KR101750790B1 - 배양세포의 세포간 분리방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 배양세포의 세포간 분리방법에 관한 것으로, 배양상태에서 배양된 세포를 분리하는 방법에 있어서, 제1수용공간과, 제1수용공간의 액체 내에서 복수의 세포가 서로 연결된 상태로 존재하는 세포 부유액과, 상기 제1수용공간과 밀폐되어 연결되고 평균 지름 5㎛ ∼ 300㎛의 관통공을 1이상 갖는 세포 분할부재가 장착된 필터용기와, 상기 필터용기와 밀폐되어 연결되는 제2수용공간에 있어, 상기 세포 부유액을 제1수용공간에서 필터를 거쳐 제2수용공간으로 이동시킴으로써 필터의 고정된 저항부와 부딪히면서 세포간의 연결이 피동적, 기계적으로 분리되도록 하는 것을 특징으로 하는 배양세포의 세포간 분리방법을 제공한다.

Description

배양세포의 세포간 분리방법 {Separating method of cultured cells}
본 발명은 배양된 세포의 세포간 분리방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 배양으로 얻은 세포에 대해서 수류를 이용하여 세포간 분리하는 방법에 관한 것이다.
동물세포는 배양시 데스모좀과 같은 세포들간의 결합으로 서로 강하게 결합하는 경우가 있다. 세포간의 결합은 세포질에서 위족과 같은 돌기가 자라 상대 세포의 돌기와 결합하는 방식으로 시작하여 결합강도가 서서히 증가하게 된다.
이렇게 서로서로 결합되어 있는 세포들을 분리하기 위한 기존 방법들을 살펴보면 다음과 같다.
먼저, 트립신(trypsin)과 같은 단백질 용해제를 사용하여 상기 세포질 돌기를 제거하는 방법이 있다. 그러나 이는 세포 독성이 많아 세포의 표면특성까지 제거하는 단점이 있다.
둘째로, 물의 난류 속에 위치시켜 물의 전단력을 이용하여 분리하는 방법이 있다. 그러나, 이 방법은 순수한 물의 전단력으로 10㎛ 정도의 세포가 서로 다른 방향의 관성질량을 같도록 하기까지 물의 난류에 극대화된 다양성을 부여하거나 유속이 심한 상태에서 마찰을 유발시켜야 한다. 또한 층화된 수류의 경계가 10㎛ 단위의 micro fluid로 구성되어야 하므로 구현이 어려울 뿐만 아니라 유속차가 크지 않을 경우 여러 번 반복해야 하는 문제가 있다. 이로 인해 세포가 파괴되는 확률이 높아짐과 동시에 분리율이 극히 낮은 문제점이 있다.
또한, 세포를 분리하기 위해서 수류를 이용하는 방법도 있었다.
도 2 및 도 3은 종래 수류 이용법을 이용하여 세포분리하는 개략도를 나타낸 것이다.
종래의 수류 이용법 첫번째는 중심 고속 이동 구간에서 세포가 뭉쳐서 이동하고 저항 면에서는 속도차이에 의한 동일 방향 분리가 일어난다. (도 2 참조)
강한 유속으로 통과하는 다른 방식에서는 수류를 미세하게 가르기 위한 부재가 존재하지 않고 단지 통과하는 관의 내벽에서 유발되는 저항에만 의존하였으므로 유속이 빠른 중심 관류에서는 아무런 세포 분리 현상이 일어나지 않는 문제가 있음에도 단지 여러번 반복하여 이를 극복하려 한 경우이고, 세포군이 통과할 때 세포 사이에 놓인 저항체가 세포간의 연결을 효과적으로 절단하는데 세포군 외부에서의 서로 다른 저항을 이용했다는 점에서 비효율적이었다.
종래의 수류 이용법 두번째는 수조와 같은 원통형의 용기에서 난류를 만드는 방법이다.(도 3 참조)
수조의 벽쪽은 안정적인 층류가 형성되어 세포가 회전만하고 세포 사이의 속도차이를 크게 줄 수 없어서 비효율 적인 문제점이 있었다. 난류쪽에서 분리되는 세포는 불필요한 힘을 받거나 균등한 확률로 세포를 접하게 하기 어려움이 있었다. 또한 난류 적용 횟수의 편차가 큰 문제점이 있었다. 회전 수류에서 여러 가지 종류의 저항체가 회전하는 경우 의도된 저항 유발이라는 측면에서 좀더 효율적이지만, 시료의 처리 확률을 균일하게 적용하는 단 방향 수류가 아니라는 점에서 세포당 처리 확률을 균일화 하기 어려운 문제점이 있다.
액상 시료를 적절하게 분쇄하거나 혼합하기 위해서는 line mixer, homo mixer등과 같이 시료의 일부만을 통과시키면서 처리하고 한번 처리된 시료는 처리 장치 다른 편에 모이도록 전처리 시료와 처리후 시료가 구분된 공간에 위치하도록 하여야 한다.
위에서 살펴본 바와 같이 배양된 세포를 배양된 세포를 분리하는 데 있어서 외부 저항을 최소한으로 받도록 하여 세포손상을 최소한으로 해야할 필요성이 있었다.
상기 문제점을 해결하기 위해 본 발명의 목적은 세포의 손상을 최소한으로 하면서 배양된 세포를 분리하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 줄기세포를 분리하는 데 있어서 간단하면서도 외부로부터 충격으로 세포의 손상 받는 데 최소한으로 줄이면서 세포를 분리할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 배양상태에서 배양된 세포를 분리하는 방법에 있어서, 제1수용공간과, 제1수용공간의 액체 내에서 복수의 세포가 서로 연결된 상태로 존재하는 세포 부유액과, 상기 제1수용공간과 밀폐되어 연결되고 평균 지름 5㎛ ∼ 300㎛의 관통공을 1이상 갖는 세포 분할부재가 장착된 필터용기와, 상기 필터용기와 밀폐되어 연결되는 제2수용공간에 있어, 상기 세포 부유액을 제1수용공간에서 필터를 거쳐 제2수용공간으로 이동시킴으로써 필터의 고정된 저항부와 부딪히면서 세포간의 연결이 피동적, 기계적으로 분리되도록 하는 것을 특징으로 하는 배양세포의 세포간 분리방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 세포 분할부재 통과를 복수로 하기 위해 제2수용공간에서 다시 제1수용공간으로 이동시키는 과정을 1회 이상 포함하는 배양세포의 세포간 분리방법을 제공한다.
본 발명은 상기 세포 분할부재 통과를 복수로 하기 위해 상기 필터용기 내에 복수의 세포 분할부재가 형성된 것을 특징으로 하는 배양세포의 세포간 분리방법을 제공한다.
본 발명은 상기 세포 분할부재 통과를 복수로 하기 위해 제2필터용기를 추가하되, 상기 제2필터용기에 밀폐 연결되는 제3수용공간이 형성되는 것을 특징으로 하는 배양세포의 세포간 분리방법을 제공한다.
본 발명의 상기 세포 분할부재는 직조된 메쉬형, 타공판형, 다중블레이드(라디에이터, 아가미)형 중 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 배양세포의 세포간 분리방법을 제공한다.
본 발명의 상기 필터용기는 용량을 조절할 수 있는 밀폐된 용기인 것을 특징으로 하는 배양세포의 세포간 분리방법.
본 발명의 상기 필터용기는 가압을 통해 이동할 수 있는 관을 포함하는 것을 특징으로 하는 배양세포의 세포간 분리방법을 제공한다.
본 발명에 따른 세포간 분리방법은 세포의 손상을 최소한으로 하면서 배양된 세포를 분리하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 세포간 분리방법은 배양된 세포를 분리하는 데 있어서 간단하면서도 외부로부터 충격을 최소한으로 줄이면서 세포를 분리할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 배양상태에서 세포간 결합을 나타낸 그림이다.
도 2 및 도 3은 종래 수류 이용법을 이용하여 세포분리하는 개략도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 세포 분리의 개략도를 나타낸 것이다.
이하 본 발명에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 우선, 도면들 중, 동일한 구성요소 또는 부품들은 가능한 한 동일한 참조부호를 나타내고 있음에 유의하여야 한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 약, 실질적으로 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 표현된 "수류"는 세포배양액을 포함한 액체가 수용공간 내에서 이동하는 상태는 나타낸 것이다.
본 발명은 배양상태에서 배양된 세포를 분리하는 방법에 있어서, 제1수용공간과, 제1수용공간의 액체 내에서 복수의 세포가 서로 연결된 상태로 존재하는 세포 부유액과, 상기 제1수용공간과 밀폐되어 연결되고 평균 지름 5㎛ ∼ 300㎛의 관통공을 1이상 갖는 세포 분할부재가 장착된 필터용기와, 상기 필터용기와 밀폐되어 연결되는 제2수용공간에 있어, 상기 세포 부유액을 제1수용공간에서 필터를 거쳐 제2수용공간으로 이동시킴으로써 필터의 고정된 저항부와 부딪히면서 세포간의 연결이 피동적, 기계적으로 분리되도록 하는 것을 특징으로 한다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 세포 분리의 개략도를 나타낸 것이다.
본 발명은 배양상태에서 배양된 세포를 분리하는 방법으로서, 보다 상세하게는 동일한 방향의 수류에 포함되고 서로 연결된 배양세포(10)를 포함한 세포 부유액이 수류 방향에 직각으로 위치한 고정된 고체의 세포 분할부재(121)를 통과하면서 세포 간에 서로 멀어지는 방향의 마찰 저항을 유발하도록 구성하였다.
즉, 피동적으로 작용하는 저항날인 세포 분할부재(121)를 다수 배치한 공간에서의 수류는 자연스럽게 수류가 미세하게 분할되는 효과를 보이지만 기본적으로 수류가 이동하는 방향은 같으므로 단지 세포의 사이를 멀어지게 하는데 필요한 최소한의 마찰만을 유발하게 구성된다는 점에서 수류를 이용하되 최소한의 세포 손상으로 세포분리를 할 수 있도록 구성한 것이다.
본 발명에 따른 배양세포의 세포간 분리방법은 배양된 세포를 포함한 세포 배양액을 일정수용공간 내에서 큰 마찰이나 난류를 거의 발생시키지 않고 세포간에 결합된 결합부위를 제거하는 방법을 나타낸 것이다. 배양세포(10)간의 결합은 세포질에서 위족과 같은 돌기가 자라 다른 세포의 돌기와 결합하는 방식으로 결합하게 된다. 이에 따라 약간의 외부충격으로 결합하고 있던 돌기를 이탈시켜 주면 세포간 분리가 일어나게 된다.
배양세포(10)의 세포간 분리를 위해서 세포가 포함된 세포배양액을 수용공간내에서 흐름을 일으키고 중간에 저항을 일으킬 수 있는 흐름방향과 직각으로 세포 분할부재(121)를 형성하여 세포결합간에 분리를 자연스럽게 유도할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따라 배양 세포의 분리방법은 제1수용공간(110)과, 제1수용공간(110)의 액체 내에서 복수의 세포가 서로 연결된 상태로 존재하는 세포 부유액과, 상기 제1수용공간(110)과 밀폐되어 연결되고 5㎛ ∼ 300㎛ 의 복수의 관통공을 갖는 세포 분할부재(121)가 장착된 필터용기(120)와, 상기 필터용기(120)와 밀폐되어 연결되는 제2수용공간(130)에 있어, 상기 세포 부유액을 제1수용공간(110)에서 세포 분할부재(121)를 거쳐 제2수용공간(130)으로 이동시킴으로써 세포 분할부재(121)와 부딪히면서 세포간의 연결이 피동적, 기계적으로 분리되도록 할 수 있다.
본 발명의 배양세포 분리를 위해서 제1수용공간(110), 상기 제1수용공간(110)과 밀폐되어 연결되어 복수의 관통공을 갖는 분할부재가 장착된 필터용기(120)가 있으며 상기 필터용기(120)와 밀폐되어 연결되는 제2수용공간(130)으로 구성될 수 있다.
상기 제1수용공간(110)은 배양한 세포를 수용할 수 있는 공간으로 세포배양액을 넣고 수류를 일으키게 할 수 있다. 상기 제1수용공간(110)에서 세포 배양액을 수용시켜 외력에 의한 배양세포액에 수류를 일으켜 이동하게 할 수 있다.
세포 배양액을 일정방향으로 흐르게 하는 수류는 속도가 전체 공간에서 일정하도록 하여 흐름이 있는 동안 난류등이 발생하지 않도록 한다. 이를 위해서는 제1수용공간(110), 필터용기(120), 제2수용공간(130)의 단면적이 일정한 것이 바람직하다.
또한, 제1수용공간(110)은 특별히 제한되는 것은 아니나, 수류가 일정하도록 단면적이 일정한 것이 바람직하다.
상기 세포 분할부재(121)는 제1수용공간(110)에서 흐르는 세포배양액의 배양세포(10)를 분리하기 위한 용도로써 피동적으로 작용하는 분할부재가 다수 배치된 공간으로 이동시 마찰저항을 일으키도록 하여 자연적으로 분할되는 효과를 갖게 한다.
상기 세포 분할부재(121)는 5 ~ 300㎛의 관통공으로 형성되어 배양세포(10)가 이동시 제1수용공간(110)으로부터 제2수용공간(130)으로 이동시 관통공을 통해 세포가 분할될 수 있도록 하기 위함이다.
본 발명의 장점 중 하나는 난류가 거의 발생하지 않는다는 점이다. 제1수용공간(110), 필터용기(120) 및 제2수용공간(130)에서 세포배양액이 이동할 때 단면적이 동일하여 난류를 최소한으로 발생시키기 때문에 외부 충격에 의한 세포 손상을 최소한으로 할 수 있다.
또한, 상기 세포 분할부재(121)는 메쉬형으로 형성되어 상당히 많은 수의 관통공을 형성할 수도 있다. 상기 세포 분할부재(121)는 상기 메쉬형뿐만 아니라 타공판형, 다중블레이드형 등으로 이루어진 군에서 하나 이상의 형태로 형성될 수 있다.
한편, 상기 세포 분할부재(121)의 통과를 수회 반복하도록 할 수 있다. 이를 위해서 제2수용공간(130)으로 이동한 세포배양액을 다시 제1수용공간(110)으로 이동시켜 세포 분할부재(121)를 통과하도록 하여 복수회 반복할 수 있다.
또는 세포 분할부재(121)를 제2수용공간(130) 말단부에 형성하여 세포 분할부재(121) 장착된 필터용기(120)가 추가적으로 형성하고 제3수용공간이 형성될 수도 있다. 제2수용공간(130)과 제3수용공간 사이에 세포 분할부재(121)가 형성됨으로 인해 세포분리를 더욱 용이하게 할 수 있다.
또는 선택적으로 필터용기(120)내에 세포 분할부재(121)가 2이상 형성되어 세포 분리가 복수회로 이루어지도록 할 수도 있다.
또한, 상기 필터용기(120)는 용량을 조절할 수 있는 밀폐된 용기일 수 있다. 상기 밀폐된 용기의 예로는 의료용 주사기일 수 있다. 상기 의료용 주사기는 외부와 밀폐된 용기로 주사바늘을 통해 세포가 이동하며, 주사바늘의 주입부는 세포 분할부재(121) 역할을 할 수 있다.
또한, 상기 필터용기(120)는 가압을 통해 이동할 수 있는 관일 수 있다. 상기 가압을 통해 이동할 수 있는 관은 펌프일 수 있다. 펌프와 같은 기구를 이용하여 외부에서 압력을 가하여 배양세포(10)를 강제로 이동시키며, 관내에서는 세포 분할부재(121)를 형성하여 펌프의 작동으로 인해 배양세포(10)가 이동시 관을 통해 세포간 분리가 이루어지도록 할 수 있다.
한편, 본 발명에 사용되는 배양세포는 배양기 내부 표면에서 성장하여 이를 수집하려면 성장한 배양세포(10)를 외부적인 힘을 가하여 긁어내야 한다. 즉, 기계적으로 긁어 내어 뭉쳐진 상태인 배양세포(10)를 이용할 수 있다. 이를 세포 분할부재(121)를 이용하여 배양세포(10)를 분리하는 것이다.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.
10 : 배양세포 110 : 제1수용공간
120 : 필터용기 121 : 세포 분할부재
130 : 제2수용공간

Claims (7)

  1. 배양상태에서 배양된 세포를 분리하는 방법에 있어서,
    제1수용공간과,
    제1수용공간의 액체 내에서 복수의 세포가 서로 연결된 상태로 존재하는 세포 부유액과,
    상기 제1수용공간과 밀폐되어 연결되고 평균 지름 5㎛ ∼ 300㎛의 관통공을 1이상 갖는 세포 분할부재가 장착된 필터용기와,
    상기 필터용기와 밀폐되어 연결되는 제2수용공간에 있어,
    상기 제1수용공간, 필터용기 및 제2수용공간은 차례로 수평결합되고, 단면적이 동일한 원통형모양을 갖고,
    상기 세포 부유액을 제1수용공간에서 필터를 거쳐 제2수용공간으로 수평으로 이동시킬때 압력을 가해 이동속도를 조절할 수 있고,
    상기 세포 부유액에 존재하는 서로 연결된 복수의 세포가 수평 이동방향에 수직으로 결합된 상기 필터용기에 장착된 세포 분할부재와 부딪히면서 세포 간의 연결이 피동적, 기계적으로 분리되도록 하는 것을 특징으로 하는 배양세포의 세포간 분리방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포 분할부재 통과를 복수로 하기 위해 제2수용공간에서 다시 제1수용공간으로 이동시키는 과정을 1회 이상 포함하는 배양세포의 세포간 분리방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포 분할부재 통과를 복수로 하기 위해 상기 필터용기 내에 복수의 세포 분할부재가 형성된 것을 특징으로 하는 배양세포의 세포간 분리방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포 분할부재 통과를 복수로 하기 위해 제2필터용기를 추가하되, 상기 제2필터용기에 밀폐 연결되는 제3수용공간이 형성되는 것을 특징으로 하는 배양세포의 세포간 분리방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 분할부재는 직조된 메쉬형, 타공판형, 다중블레이드형 중 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 배양세포의 세포간 분리방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 필터용기는 용량을 조절할 수 있는 밀폐된 용기인 것을 특징으로 하는 배양세포의 세포간 분리방법.
  7. 삭제
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