CN110777078B - 一种序列化灌注式微流体装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种序列化灌注式微流体装置。包括由上至下依次设置的板状的灌注侧本体、板状的中间层本体和板状的细胞侧本体；灌注侧本体上开设有灌注侧流道和灌注侧入口，中间层体上开设有三个以上的膜窗，膜窗内填充有微滤膜；细胞侧本体上分别开设有依次连通的细胞侧入口、细胞侧流道和细胞侧出口；灌注侧入口和细胞侧出口上下对应位于装置的同一侧，细胞侧入口位于装置的另一侧；工作时，向灌注侧入口注入灌注液，同时向细胞侧入口注入细胞悬浮液；灌注液经膜窗单向流动进入细胞侧流道，与细胞悬浮液混合，由细胞侧出口排出。本装置能避免扩散法或透析法等连续式处理系统中细胞内外渗透压差积累效应，从而更好地适应高通量处理需求。

Description

一种序列化灌注式微流体装置

技术领域

本发明涉及生物医学领域，用于细胞悬浮液处理，特别用于向细胞悬浮液添加或去除低温保护剂。

背景技术

生物医学中常涉及改变细胞悬浮液某种成分的浓度。由于细胞膜具有选择性通过特点，外部溶质浓度的变化会导致细胞内外的渗透压差，引起细胞的渗透性体积变化。特别当这种变化过快时，常会引起细胞的渗透性损伤。这一现象在低温保存的添加或去除低温保护剂过程中尤为明显。

低温保存广泛应用于稀有血型红细胞、干细胞、免疫细胞等生命材料的长期保存。为了避免或减小低温损伤，常常在低温保存过程添加低温保护剂，以及在复苏冷冻细胞的过程中去除低温保护剂。现有的低温保存剂处理以手工操作为主，包括单步法和多步法，即通过单步或多步将置换液注入细胞悬浮液，从而改变其中低温保护剂的浓度。单步法简单易行，但是细胞所处的渗透压环境变化过快，容易引起严重的渗透性损伤；多步法可有效降低损伤，但是过程繁琐，费时费力。例如冰冻解冻红细胞的去甘油（低温保护剂）操作，一个单位的红细胞的操作耗时长达数个小时。

为解决手工低温保护剂处理方法的问题，市面上出现了一些自动化处理仪器。这些仪器的应用可以在一定程度上可以弥补手工操作的不足，但从原理上与手工法无显著差异，仍未解决处理效率和细胞安全性的冲突问题。另一方面，现有自动化设备都设计用于处理大体积对象，对干细胞、免疫细胞等小体积对象处理困难。

微流控的方法有望更好地适应小体积对象的处理需求。现有的微流控方法通常为扩散式，细胞悬浮液和置换在微流通中并行流动，通过界面间的质量扩散实现改变细胞悬浮液中的低温保护剂浓度。但这种方法传质效率差，处理通量低，如Song等采用具有S形流道的微流控处理系统，处理通量仅为2微升/分钟(Lab on a Chip, 2009, 9, 1874–1881)。而且这种方法对细胞液与置换液间的界面稳定性要求极高，否则将在局部产生渗透压突变。另一种微流控方法应用了透析原理，即通过微流体在半透膜两侧的透析作用实现低温保护剂处理。这种方法通过半透膜可以实现更加稳定的流动界面，能避免局部渗透压突变风险，但半透膜同时也增加了传质阻力，处理效率也非常有限。特别随着处理过程的进行，破碎的细胞及谈话的蛋白将阻塞膜孔，处理效率进一步将降低。例如Lusianti和Higgins介绍的膜式微流控系统，仿真和实验都证明难以实现充分的低温保护剂处理(Biomicrofluidics, 2014, 8, 054124)。

发明内容

本发明的目的是提供序列化灌注式微流体芯片，运用由多个微滤膜窗级连的的微流道系统，自发产生可控的灌注序列，满足向细胞悬浮液中加注置换液的安全性和效率需求。

一种序列化灌注式微流体装置包括由上至下依次设置的板状的灌注侧本体1、板状的中间层本体3和板状的细胞侧本体2；

所述灌注侧本体1上开设有灌注侧入口11，与中间层本体3上三个以上的膜窗对应的灌注侧本体1的内侧面上开设有灌注侧流道，灌注侧流道的一端连通着灌注侧入口11；

所述中间层体3上开设有贯通中间层体的三个以上的膜窗，且三个以上的膜窗与灌注侧本体1上的流道对应；所述膜窗内填充有微滤膜；

所述细胞侧本体2上分别开设有贯通细胞侧本体的细胞侧入口21和细胞侧出口23，与中间层体体3上三个以上的膜窗对应的细胞侧本体2的内侧面上开设有细胞侧流道22，细胞侧流道22的两端分别连通着细胞侧入口21和细胞侧出口23；

所述灌注侧入口11和细胞侧出口23上下对应位于装置的同一侧，所述细胞侧入口21位于装置的另一侧；

工作时，向灌注侧入口11注入灌注液，同时向细胞侧入口21注入细胞悬浮液；灌注液经膜窗单向流动进入细胞侧流道22，与细胞悬浮液混合，由细胞侧出口23排出。

进一步限定的技术方案如下：

所述灌注侧流道和细胞侧流道22结构相同，为直线状流道或弧形流道。

所述灌注侧流道的深度和细胞侧流道22的深度均为0.1～0.5毫米，宽度为0.5～10毫米，长度为50～5000毫米。

所述灌注侧本体1材料、细胞侧本体2材料和中间层本体3材料相同，均为聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）。

所述灌注侧本体1的厚度为10mm，细胞侧本体2的厚度为5mm；中间层本体3的厚度为0.5mm。

所述微滤膜为平均孔径0.1微米以下的微滤膜，微滤膜材料为混合纤维素（MCE）。

所述膜窗为条状的矩形通孔，孔长为5～100毫米，孔宽为0.5～2毫米；相邻膜窗之间的间距为>20毫米。

所述灌注侧入口11的灌注液的流量为0.1～50ml/min，细胞侧入口21的细胞悬浮液的流量为0.1～5ml/min。

所述灌注液为低温保护剂溶液或生理盐水。

本发明的有益技术效果体现在以下方面：

（1）仿真分析表明，采用本发明进行低温保护剂的添加和去除，细胞经历的渗透性体积变化要明显小于传统手工单步或多步法以及连续式微流控方法；运用红细胞和间充质干细胞的实验表明，采用本发明进行低温保护剂的添加与去除，能在多种入口通量下保持处理充分性，相对现有微流控方法有显著优势，且细胞回收率高达85%以上，而传统的单步法及多步法仅有30%~60%。通过间断地、序列化地改变细胞悬浮液中的低温保护剂浓度，使细胞在每一次外环境变化后有一定的适应时间，能避免扩散法或透析法等连续式处理系统中细胞内外渗透压差积累效应，从而更好地适应高通量处理需求。

（2）本发明采用间隔的膜窗，使得灌注液间断的通入细胞液中，细胞在流道内所处的环境，低温保护剂的浓度间断的变化，使得细胞在两个膜窗之间能够有充足的时间适应浓度变化，有效地减小处理过程中细胞的渗透性损伤。另一方面，由于膜窗两侧由灌注液向细胞悬浮液单向流动的特点，避免细胞及其释放物对膜孔堵塞效应对处理过程造成的影响。

（3）由于细胞侧流道中的流量由小逐渐变大，在初始阶段需要以较小的灌注量以控制低温保护剂的相对变化率进而减小细胞的渗透性损伤，而在后期则需要以较大的灌注量来维持足够的低温保护剂变化率，更大的灌注量有助于提高保护剂的处理效率。由于本发明的特殊设计自发地产生了依次增加的灌注序列，使细胞悬浮液在通过每个膜窗时经历较均匀的低温保护剂浓度变化比例，有助于进一步减小细胞在处理过程中的渗透性响应和渗透性损伤。

（4）本发明中的膜窗个数决定了细胞在通过时外环境渗透压阶梯式变化的频数；各膜窗的尺寸决定了每一级灌注的剂量；膜窗间的间隔长度决定了细胞在经历每一级处环境变化后的恢复时间。通过对膜窗个数、尺寸及相对位置的定制，可在处理过程中获得灵活的灌注序列；当具备所处理细胞的膜特性参数时，可基于对细胞渗透性体积变化的仿真分析筛选灌注序列，从而获得进一步优化的处理效果。通过改变每个膜窗长度和膜窗之间的距离，可形成不同的灌注序列，灵活地适应不同处理需求。

附图说明

图1是本发明结构示意图；

图2是本发明原理示意图；

图3是实施例1芯片中流体压强分布示意图；

图4是实施例1芯片形成的灌注序列示意图；

图5是实施例1芯片细胞侧流道内低温保护剂浓度分布示意图；

图6是实施例1细胞在芯片中渗透性体积响应示意图；

图7是实施例2芯片中流体压强分布示意图；

图8是实施例2芯片形成的灌注序列示意图；

图9是实施例2芯片细胞侧流道内低温保护剂浓度分布示意图；

图10是实施例2细胞在芯片中渗透性体积响应示意图。

图1-图2中序号：1灌注侧芯片、2细胞侧按挺好、3中间层、11灌注侧入口、12灌注侧流道、21细胞侧入口、22细胞侧流道、23细胞侧出口；31、32、33均为膜窗、34、35、36膜窗间的固体壁面。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

参见图1和图2，一种序列化灌注式微流体装置包括由上至下依次设置的板状的灌注侧本体1、板状的中间层本体3和板状的细胞侧本体2。

灌注侧本体1材料、细胞侧本体2材料和中间层本体3材料相同，均为聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）。灌注侧本体1的厚度为10mm，细胞侧本体2的厚度为5mm；中间层本体3的厚度为0.1mm。

灌注侧本体1上开设有灌注侧入口11，与中间层本体3上三个膜窗对应的灌注侧本体1的内侧面上开设有灌注侧流道12，流道12总长300mm，宽1mm，深0.5mm，灌注侧流道12的一端连通着灌注侧入口11；

中间层体3上开设有贯通中间层体体的三个膜窗，且三个膜窗与灌注侧本体1上的灌注侧流道对应；三个膜窗分别为第一膜窗31、第二膜窗32、第三膜窗32。膜窗为条状的矩形通孔，孔长为50毫米，孔宽为1.0毫米；相邻膜窗之间的间距为50毫米。三个膜窗内均填充有微滤膜，微滤膜为平均孔径0.1微米以下的混合纤维素（MCE）。

细胞侧本体2上分别开设有贯通细胞侧本体的细胞侧入口21和细胞侧出口23，与中间层体体3上三个膜窗对应的细胞侧本体2的内侧面上开设有细胞侧流道22，细胞侧流道22的两端分别连通着细胞侧入口21和细胞侧出口23。

参见图2，灌注侧入口11和细胞侧出口23上下对应位于装置的同一侧，细胞侧入口21位于装置的另一侧。

实施例2

向干细胞悬浮液添加低温保护剂。

干细胞低温保存常用低温保护剂为DMSO，浓度为10%。为了向细胞悬浮液中添加DMSO至这一目标浓度，可采用如下设置：以DMSO浓度为20%的溶液作为灌注液，而干细胞悬浮液中DMSO的初始浓度为0%。设置所述序列化灌注式微流体装置的具体形式如实施例1所述，处理过程中细胞侧入口21的细胞悬浮液流量为1ml/min，自细胞侧入口21注入；灌注侧入口11的灌注液流量同为1ml/min，自灌注侧入口11注入；注入装置的灌注液分别通过第一膜窗31、第二膜窗32、第三膜窗32汇入干细胞悬浮液，最终在细胞侧出口23处得到DMSO浓度为10%的干细胞悬浮液。

下面结合附图对本实施例2的原理作进一步详细说明：

参见图3，实施例2中，细胞悬浮液与灌注液在细胞侧流道22和灌注侧流道12中逆向流动；由于流体的粘性作用，细胞悬浮液与灌注液在各自的流动方向上压强逐渐下降；由于灌注侧流道12仅有入口而无出口，强迫灌注液需经由中间层体体的第一膜窗31、第二膜窗32、第三膜窗32汇入细胞悬浮液；且由于第一膜窗31、第二膜窗32、第三膜窗32膜孔较小而具有较大的流动阻力，造成灌注侧流道压强整体高于细胞侧流道压强。综合以上流体力学作用，在第一膜窗31、第二膜窗32、第三膜窗32两侧形成沿细胞悬浮液流动方向上依次递增的跨膜压差。

参见图4，实施例2中，灌注液通过第一膜窗31、第二膜窗32、第三膜窗32的跨膜流动主要由跨膜压差驱动；由于第一膜窗31、第二膜窗32、第三膜窗32两侧具有依次递增的跨膜压差压差，导致通过第一膜窗31、第二膜窗32、第三膜窗32形成依次递增的灌注序列。

参见图5，实施例2中，细胞悬浮液在细胞侧流道22中流动时，依次经过第一膜窗31、第二膜窗32、第三膜窗32，并依次与一定剂量的、含有低温保护剂的灌注液混合，细胞悬浮液中的低温保护剂浓度在以阶梯形式升高。由于所有灌注液最终都汇入细胞悬浮液，基于质量守恒原理，出口处的低温保护剂浓度被精确地控制为10%。

随着细胞外环境中低温保护剂浓度的变化，细胞发生渗透性体积响应。在经过三个膜窗时，由于细胞外环境中的低温保护剂浓度上升，细胞体积收缩；而在相邻膜窗之间细胞悬浮液中低温保护剂浓度保持不变，细胞获得一定时间来适应外环境的低温保护剂浓度变化，细胞体积向等渗体积恢复；理论和实验都表明，相对一般的连续式处理过程，这种序列化的变化过程可有效地减小处理过程中细胞的渗透性损伤。

由于细胞侧流道22中的流量由小逐渐变大，在初始阶段需要以较小的灌注量以控制低温保护剂的相对变化率进而减小细胞的渗透性损伤，而在后期则需要以较大的灌注量来维持足够的低温保护剂变化率。由于本发明的特殊设计自发地产生了依次增加的灌注序列，使细胞悬浮液在通过每个膜窗时经历较均匀的低温保护剂浓度变化比例，有助于进一步减小细胞在处理过程中的渗透性响应和渗透性损伤。

实施例3

从干细胞悬浮液中去除低温保护剂

采用本发明装置，并以生理盐水作为灌注液，可用于去除干细胞内的低温保护剂。将含有低温保护剂的细胞悬浮液从细胞液侧入口21通入，入口流量设置为0.5ml/min；向灌注液入口11通入灌注液，入口流量设置为5ml/min；在细胞液侧出口23处可以得到固定稀释比例的细胞悬浮液，且细胞中的低温保护剂的去除率在90%以上。

下面结合附图对本实施例3的原理作进一步详细说明：

参加图7，实施例3中装置内两侧流道的逆向流动形成三个膜窗两侧依次递增的跨膜压，原理同实施例2。

参见图8，实施例3形成在三个膜窗两侧依次递增的灌注序列，原理同实施例1。

参见图9，实施例3中自发产生的序列化灌注导致细胞侧流道中低温保护剂浓度的多步、阶梯式变化，最终的低温保护剂浓度降低至1%以下，细胞中的低温保护剂去除率大于90%，原理同实施例1。

参见图10，实施例3中细胞在通过装置时随着外环境低温保护剂浓度的序列式变化，细胞体积呈现出序列化的膨胀、恢复过程，细胞经受的渗透性损伤相对连续式过程得以降低，原理同实例2。

在实施例2或实施例3中，装置中的膜窗个数决定了细胞在通过芯片时外环境渗透压阶梯式变化的频数；各膜窗的尺寸决定了每一级灌注的剂量；相邻膜窗间的间隔长度决定了细胞在经历每一级处环境变化后的恢复时间。通过对装置的膜窗个数、尺寸及相对位置的定制，可在处理过程中获得灵活的灌注序列；当具备所处理细胞的膜特性参数时，可基于对细胞渗透性体积变化的仿真分析筛选灌注序列，从而获得进一步优化的处理效果。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种序列化灌注式微流体装置，其特征在于：包括由上至下依次设置的板状的灌注侧本体（1）、板状的中间层本体（3）和板状的细胞侧本体（2）；

所述灌注侧本体（1）上开设有灌注侧入口（11），与中间层本体（3）上三个以上的膜窗对应的灌注侧本体（1）的内侧面上开设有灌注侧流道，灌注侧流道的一端连通着灌注侧入口（11）；

所述中间层本体（3）上开设有贯通中间层体的三个以上的膜窗，且三个以上的膜窗与灌注侧本体（1）上的流道对应；所述膜窗为条状的矩形通孔，膜窗内填充有微滤膜；所述微滤膜为平均孔径0.1微米以下的微滤膜；

所述细胞侧本体（2）上分别开设有贯通细胞侧本体的细胞侧入口（21）和细胞侧出口（23），与中间层本体（3）上三个以上的膜窗对应的细胞侧本体（2）的内侧面上开设有细胞侧流道（22），细胞侧流道（22）的两端分别连通着细胞侧入口（21）和细胞侧出口（23）；

所述灌注侧流道和细胞侧流道（22）结构相同，为直线状流道或弧形流道；

所述灌注侧入口（11）和细胞侧出口（23）上下对应位于装置的同一侧，所述细胞侧入口（21）位于装置的另一侧；

工作时，向灌注侧入口（11）注入灌注液，同时向细胞侧入口（21）注入细胞悬浮液；灌注液经膜窗单向流动进入细胞侧流道（22），与细胞悬浮液混合，由细胞侧出口（23）排出；所述灌注侧入口（11）的灌注液的流量为0.1～50ml/min，细胞侧入口（21）的细胞悬浮液的流量为0.1～5ml/min；所述灌注液为低温保护剂溶液或生理盐水。

2.根据权利要求1所述的一种序列化灌注式微流体装置，其特征在于：所述灌注侧流道的深度和细胞侧流道（22）的深度均为0.1～0.5毫米，宽度为0.5～10毫米，长度为50～5000毫米。

3.根据权利要求1所述的一种序列化灌注式微流体装置，其特征在于：所述灌注侧本体（1）材料、细胞侧本体（2）材料和中间层本体（3）材料相同，均为聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）。

4.根据权利要求1所述的一种序列化灌注式微流体装置，其特征在于：所述灌注侧本体（1）的厚度为10mm，细胞侧本体（2）的厚度为5mm；中间层本体（3）的厚度为0.5mm。

5.根据权利要求1所述的一种序列化灌注式微流体装置，其特征在于：所述微滤膜材料为混合纤维素。

6.根据权利要求1所述的一种序列化灌注式微流体装置，其特征在于：所述膜窗的孔长为5～100毫米，孔宽为0.5～2毫米；相邻膜窗之间的间距为>20毫米。

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