]と[i]とが合わさったブロッキング)
[k]1.8%(w/v) Blockmaster CE510を含む0.01M MESバッファー(磁性粒子に残存しているEDCとCE510が有するアミノ基との共有結合によりブロッキング)
[l]0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)(ブロッキングなし)
(1−3)ブロッキング終了後、以下に示すいずれかの保存液を用いてBSA修飾磁性粒子を保存した。保存は以下に示すいずれかの保存液1mLで1回洗浄後、当該保存液184μLで再懸濁した。
[h]0.2%(w/v) BSAを含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)
[i]から[k]0.2%(w/v) Blockmaster CE510を含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)
[l]0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)
(2)BSA修飾磁性粒子への非特異吸着の検討
実施例1(2−1)に記載の方法で調製した試料を、実施例1(2−2)から(2−4)に記載と同様な方法で白血球の残存率を算出した。
(1)実施例1(1−1)から(1−3)に記載の方法で作製したEDCを結合させた磁性粒子を、0.01M MESバッファー1mLで1回洗浄し、MESバッファー180μLに再懸濁後、白血球が有する表面抗原であるCD15に対する抗体(IgM、BioLegend社製)を2μg(10μg/100μL水溶液として20μL)を添加し、37℃で3時間振とうすることでEDCを介して前記抗体と磁性粒子とを共有結合させた(すなわち磁性粒子に前記抗体を修飾させた)。
(1)実施例2(1)に記載の方法で磁性粒子に抗CD15抗体を修飾させた後、1.8%(w/v) Blockmaster CE510および2.0%(w/v)BSAを含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)1mLで2回洗浄(本操作により磁性粒子に残存したEDCはヒドロキシ基に変換される)後、当該溶液500μLで再懸濁し、37℃で一晩(17から24時間)振とうすることでブロッキングを行なった。
実施例2(1)で添加する抗体として、白血球が有する表面抗原であるCD45に対する抗体(IgG、Miltenyi Biotech社製)を20μg(100μg/100μL水溶液として20μL)を、実施例2(3)でブロッキングに用いる溶液として、0.9%(w/v) Blockmaster CE210(タンパク質低吸着ポリマー、JSRライフサイエンス社製)を含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)を、実施例2(4)で用いる保存液として、0.2%(w/v) Blockmaster CE210を含む0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)を、それぞれ用いた以外は、実施例2と同様の方法で抗CD45抗体修飾磁性粒子を作製し、白血球の残存率を算出した。
実施例2(1)で添加する抗体として、実施例3で用いた抗CD45抗体(IgG、Miltenyi Biotech社製)20μg(100μg/100μL水溶液として20μL)を用いた以外は、実施例2と同様の方法で抗CD45抗体修飾磁性粒子を作製し、白血球の残存率を算出した。
(1)ヒト肺がん細胞(PC9細胞)を、5%CO2環境下、10%(v/v)FBS(ウシ胎児血清)を含むRPMI−1640培地を用いて37℃で24から96時間培養後、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて培地から細胞を剥離した。
磁性粒子として実施例2で作製した抗CD15抗体修飾磁性粒子を用いた以外は、実施例5と同様の方法で、PC9細胞の残存率を算出した。
(1)ヒト肺がん細胞(PC9細胞)を、5%CO2環境下、10%(v/v)FBS(ウシ胎児血清)を含むRPMI−1640培地を用いて37℃で24から96時間培養後、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて培地から細胞を剥離し、蛍光染色色素(CFSE[5− or 6−(N−Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3’,6’−diacetate]、同仁化学研究所社製)で標識した。
[A]抗CD45抗体修飾磁性粒子(実施例3)1.8×108個
[B]抗CD45抗体修飾磁性粒子(実施例3)2.7×108個
[C]抗CD45抗体修飾磁性粒子(実施例3)1.8×108個および抗CD15抗体修飾磁性粒子(実施例2)1.2×108個
[D]抗CD45抗体修飾磁性粒子(実施例3)2.7×108個および抗CD15抗体修飾磁性粒子(実施例2)0.12×108個
[E]抗CD45抗体修飾磁性粒子(実施例3)2.7×108個および抗CD15抗体修飾磁性粒子(実施例2)0.24×108個
[F]抗CD45抗体修飾磁性粒子(実施例3)2.7×108個および抗CD15抗体修飾磁性粒子(実施例2)0.60×108個
(6)(5)で白血球を除去したPC9細胞を含む懸濁液を、実施例1(2−1−3)に記載の方法で調製したPEG−BSA(BSAとして0.1%(w/v))および280mMスクロースを含む溶液30mLで再懸濁した。
(1)実施例1(1−1)から(1−3)に記載の方法で作製したEDCを結合させた磁性粒子を、0.01M MESバッファー(pH6.0)1mLで1回洗浄し、MESバッファー(pH6.0)200μLに再懸濁後、500mMタウリンを含む0.01M MESバッファー(pH6.0)50μLを添加し、37℃で1時間振とうすることで、タウリンと磁性粒子とを共有結合させ、磁性粒子表面のカルボキシ基をスルホ基に変換した。
表面にカルボキシ基を有した磁性粒子溶液(Magnosphere MS300/Carboxyl、1.0%スラリー、JSRライフサイエンス社製)450μLを、超純水1mLで3回洗浄を行ない、2×109個/mLの濃度となるよう超純水に再懸濁後、実施例8(3)と同様な方法でゼータ電位を測定した。
(1)実施例1(1−1)から(1−3)に記載の方法で作製したEDCを結合させた磁性粒子を、0.1M Tris−HClバッファー(pH8.0)1mLで1回洗浄し、Tris−HClバッファー(pH8.0)200μLに再懸濁後、37℃で1時間振とうすることで、Trisと磁性粒子とを共有結合させ、磁性粒子表面のカルボキシ基をヒドロキシ基に変換した。
11:遮光部材
12:絶縁体
11a・12a:貫通孔
20:スペーサー
21:導入口
22:排出口
23:貫通部
31・32:電極基板
40:導線
50:信号発生器
60:保持部
70:細胞
Claims (9)
- 担体が有する官能基とブロッキング剤が有する官能基とを静電相互作用させる工程を含む、担体をブロッキング剤でブロッキングする方法であって、
ブロッキング剤または担体が有する官能基が、水中におけるpKa値5以下の官能基である、方法。 - 担体が有する官能基を用いて標的細胞に結合可能な物質を修飾させる工程と、残存した前記官能基を請求項1に記載の方法によりブロッキングする工程とを含む、標的細胞に結合可能な担体を製造する方法。
- ブロッキング剤または担体が有する官能基がスルホ基である、請求項1または2に記載の方法。
- 標的細胞に結合可能な物質が標的細胞が有する表面抗原に特異的に結合可能な抗体である、請求項2または3に記載の方法。
- ブロッキング剤がポリエチレングリコールおよび担体が有する官能基と静電相互作用可能な官能基を少なくとも含む化合物である、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 担体が磁性粒子である、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 標的細胞が白血球であり、標的細胞に結合可能な物質が白血球が有する表面抗原に特異的に結合可能な抗体である、請求項4から6のいずれかに記載の方法。
- 以下の(1)から(3)に示す工程を含む、血液試料中に含まれる希少細胞の検出方法。
(1)血液試料中に含まれる赤血球を破砕または除去する工程
(2)前記(1)の工程後の溶液から、請求項7に記載の方法で製造した白血球に結合可能な担体を用いて、白血球を除去する工程、
(3)(2)の工程後の溶液に含まれる希少細胞を光学的に検出する工程 - 採取手段で請求項8に記載の方法で検出した希少細胞を回収する工程をさらに含む、血液試料中に含まれる希少細胞の採取方法。
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CN112114157A (zh) * | 2020-09-22 | 2020-12-22 | 天津大学 | 基于细胞代替荧光编码微球检测hcg的方法 |
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CN112114157A (zh) * | 2020-09-22 | 2020-12-22 | 天津大学 | 基于细胞代替荧光编码微球检测hcg的方法 |
CN112114157B (zh) * | 2020-09-22 | 2024-03-15 | 天津大学 | 基于细胞代替荧光编码微球检测hcg的方法 |
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