JP7023938B2 - 細胞形質導入のためのシステムおよび方法 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１６年６月６日に出願された「キメラ抗原受容体Ｔ細胞技術および他の細胞治療のための微小流体ウイルス導入」と題する米国仮特許出願第６２／３４６，０３１号、および２０１６年１１月１４日に出願された「細胞形質導入のためのシステムおよび方法」と題する米国仮特許出願第６２／４２１，７８４号の利益および優先権を主張するものであり、これら両者の全体を本明細書の一部として援用する。

様々な病状に対する様々な治療には、外因性遺伝子情報を患者または細胞提供者の細胞に移入することが含まれる。例えば、ＣＡＲ－Ｔ（キメラ抗原レセプターＴ細胞）技術は、患者から血液サンプルを採取し、それらが標的細胞上の特定の抗原を認識するようにプログラムされた後、遺伝子操作されたＴ細胞集団を患者の身体に戻すように処理することを含む。典型的には、遺伝子は、レトロウイルス（例えば、レンチウィルス）を用いたウイルス形質導入によってＴ細胞に移入されるが、エレクトロポレーションまたはチャネル内の細胞括れなどの物理的方法、化学的方法または他のアプローチを用いて細胞にトランスフェクトすることもできる。

本開示の一態様によれば、装置は、第１の流体マニホルドに結合された少なくとも１つの第１の流れチャンバを画定する第１の基板と、細胞随伴層を画定する第２の基板とを含む。この細胞随伴層は、少なくとも１つの第２の流れチャンバおよび複数の細胞随伴キャビティを含む。各細胞随伴キャビティは、一端が第２の流れチャンバの１つの中へと開口している。細胞随伴キャビティの各々は、第２の基板を通って延出しており、少なくとも１つの細胞を保持する大きさである。この細胞随伴層は、実質的に第２の基板の平面内にある少なくとも１つの第２の流れチャンバへの、少なくとも１つの入口を含む。細胞随伴層は、実質的に第２の基板の平面内にある少なくとも１つの第２の流れチャンバからの、少なくとも１つの出口を含んでいる。この装置は、第１の基板と第２の基板との間に配置された第１の膜を含む。この第１の膜は、細胞の通過を防止するために十分小さく、且つウイルス粒子の通過を可能にするために十分な大きさの複数の細孔を含む。当該装置は、第２の流体マニホルドに結合された少なくとも１つの第３の流れチャンバを画定する第３の基板を含む。当該装置は、第２の基板と第３の基板との間に配置された第２の膜を含む。この第２の膜は、ウイルス粒子の通過を防止するために十分小さいが、細胞培地の通過を可能にするために十分に大きい第２の複数の細孔を含む。

幾つかの実施形態において、少なくとも１つの第１の流れチャンバ、少なくとも１つの第２の流れチャンバ、および／または少なくとも１つの第３の流れチャンバは、それぞれの実質的に平坦な流れフィールドを含み、これは複数の流体接続を介して対応するマニホルドに結合する。幾つかの実施において、少なくとも１つの第１の流れチャンバ、少なくとも１つの第２の流れチャンバ、および／または少なくとも１つの第３の流れチャンバは、複数の流れチャネルを含む。各流れチャネルは、単一の流体接続を介して対応するマニホルドに結合する。

幾つかの実施形態において、少なくとも１つの第１の流体マニホルドおよび第２の流体マニホルドは、垂直の流れマニホルドを含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの第１の流体マニホルドおよび第２の流体マニホルドは、水平の流れマニホルドを含む。

幾つかの実施形態において、第１の流体マニホルドの第１の端部は、第１の基板により画定される少なくとも１つの第１の流体チャンバに結合し、第２の流体マニホルドの第１の端部は、第３の基板によって画定される少なくとも１つの第３の流体チャンバに結合する。第１の流体マニホルドの第２の端部は、第２の流体マニホルドの第二の端部に流体的に結合して、流体が第１の流体マニホルド、第１の膜、複数の細胞随伴キャビティ、第２の膜、第２の流体マニホルドを通って、第１の流体マニホルドに戻るようになっている。幾つかの実施形態において、当該装置は、バルブにより第１の流体マニホルドの第２の端部と第２の流体マニホルドとの間に結合された廃棄チャネルを含む。バルブは、第１の流体マニホルドの第２の端部から排出された流体流れを、廃棄物リザーバへと選択的に迂回させるように構成される。

幾つかの実施形態において、当該装置は、流体を第１の流体マニホルドの第２の端部の中へとポンプ輸送するように構成された、第１のポンプを含む。幾つかの実施形態において、当該装置は、流体を第２の流体マニホルドの第２の端部の中へとポンプ輸送するように構成された第２のポンプを含み、この第２のポンプは、第１のポンプと同じポンプであるか、または第１のポンプとは異なっている。

幾つかの実施形態において、第１の基板は、少なくとも１つの第１の流体チャンバの遠位端に結合された出口を含む。

幾つかの実施形態において、細胞随伴キャビティ（複数）は、少なくとも１つの第２の流体チャンバの遠位端に向かってよりも、少なくとも１つの第２の流体チャンバの近位端に向かって、より高い密度を有する。幾つかの実施形態において、細胞随伴キャビティの各々は、それぞれの細胞随伴キャビティの側壁に配置された一対のエレクトロポレーション電極を含む。

本開示の別の態様によれば、当該装置は、少なくとも１つの第１の流れチャンバを第１の流体マニホルドに結合する、少なくとも１つの第１の流れチャンバを画定する第１の基板を含んでいる。当該装置は、細胞随伴層を画定する第２の基板を含む。細胞随伴層は、少なくとも１つの第２の流れチャンバと、メッシュまたは多孔質ゲルから形成された少なくとも１つの細胞随伴領域とを含む。少なくとも１つの細胞随伴領域の各々は、対応する第２の流れチャンバに隣接して配置され、また遺伝子導入剤を含浸される。細胞随伴層は、第２の基板を通って延び、且つ第２の基板に対して実質的に垂直に配向された第２の複数の流体通路を含む。この第２の複数の流体通路の各々は、一端において、少なくとも１つの第２の流れチャンバの１つの中へと開口する。当該装置は、第１の基板と第２の基板との間に配置された第１の膜を含む。第１の膜は、細胞の通過を防止するために十分小さく、且つウイルス粒子の通過を可能にするために十分に大きい複数の細孔を含む。この装置は、第２の流体マニホルドに連結された少なくとも１つの第３の流れチャンバを画定する第３の基板と、第２の基板と第３の基板との間に配置された第２の膜を含む。この第２の膜は、ウイルス粒子の通過を防止するために十分小さいが、細胞培地の通過を可能にするために十分に大きい第２の複数の細孔を含む。

本開示の別の態様によれば、細胞形質導入の方法は、細胞を少なくとも１つの第１の流れチャンバに導入すること、および遺伝子情報導入剤を第１の流れチャンバに導入することを含む。当該方法は、第１の流体を、少なくとも１つの第１の流れチャンバに対して実質的に垂直な第１の方向に、且つそれぞれの第１の流れチャンバへと開いた近位端を有する少なくとも１つの第１の流れチャンバに沿って分布した複数の細胞随伴キャビティを通して流し、それによって、導入された細胞および遺伝子情報導入剤を複数の細胞随伴キャビティの中に第１の時間だけ随伴させることを含み、それによって遺伝子情報導入剤に担持された遺伝子情報を随伴細胞の中に導入することを可能にする。この方法は、細胞随伴キャビティの遠位端を通る細胞および遺伝子情報導入剤の通過を防止することを含む。この方法は、第２の時間の間、第１の流体の流れ方向を逆転させ、それにより細胞を細胞随伴キャビティから放出し、遺伝子情報導入剤を細胞から洗い流すことを含む。この方法は、放出された細胞を、収集のために少なくとも１つの第１流れチャンバから流出させることを含む。

幾つかの実施例において、当該方法は、細胞の通過を阻止するが、遺伝子情報導入剤を通過させるためには十分大きい寸法の細孔を有する第１の膜に、第１の流体を流すことを含む。幾つかの実施形態において、当該方法は、第１の流体を、細胞随伴キャビティの遠位端を通して、また第１の流体を通過させるために十分大きく且つ遺伝子情報導入剤の膜の通過を防止するために充分に小さい細孔を有する第２の膜を通して流すことを含む。幾つかの実施例において、当該方法は、第２の膜を流れる流体が、第１の膜を通って第１の方向に戻される循環流を生成することを含む。

幾つかの実施形態において、当該方法は、細胞および遺伝子情報導入剤を、実質的に同時に、第１の流れフィールドに導入することを含む。幾つかの実施形態において、当該方法は、第１の流れフィールドに遺伝子情報導入剤を導入する前に、第１の流れフィールドに細胞を導入することを含む。幾つかの実施形態において、当該方法は、細胞および遺伝子情報導入剤が細胞随伴キャビティ内に随伴されている間に、細胞にエレクトロポレーションを施すことを含む。

本開示の別の態様によれば、細胞形質導入の方法は、細胞を少なくとも１つの第１の流れチャンバに導入することを含む。少なくとも１つの第１の流れフィールドは、それぞれの第１の流れチャンバの領域に広がり、且つ複数の遺伝子情報導入剤が含浸されているそれぞれのメッシュまたはゲルに隣接している。当該方法は、第１の流体を、少なくとも１つの第１の流れフィールドに対して実質的に垂直な第１の方向に、且つメッシュまたはゲルを通して流し、それによって、導入された細胞をメッシュまたはゲルの中に随伴させ、また第１の時間だけ遺伝子情報導入剤と緊密に接触させ、それによって遺伝子情報導入剤に担持された遺伝子情報を随伴細胞の中に導入することを可能にすることを含む。当該方法は、少なくとも１つの第１の流れチャンバの反対側のメッシュまたはゲルの側を通しての、細胞および遺伝子情報導入剤の通過を防止することを含む。当該方法は、第２の時間の間、第１の流体の流れの方向を反転させ、それによって細胞をメッシュまたはゲルから放出し、細胞を洗浄することを含む。当該方法は、放出された細胞を、収集のために、少なくとも１つの第１の流れチャンバから流出させることを含む。

本開示の別の態様によれば、装置は、第１の流体マニホルドに結合された少なくとも１つの第１の流れチャンバを画定する第１の基板を含む。当該装置は、少なくとも１つの第２の流れチャンバを画定する第２の基板を含む。第２の流れチャンバは、第１の基板と第２の基板との間に配置された第１の膜を含む。第１の膜は、細胞の通過を防止するために十分小さく、且つウイルスの通過を可能にするためには十分に大きい複数の細孔を含む。当該装置は、第３の流れチャンバを画定し、第２の流体マニホルドに結合された第３の基板を含む。当該装置は、第２の基板と第３の基板との間に配置された第２の膜を含む。第２の膜は、ウイルス粒子の通過を防止するのに十分小さいが、細胞培地の通過を可能にするためには十分に大きい第２の複数の細孔を含む。当該装置は、第１および第２の膜を横断する流体の流れの結果として、少なくとも１つの第２の流れチャンバ内に細胞を随伴させるための手段を含む。

幾つかの実施形態において、取込み手段は第２の膜を含む。幾つかの実施形態では、第２の膜は、パターン化された膜およびパターン化されていない膜のうちの１つを含む。

当業者であれば、本明細書に記載されている図面は説明のためだけのものであることを理解するであろう。幾つかの例では、説明された実装形態の様々な態様が、説明された実装形態の理解を容易にするために、誇張または拡大して示されることがあり得ることを理解されたい。図において、同様の参照符号は一般に、様々な図面を通して同様の特徴、機能的に類似および／または構造的に類似した要素を示す。図面は必ずしも一定の縮尺ではなく、代わりに教示の原理を説明することに重点が置かれている。図面は、如何なる意味においても、本教示の範囲を限定しようとするものではない。当該システムおよび方法は、以下の図面を参照すれば、以下の例示的な説明から更に良好に理解できるであろう。

例示的な細胞形質導入システムのブロック図である。 第２の例示的な細胞形質導入システムを示す。 図１Ａおよび図１Ｂに示した細胞形質導入システムの何れかでの使用に適した形質導入スタックの頂面図である。 第１および第４の外部流体マニホルドとしての使用に適した別のマニホルドを示す。 図１Ａおよび図１Ｂに示した細胞形質導入システムでの使用に適した例示的な形質導入スタックの切欠き斜視図である。 遺伝子情報を細胞に導入する例示的方法のブロック図を示す。 図１Ａおよび図１Ｂに示した細胞形質導入システムにおける使用に適した細胞形質導入スタックを用いて、図２に示す方法を実施する様々な段階を示す。 図１Ａおよび図１Ｂに示した細胞形質導入システムと同様の細胞形質導入システムを用いた、細胞形質導入の第２の例示的方法を示す。 図１Ａおよび１Ｂに示した細胞形質導入システムでの使用に適した細胞形質導入スタックを用いた、図４に示す方法の様々な段階を示す。 別の例示的形質導入スタックの断面図を示す。 細胞形質導入システムの別の実施例の様々な図を示す。 図７Ａ～図７Ｄに示したのと同様の細胞形質導入システムを用いて、図２に示す方法を実施した実験結果を示す。

上記で導入され、且つ以下で更に詳細に議論される様々な概念は、記載された概念が特定の実施形態に限定されないので、多数の方法の何れにおいても実施され得るものである。特定の実装形態および応用の例は、主に説明の目的で提供される。

本明細書では、ＣＡＲ－Ｔ（キメラ抗原受容体Ｔ細胞）および他の細胞修飾もしくは刺激レジメンに関与する形質導入プロセスにおいて使用するための、システムおよび方法が開示される。開示される技術の他の使用例には、タンパク質およびウイルスの産生、細胞増殖、幹細胞の再プログラミング、遺伝病の治療のための特定の遺伝子のサイレンシング、Ｔ細胞の活性化、またはｓｉＲＮＡ送達が含まれる。当該システムおよび方法の他の使用は、本開示の範囲から逸脱することなく実施できるであろう。

本明細書で述べるデバイスは、一般に、膜によって相互に分離された３つの層を含む。各層は、少なくとも１つの流れチャンバを画定する。本明細書で使用する場合、「流れチャンバ」とは、デバイス内の層を横切って流体を搬送するための任意の導管を指す。流れチャンバは、一般に、流れチャネルまたは流れフィールドの何れかに分類することができる。本明細書で使用する「流れフィールド」とは、複数の流体接続部を介してマニホルドに結合するより広い流れチャンバを指称する。対照的に、本明細書で使用する「流れチャネル」とは、単一の流体接続を介してマニホルドに結合するより狭い流れチャンバを言う。従って、幾つかの実施形態において、各層は１つまたは複数の流れフィールドを画定する。幾つかの他の実施形態において、各層は複数の流れチャネルを画定する。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの層は１以上の流れフィールドを含み、１以上の他の層は複数の流れチャネルを含む。

本明細書で述べるデバイスにおける層は、層自体の平面に対して実質的に垂直な方向で各層に画定された流れチャンバを横切る反転可能な垂直流、ならびに少なくとも中央層を通る水平流を可能にするように構成される。中央層は、細胞随伴領域を画定し、その中では細胞および遺伝子情報導入剤または他の化学的または生物学的添加剤を随伴させて、遺伝子導入剤（または添加剤）に担持された遺伝子情報を随伴された細胞内に導入（または他の方法で相互作用させる）することができる。そのような追加の添加剤には、抗体、サイトカイン、小分子、タンパク質、または随伴された細胞と相互作用する可能性のある他の薬剤が含まれ得る。中央層を通る水平流は、細胞および遺伝子情報導入剤または他の添加物をこの中央層に導入し、当該細胞および遺伝子情報導入剤または添加物を細胞随伴領域に分配し、次いで、処理後に細胞を中央層から除去するために使用される。層を横切る垂直方向の流れは、細胞および遺伝子情報導入剤または添加剤を、細胞随伴領域に取り込むために使用される。次いで、垂直流を逆転させて、細胞随伴領域から細胞を放出させ、過剰な遺伝子導入剤または添加物を洗い流すことができる。

様々な実施形態において、流体の流れは、外部流体マニホルドまたは一体型流体マニホルドの何れかを通って、デバイスの３つの層の流れチャンバの中に導入される。外部流体マニホルドは別個の構成要素で形成され、層の中に画定された流体通路を介して流れチャンバに流体的に結合される。一体型流体マニホルドは、特定の層を構成する材料の中に直接形成される。幾つかの実施形態において、層の各々の中に流体を導入する流体マニホルドは、水平流体マニホルドである。幾つかの実施形態において、流体を外側の２つの層に導入する流体マニホルドは垂直流体マニホルドである。

幾つかの実施形態において、流体は、外部マニホルドを介して所与の層に導入され、統合マニホルドを介して除去されてよく、またはその逆であってもよい。幾つかの実施形態では、所与の層の両端の一方において、外部マニホルドは統合マニホルドに結合されてよい。

当該デバイスにおける２つの膜は、デバイスの層（複数）の間において流体および生物学的物質の通過を制御するように選択される。膜は、膜を通る特に定義された細孔を通る以外は、一般に不透過性であり得る。１つの膜の細孔（複数）は、細胞培地のような流体の通過を可能にするために十分に大きいが、系に導入された遺伝子情報導入剤または他の添加剤の通過を阻止するために充分に小さい寸法である。他の膜における細孔（複数）はより大きく、当該システムに導入された遺伝子情報導入剤または他の添加物の通過を可能にするが、やはり細胞の通過を阻止するためには十分に小さい。幾つかの実施形態において、両方の膜の細孔（複数）は、遺伝子導入剤または他の添加剤が通過するのには十分に大きくてもよい。そのような実施形態において、遺伝子導入剤または他の添加剤は、垂直流でデバイスを通って再循環する。

図１Ａは、例示的な細胞形質導入システム１００のブロック図である。このシステムは、形質導入スタック１０２、ならびに形質導入スタック１０２の中へ、および該スタックから外への流体の流れを制御する関連の流体素子を含む。

形質導入スタック１０２は、第１の基板１０４、第２の基板１０６、および第３の基板１０８を含む。第１の基板１０４は、第１の膜１１０によって第２の基板１０６から分離され、第２の基板１０６は、第２の膜１１２によって第３の基板１０８から分離される。

例示的な細胞形質導入システム１００において、第１の基板１０４は、第１の基板１０４の平面に対して平行な平面内で実質的に延びる第１の流れフィールドを画定する。第１の基板１０４は更に、第１の膜１１０の反対側の第１の基板１０４の第１の面を通過する複数の流体通路を画定する。流体通路は、第１の基板１０４の平面および第１の流れフィールドに対して実質的に垂直に延出する。流体通路は、第１の基板の第１の側に亘って実質的に均一に分布し、第１の流れフィールドを第１の外部流体マニホルド１１４に流体的に結合する。第１の外部流体マニホルド１１４は、２次元アレイの流体通路を介して細胞導入スタック１０２に流体を導入し、細胞導入システム１００によって導入された流体が、第１の流れフィールドを横切って、第１の基板１０４の平面および第１の流れ場の平面に対して垂直な方向で実質的に均一に導入されることを可能にし、幾つかの実施形態では、流れフィールドを横切る流体の実質的に均一な流れを生じる。

第２の基板１０６は、第２の流れフィールドを画定する。この第２の流れフィールドも同様に実質的に平面であり、第２の基板１０６の平面に対して実質的に平行な平面内で延出する。第２の基板１０６は、第２の基板の第１の縁部に沿って複数の入口を画定する第２の流れフィールドを、第２の外部流体マニホルド１１６の出口に流体的に結合する。第２の外部流体マニホルドは、第２の流体が第２の流れフィールドの対応する縁部に沿って実質的に均等に第２の流れフィールドに入るように、第２の流体を第２の基板の縁部に沿って分配する。第２の流体は、上述した第１の流体の流れ方向に対して垂直な方向に導入される。即ち、第２の流体は、第２の流れフィールドの平面内で流される。第２の基板は更に、第２の基板１０６の第２の縁部に沿って、第１の縁部に対向して分布した複数の出口を画定する。この出口は、第２の流れフィールドを、第２の流れフィールドから流体を運び出す第３の外部流体マニホルド１１８へと流体的に結合する。

幾つかの実施形態において、第２の基板１０６は、細胞随伴キャビティのアレイを画定する。この細胞随伴キャビティは、第２の基板１０６の平面に対して実質的に垂直な方向に第２の基板１０６を貫通する孔から形成することができる。この孔は、第２の流れフィールドに近接する端部（「近接端部」）において十分に広く、少なくとも１つの細胞を保持するのに十分な深さを有する。幾つかの実施形態において、孔は、それぞれ、単一の細胞を保持するような寸法および形状である。幾つかの実施形態において、孔は、１つの細胞から数千、更には約１００万の細胞までの範囲の複数の細胞を保持するような寸法および形状である。例えば、孔は概ね円形、六角形、八角形、長方形、楕円形であってよく、または他の適切な形状を有してもよい。幾つかの実施形態において、近位端は、約０．０１ｍｍ～約１．０ｍｍの直径を有することができる。幾つかの実施形態において、近位端部、０．１ｍｍ～１．０ｍｍの直径を有することができる。幾つかの実施形態において、近位端は、約０．５０～約０．８０ｍｍの直径を有することができる。細胞随伴キャビティは、約０．０１ｍｍ～約２．０ｍｍの範囲の深さを有することができる。幾つかの実施形態において、細胞随伴キャビティは、約０．１ｍｍ～約０．５ｍｍの深さである。幾つかの実施態様において、細胞随伴キャビティの壁は垂直（即ち、第２の基板１０６の平面に対して垂直）である。幾つかの他の実施形態では、細胞随伴キャビティの壁が傾斜しているので、細胞随伴キャビティは、第２の膜１１２に隣接するそれらの遠位端に接近するにつれて狭くなる。壁の傾斜は、約４５度～約９０度の範囲であることができる。幾つかの実施形態において、壁は、約６０度～約８０度の間の傾斜を有することができる。細胞の随伴キャビティは、第２の基板１０６を横切ってかなり緊密に充填することができる。幾つかの実施形態において、キャビティは、充填密度を最大にするために互い違いに配置することができる。幾つかの他の実施形態において、キャビティは、長方形、六角形、または他の幾何学的配列に配置することができる。任意の方向の細胞随伴キャビティ間のスペースは、細胞随伴キャビティを形成する孔の近位端の直径よりも小さくすることができる。様々な実施形態において、第２の基板は、約１，０００個の間隙と約１０，０００，０００個の細胞随伴キャビティを画定することができる。幾つかの実施形態において、キャビティは、流れフィールドの長さに沿って規則的に離間されている。幾つかの実施形態において、キャビティは不規則に間隔を置いて配置される。例えば、流れチャネルを含む実施形態については、流れチャネルの末端に向かって細胞が随伴されることを保証するために、流れチャネルの遠位端に向かってより密に充填することができる。流れフィールドを含む幾つかの実施形態では、細胞が流れフィールドの中心に向かって移動する可能性があるので、流れフィールドの中心軸に沿ったキャビティの密度は、縁部に向かうよりも高くなる可能性があるます。加えて、またはその代わりに、幾つかの流れフィールドの実施形態において、キャビティの密度は、流れフィールドの遠位端部において流れフィールドの近位端部におけるよりも大きくてよい。幾つかの実施例において、キャビティは、実質的に等しい数の細胞が各キャビティ内に随伴されるように配置されてよい。キャビティの幅は、少なくとも１つの細胞を収容するように設計されてもよいが、個々のキャビティ内の複数の細胞を可能にするため、またはアラインメントのような製造プロセスの容易さを促進するために、流れチャンバの幅に合わせてもよい。

幾つかの他の実施形態において、第２の基板１０６は、細胞随伴キャビティを画定せず、その代わりに、細胞が随伴されることになる第２の流れフィールドに隣接した多孔質ゲルまたはメッシュを保持する。多孔質ゲルまたはメッシュは、サイトカインなどの化学因子、および／または遺伝子情報導入剤、例えばウイルス、ウイルス粒子、プラスミド、プラスミドベクター、ＣＲＩＳＰＲ複合体、またはリポフェクタミンのようなベクター導入剤を含む、遺伝子情報を細胞に導入するための任意の他の手段を含浸させることができる。ゲルまたはメッシュは、第２の流れフィールドを流れる流体に対して透過性であり、その内部に細胞を随伴できるキャビティを含む。

第３の基板１０８は、第３の流れフィールドおよび第２の複数の流体通路を画定する。第１の基板１０４を通って画定された第１の複数の流体通路と同様に、第２の複数の流体通路は、第３の基板１０８の平面に対して実質的に垂直な方向に、第３の基板１０８を通って２次元配列で延出する。第２の複数の流体通路は、第３の流れフィールドを、第４の外部流体マニホルド１２０へと流体的に結合する。

図１Ａでは外部流体マニホルドに結合されているように示されているが、幾つかの実施態様では、基板１０４、１０６、および１０８の１以上、場合によっては全部が統合流体マニホルドを含む。統合マニホルドの例を、図７Ｃおよび図７Ｄに示す。

第１、第２および第３の基板１０４、１０６、および１０８の各々は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、アクリルまたは環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）、生分解性ポリエステル、例えばポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、セバシン酸ポリグリセロール（ＰＧＳ）などの軟質エラストマー、他の熱可塑性樹脂または他の構造材料で製造できる。或いは、基板は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ポリウレタン（ＰＵ）、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、またはフルオロポリマーエラストマーで製造されてもよい。幾つかの実施形態において、第１、第２、および第３の基板１０４、１０６、および１０８のうちの１以上は、ガラス、セラミック、またはシリコン（Ｓｉ）のような半導体から形成することができる。基板１０４、１０６、および１０８は、約０．５ｍｍ～約４ｍｍの範囲の厚さにすることができる。幾つかの実施形態において、基板は約０．５～約２．０ｍｍの厚さである。１以上の平行な流れフィールドまたは流れチャネルを含む所与の層のための１組の流れチャンバの組合せセットは、約５ｍｍ幅×約５ｍｍ長さ×約０．１ｍｍ深さ～長さ約２０ｃｍ×幅約２０ｃｍ×深さ約２ｍｍの一般に矩形または正方形であることができる。幾つかの実施形態では、層内の組み合わされた組の流れチャンバの長さ：幅の比は約１：１である。幾つかの実施形態において、流れチャンバの１以上は、円形、楕円形、六角形、または他の幾何学的形状または不規則形状を有する。幾つかの実施態様では、形質導入スタック１０２の各層に１以上の流れフィールドを含める代わりに、より多くの層がより多くの平行な流れチャネルを含むことができる。幾つかの実施形態では、複数の細胞形質導入スタック１０２を並列に流体素子に接続して、一度に多くの細胞の処理を可能にすることができる。

第１の膜１１０は、第１の基板１０４によって画定された第１の流れフィールドを、第２の基板１０６によって画定された第２の流れフィールドから分離する。この膜は、ポリカーボネート、ＰＥＴまたは様々な透析膜のような、一般に流体不透過性の材料から形成することができる。幾つかの実施形態において、膜材料は親水性であるか、または第１の膜１１０の一方または両方の側面がＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）などの親水性材料でコーティングされている。ウイルス、ウイルス粒子、プラスミド、ＣＲＩＳＰＲ複合体、または他の核酸送達剤のような遺伝子情報導入剤が第１の膜１１０を通過するのに十分に大きい寸法、即ち、少なくとも約０．１ミクロンで且つ約１．０ミクロン未満の直径を有する細孔は、例えばトラックエッチングによって第１の膜１１０を通して形成される。幾つかの実施形態において、細孔は直径約０．４ミクロンである。また、細孔は、マスターモールドからのマイクロモールドなどの他の技術によって、または沈降法、犠牲法、または膜に蛇行した経路細孔を生成する他の技術によっても形成され得る。第１の膜１１０は、約１５～約３０パーセントの細孔密度を有することができる。

第２の膜１１２は、第１の膜１１０と同様であり、第３の流れフィールドから第２の基板１０６を分離する。しかしながら、第２の膜１１２の細孔は、第１の膜１１０の細孔よりも直径が小さい。例えば、第２の膜１１２の細孔は、システム１００において使用することを意図した最小の遺伝子情報導入剤よりのも小さくてもよい。例えば、第２の膜の細孔は、約０．００１ミクロン～約０．５ミクロンの直径とすることができる。幾つかの実施形態において、第２の膜１１２の細孔は、直径が約０．１ミクロンである。第２の膜１１２は、約１５～約３０パーセントの細孔密度を有することができる。第１の膜１１０および第２の膜１１２は、約８ミクロン～約１２ミクロン、例えば約１０ミクロンの厚さとすることができる。

細胞形質導入システム１００内の流体工学素子は、流体を、形質導入スタック１０２を通して第１、第２および第３の基板１０４、１０６、および１０８に対して実質的に垂直に、双方向的に流すように構成された垂直流システムを含む。この垂直流システムは、３ポートポンプ１２２、３ポートバルブ１２４、第１および第４の外部流体マニホルド１１４および１２０、流体リザーバ１２６、廃棄物リザーバ１２８、および接続流体チャネルを含む。３ポートポンプは、流体リザーバ１２６から細胞培地などの流体を引き出し、それを、形質導入スタック１０２を介してポンプ輸送することができる。３ポートポンプは、形質導入スタック１０２を通して流体をポンプ輸送し、流体が第１の外部流体マニホルド１１４および第１の基板１０４、または第４の外部流体マニホルド１２０および第３の基板１０８を通って、形質導入スタック１０２に入るようになっている。３ポートバルブが廃液リザーバ１２８を垂直流システムの残りの部分から隔離する１つの動作モードでは、一旦十分な量の流体が流体リザーバ１２６から垂直流システムに導入されると、ポンプ１２２は、流体リザーバ１２６を垂直流システムの残りの部分から隔離することができ、流体を、形質導入スタック１０２を通して矢印１３０で示す方向（即ち、図中反時計回り）に再循環させることができる。３ポート弁が第１の外部流体マニホルド１１４を廃液リザーバに流体的に結合し、第１の外部流体マニホルド１１４と３ポートポンプ１２２との間の流体経路を閉鎖する別の動作モードでは、３ポートポンプ１２２は流体リザーバ１２６への流体経路を開き、形質導入スタック１０２を通る流れの向きを反転させる。流体貯蔵器１２６への流体経路を開き、矢印１３２で示すように、形質導入スタック１０２を通る流れの方向を反転させる。この動作モードにおいて、流体リザーバ１２６からの流体は、第４の外部流体マニホルド１２０から形質導入スタック１０２の中に流入し、第１の外部流体マニホルド１１４を通って流出し、３ポート弁を通って廃棄物リザーバ１２８に流れ込む。

細胞形質導入システム１００の流体素子はまた、水平流ステムを含む。この水平流システムは、形質導入スタック１０２の第２の基板１０６に画定された第２の流れフィールドに細胞（および幾つかの実施形態では遺伝子情報導入剤）を導入するように構成されている。水平流は、第２の流れフィールドの平面内において、ある方向に細胞を導入する。水平流システムは、ポンプ１３４、出口バルブ１３６、サンプルリザーバ１３８、第２および第３の外部流体マニホルド１１６および１１８、ならびに接続流体チャネルを含む。

幾つかの実施例において、ポンプ１３４は３ポートポンプである。そのような実施形態では、第１のポートがサンプルリザーバ１３８に結合し、第２のポートが流体リザーバ１２６に結合し、第３のポートが第２の外部流体マニホルドに結合する。このような実施形態において、ポンプ１３４は、サンプルリザーバから、例えば、細胞培地に懸濁された細胞および遺伝子情報導入剤を含む流体、または流体リザーバ１２６からの流体を第２の外部流体マニホルド１１６を介して形質導入スタック１０２の中へとポンプ輸送する。

ポンプ１３４が４ポートポンプである実施形態では、当該ポンプの第４のポートが出口バルブ１３６に結合する。そのような実施形態において、流体は、第２の流れフィールドを通って、第３の外部流体マニホルド１１８を通り、出口バルブ１３６を通り、ポンプ１３４へと戻る。このような実施形態は、サンプルリザーバ１３８からの流体が第２の流れフィールドを通る第１の通過を行うとき、第２の流れフィールドに隣接する細胞随伴キャビティの中に、不十分な数の細胞または多数の遺伝子情報導入剤がうまく随伴される場合に有用であり得る。随伴されない細胞または遺伝子情報導入剤は、再循環流中の第２の流れフィールドを介して再循環流の中に再循環させて、より多くの細胞および遺伝子情報導入剤を随伴させることができる。

出口バルブ１３６は、出口バルブを通る如何なる流れも完全に防止するように閉じることができ、またはシステム出力から形質導入された細胞を回収できるように開放し得るように構成される。

幾つかの他の実施形態では、基板のキャビティ、ゲル、またはメッシュの中に随伴させる代わりに、細胞を第２の膜１１２に直接取り込むことができる。幾つかの実施形態では、第２の膜１１２をパターン化して、隆起領域および低部領域を有するレリーフを形成して、細胞を随伴させる膜の能力を高めることができる。低部領域は、約０．０１ミクロン～約０．８ミクロンの寸法を有することができる。１以上の細胞は、それらの相対的な大きさに応じて、これらの底部領域内に随伴され得る。幾つかの実施形態において、パターン化されていない第２の膜が、細胞を随伴させるための手段として働くことができる。

図１Ｂは、第２の例示的な細胞形質導入システム１５０を示す。細胞形質導入システム１５０は、以下の相違点を伴って、細胞形質導入システム１００と実質的に類似している。第１に、第１の複数の流体通路に加えて、細胞形質導入システム１５０の第１の基板１０４’は、第１の流れフィールドの一方の縁部に沿って１以上の出口を含み、流体が第１の流れフィールドを逃げるための代替経路を可能にする。細胞形質導入システム１５０の廃棄物リザーバ１２８は、バルブ１２４の代わりに１以上の出口に連結される。第１の基板１０４’がその縁に沿って複数の出口を画定する幾つかの実施形態において、細胞導入システム１５０は、第１の基板１０４’と廃液リザーバとの間に、第１の基板１０４’からの流出流れを合体させる第５の外部流体マニホルドを含む。細胞形質導入システム１５０は、第１の基板１０４’と廃棄物リザーバ１２８との間に、その間の流体の流れをゲートする第２のバルブ１５２を含むことができる。ポンプ１３４と第１の外部流体マニホルドとの間に３ポート弁を含める代わりに、廃棄物リザーバ１２８の異なる位置が与えられると、細胞導入システム１５０は２ポート弁１２４’を使用し、この弁を通る流れを可能し、またはその流れを妨げる。

細胞形質導入システム１００および１５０の各々はまた、本明細書に記載の機能および方法を実施するために、そこに含まれるポンプおよび弁を制御するように構成されたコントローラ１７０を含むことができる。例えば、コントローラ１７０は、本明細書で開示された方法を自動的に実行するように構成されたコンピュータ実行可能な命令を、自動的にまたはユーザの指示に応答して実行する特殊目的または汎用目的のプロセッサであることができる。

図１Ａに示される細胞形質導入システム１００と、図１Ｂに示される細胞形質導入システム１５０との間の操作の違いを、図３Ｃおよび３Ｄに関連して以下で更に説明する。

図１Ｃは、図１Ａおよび１Ｂに示した細胞形質導入システム１００および１５０の何れかでの使用に適した形質導入スタック１０２の平面図を示す。具体的には、図１Ｃは、例示的な第２の基板（図示せず）に結合された第２および第３の外部流体マニホルド１１６、１１８、ならびに第３の基板１０８の一例に結合された例示的な第４の外部流体マニホルド１２０の例を示す。図１Ｃに示す例示的な第４の外部流体マニホルド１２０は、第３の基板１０８における第２の複数の開口部に一致する貫通孔に結合した第４の基板のチャネルを介して、流体を、第３の基板１０８の頂部を横切って分配する。幾つかの実施形態では、同様の流体マニホルドを、第１の外部流体マニホルドのために使用することができる。

図１Ｄは、第１および第４の外部流体マニホルド１１４および１２０としての使用に適した、別のマニホルドの例を示す。図１Ｃに示す第４の外部流体マニホルドは、主に２次元でのみ流体を分配するのに対して、図１Ｄの流体マニホルドは本質的に３次元であり、流体を３次元で分配する（ただし、その出力口は依然として２次元に配置される）。

図１Ｅは、細胞形質導入システム１００および１５０での使用に適した、例示的な形質導入スタック１０２の斜視切欠き図を示す。同様の参照番号は、図１Ａおよび図１Ｂの同様の特徴を指す。図１Ｅは、図１Ａおよび図１Ｂには示されていない第１の流れフィールド１４２、第２の流れフィールド１４４、第３の流れフィールド１４６、および細胞随伴キャビティ１４８の例を示す。

図２は、遺伝子情報を細胞に導入する例示的方法２００のブロック図を示す。方法２００は、例えば、図１Ａおよび図１Ｂに示した細胞形質導入システム１００および１５０を使用して実施することができる。方法２００は、第１の流れフィールドに細胞を導入すること（ステップ２０２）と、第１の流れフィールドに遺伝子情報導入剤を導入すること（ステップ２０４）と、導入された細胞および導入された遺伝子情報導入剤を、細胞随伴キャビティの中に随伴させること（ステップ２０６）を含む一方、細胞随伴キャビティの遠位端を通る細胞および遺伝子情報導入剤の通過を防止すること（ステップ２０８）を含む。方法２００は更に、細胞を随伴キャビティから放出すること（ステップ２１０）、放出された細胞から遺伝子情報導入剤を洗浄すること（ステップ２１２）、放出され洗浄された細胞を収集すること（ステップ２１４）を含む。上記ステップの各々について、方法２００の様々なステップを示す図１Ａおよび図１Ｂ、ならびに図３Ａ～図３Ｅを参照して、以下で更に説明する。

方法２００は、第１の流れフィールドに細胞を導入することを含む（ステップ２０２）。方法２００において参照される第１の流れフィールドは、例えば、細胞形質導入システム１００および１５０において、第２の基質１０６により画定される第２の流れフィールド１４４であることができる。細胞は、幾つかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法レジメンの一部として、形質導入のために選択されたＴ細胞であることができる。他の適切な細胞型には、上皮細胞、内皮細胞、がん細胞、造血幹細胞、間葉間質細胞、人工多能性幹細胞、ならびに遺伝子編集、エクスビボ遺伝子治療および幹細胞再プログラミング用途において使用される胚性幹細胞が含まれる。細胞は、細胞培地のような液体に懸濁させながら導入することができる。細胞を含む培地は、ポンプ１３４によって、上述した水平流システムを通してポンプ輸送することができる。細胞は、サンプルリザーバ１３８から第２の外部流体マニホルド１１６を通って、第２の流れフィールド１４４へとポンプ輸送することができる。幾つかの実施形態において、バルブ１３６は、第２の流れフィールドを出る流体をポンプ１３４に戻すように設定され、再循環流を生成し、十分な数の細胞が第２の基板１０６内に随伴されるようになっている（ステップ２０６に関連して以下で更に述べる通りである）。幾つかの実施形態においては、細胞が導入される前に、最初に細胞の存在しない細胞培地を、液体リザーバ１２６から水平流システムを通してポンプ輸送し、形質導入スタック１０２がプライミングされる。

ウイルス、ウイルスベクター、脂質ナノ粒子、プラスミド、ＣＲＩＳＰＲ複合体、または他の核酸ベクターのような遺伝子情報導入剤もまた、流れフィールドに導入される（ステップ２０４）。幾つかの実施形態において、遺伝子情報導入剤は、サンプルリザーバ１３８内の細胞と同じ流体中に懸濁される。幾つかの実施形態において、サンプルリザーバ１３８は、細胞および遺伝子情報導入剤を、形質導入スタックにポンプ輸送されるまで互いに分離した状態に保つ別々の区画を含み、区画からの流れは、細胞形質導入システム１００または１５０の水平流システムを通して流れるときに合体される。幾つかの実施形態において、第２の流れフィールド１４４に入る流体中の遺伝子情報導入剤の量は、細胞当たり約１のベクターコピー数を生成するのに十分な量である。幾つかの実施形態において、第２の流れフィールド１４４に入る流体中の遺伝子情報導入剤の量は、当該細胞集団に亘って約０．５～約２．５の平均ベクターコピー数を得るのに十分な量である。

幾つかの実施態様では、細胞および遺伝子情報導入剤が流れフィールドに同時に導入される（ステップ２０２および２０４）。幾つかの他の実施態様において、細胞の導入（ステップ２０２）および遺伝子情報導入剤の導入（ステップ２０４）は連続的に実施される。幾つかの実施形態において、細胞は遺伝子情報導入剤の前に、流れフィールドに導入される。幾つかの実施形態おいて、遺伝子情報導入剤は細胞の前に、流れフィールドに導入される。

この方法は更に、導入された細胞および遺伝子情報導入剤を、細胞随伴キャビティに随伴させることを含む（ステップ２０６）。例えば、導入された細胞および遺伝子情報導入剤は、図１Ｅに示される細胞随伴キャビティ１４８の中に随伴されることができる。導入された細胞および遺伝子情報導入剤は、細胞形質導入システム１００または１５０の垂直流システムによって駆動される流体の流れの結果として随伴される。即ち、ポンプ１２２は、細胞培地のような流体を、第１の外部流体マニホルド１１４を通り、形質導入スタック１０２を通って垂直にポンプ輸送し、そして第４の外部マニホルド１２０を通って流出させる。幾つかの実施形態において、流体は約０．０５ｍＬ／分～約０．２ｍＬ／分の流量で流される。この流れは、第２の膜１２０に亘って約２ｍｍＨｇ～約１０００ｍｍＨｇの圧力勾配をもたらす。一般に、圧力は約７５０ｍｍＨｇ未満に維持される。幾つかの実施形態では、細胞および導入された細胞、遺伝子情報導入剤、および／または添加剤が第２の流れフィールド１４４の中へと流れている間に、垂直方向の流れが生じる。幾つかの他の実施形態では、細胞および導入された細胞、遺伝子情報導入剤、および／または添加剤が既に第２の流れフィールド１４４に導入された後に、垂直方向の流れが生じる。

図３Ａは、細胞３０２および遺伝子情報導入剤３０４を、横方向の流体フロー３０６を介して、細胞形質導入スタック１０２の第２の流れフィールド１４４に同時に導入する例を（ステップ２０２および２０４）示す。図３Ａはまた、垂直流３０８ａを介した細胞随伴キャビティ１４８内への細胞３０２および遺伝子情報導入剤３０４の取り込みを示す（ステップ２０６）。図３Ａは、２つの細胞をそれぞれ保持する細胞随伴キャビティ１４８を示しているが、様々な実施形態において、細胞随伴キャビティは、単一の細胞ないし数千、更には約１００万個の細胞を保持する寸法であることができる。

図３Ｂに示されるように、細胞３０２および遺伝子情報導入剤３０４は、遺伝子情報導入剤３０４に担持された遺伝子情報が細胞３０２に導入されるのに十分であるが、細胞３０２の生存性を危険に晒す程には長くない滞留時間だけ、細胞随伴キャビティ内に随伴されたまま残る。従って、幾つかの実施形態において、滞留時間は約５分～約７時間である。幾つかの実施形態において、滞留時間は約１０分～約２時間に設定される。幾つかの実施態様では、滞留時間は約３０分に設定される。この時間において、形質導入スタック１０２を通る垂直流３０８ａが維持される一方、細胞随伴キャビティの遠位端３１０を通る細胞３０２および遺伝子情報導入剤３０４の通過は防止される（ステップ２０８）。この通過は第２の膜１１２によって防止され、この膜は垂直流の流体が過度の圧力を蓄積することなく通過するのに十分なほど大きい細孔を有するが、細胞３０２および導入された最小の遺伝子情報導入剤の通過を防止するためには十分に小さい、例えば直径が約０．００１～約０．５ミクロンの細孔を有する。滞留時間中、水平流３０６は停止され、またバルブ１３６は閉じられる。

図２および図３Ｃおよび３Ｄに戻って参照すると、前述の休止時間の後に、細胞随伴キャビティ１４８から細胞３０４を放出し（ステップ２１０）、細胞から遺伝子情報導入剤を洗い流す（ステップ２１２）。図３Ｃは、図１Ａに示した細胞形質導入システム１００に示される形態の、細胞形質導入スタック１０２におけるこれらのステップの実施形態を示している。図３Ｄは、図１Ｂに示した細胞形質導入システム１５０に示される形態の、細胞形質導入スタック１０２’におけるこれらステップの第２の例示的実施形態を示している。図３Ｃおよび３Ｄに見られるように、滞留時間の後、全部ではないにしても多くの細胞が、遺伝子的に改変または活性化される。

両方の例において、細胞３０４は、ポンプ１２２により垂直流３０８ａの方向を逆転させ、逆垂直流３０８ｂを形成することによって放出され（ステップ２１０）、洗浄される（ステップ２１２）。このように、垂直流システムの流体は、第１の外部流体マニホルド１１４の代わりに、第４の外部流体マニホルド１２０を介して細胞導入スタック１０２または１０２’に入る。この逆流で導入される流体は、流体リザーバ１２６から引き出され、垂直流システムを介して再循環されず、それにより遺伝子情報導入剤が形質導入スタックに再導入されるのを防止する。図３Ｃに示す例では、３ポートバルブ１２４を切り替えて、細胞導入スタックを出て廃棄物リザーバ１２８へと流入する流れを方向転換することによって、再循環が防止される。図３Ｄに示す例では、弁１２４’の閉鎖と第２の弁１５６の開放により再循環が防止され、流体が形質導入スタック１０２から廃棄物リザーバ１２８へと流れる代替経路が可能になる。

図１Ａに関連して上述したように、第１の膜１１０は、遺伝子情報導入剤３０４は通過するが細胞３０２は通過させないために十分に大きい細孔を含む。従って、逆垂直流３０８ｂは、細胞３０２から遺伝子情報導入剤３０４を洗浄し、第１の外部流体マニホルド１１４（図３Ｃに示す）を通り、または第１の基板１０４の縁部を通り、画定された出口３１４を通って形質導入スタックから流出する（図３Ｄに示す）。逆方向垂直流３０８ｂは、垂直流３０８ａと同様の流速、例えば約０．０５～０．２ｍＬ／分の流速を有することができる。細胞３０２は、約３０秒～約１５分間洗浄することができる。

洗浄ステップ（ステップ２１２）の後、細胞を収集する（ステップ２１４）。細胞３０２はポンプ１３４によって集められ、図１Ａに関して述べた水平流システムを通る流体の流れを再開し、細胞３０２を形質導入スタック１０２から強制的に押し出す。幾つかの実施形態において、細胞が収集される間は逆方向の垂直流３０８ｂが維持されて、それらがデバイスを出て行くときに細胞が細胞随伴キャビティ１４８内に捕捉されるのを防止する。幾つかの他の実施形態では、細胞が回収されている間、逆方向の流体の流れ３０８ｂは停止される。図３Ｅは、形質導入細胞の収集例を示す（ステップ２１４）。幾つかの実施形態では、収集の前に、細胞を形質導入スタックに再循環させ、別の一組（複数可）の遺伝子情報導入剤へと導入して、方法２００を繰り返す。幾つかのそのような実施態様において、遺伝子情報導入剤の追加の組（複数可）は、形質導入スタックに導入された以前の組の遺伝子情報導入剤と同じ追加の遺伝子情報を担持する。幾つかの他の実施形態では、少なくとも１つの追加の組の遺伝子情報導入剤が、以前の遺伝子情報導入剤が導入された細胞に導入される異なる遺伝子情報を含み、それによって細胞への逐次的な遺伝子情報の増分導入を可能にする。

図４は、図１Ａおよび図１Ｂに示した細胞形質導入システム１００および１５０と同様の細胞形質導入システムを用いた、細胞形質導入の第２の例示的方法４００を示す。方法４００では、形質導入スタックの基板に画定された細胞随伴キャビティの中に細胞および遺伝子情報導入剤を随伴させる代わりに、細胞を形質導入スタックの中に流し、次いで、例えばデバイスの製造の際に予め遺伝子情報導入剤を含浸されている多孔質メッシュまたはゲルの中に細胞を随伴させる。遺伝子情報導入剤がデバイスの使用前にゲルまたはメッシュに導入される実施形態では、使用するまで遺伝子情報導入剤の活力を維持するために、形質導入スタックは適切な環境（例えば、冷蔵ユニット、インキュベータ、または他の環境制御デバイス）において維持することができる。従って、方法４００は、遺伝子情報導入剤を含浸させたメッシュまたはゲルに隣接する第１の流れフィールドに細胞を導入することと（ステップ４０２）、導入した細胞をメッシュまたはゲルに随伴させることと（ステップ４０４）、ゲルまたはメッシュの反対側を通る細胞の通過を防止することと（ステップ４０６）、ゲルまたはメッシュから細胞を放出することと（ステップ４０８）、放出された細胞を収集すること（ステップ４１０）を含む。このプロセスの例を図５Ａ～５Ｄに示す。他の実施形態において、遺伝子情報導入剤は、細胞の導入の前もしくは後に、またはそれと同時に、水平流システムを介して形質導入スタックに流入し、遺伝子情報導入剤は細胞に密に接触した状態でゲルまたはメッシュ内に随伴される。

図５Ａは、遺伝子情報導入剤５０８を含浸させたゲルまたはメッシュ５０６に隣接する流れフィールド５０４への細胞５０２の導入（ステップ４０２）、およびゲルまたはメッシュ５０６への細胞５０２の取込み（ステップ４０４）を示す。細胞５０２は、細胞形質導入システム１００または１５０の水平流システムのポンプ１３４により生成された水平流５１０を介して流れフィールドに導入され（ステップ４０２）、また細胞形質導入システム１００または１５０における垂直流システムのポンプ１２２によって生成された垂直流５１２によって随伴される。流速は、垂直流および逆流垂直流３０８ａおよび３０８ｂについて上述したものと同様であることができる。

図５Ｂに示すように、十分な数の細胞５０２がメッシュまたはゲル５０６に随伴された後、水平流５１０は停止されるのに対して、垂直流５１２は、図２および図３Ｂに関して上記で述べた滞留時間と同意用の滞留時間に亘って維持され、遺伝子情報導入剤が遺伝子情報を細胞５０２に導入する時間を可能にする。第２の膜１１２は、細胞およびゲルまたはメッシュ５０６から外された任意の遺伝子情報導入剤が、ゲルまたはメッシュ５０６の反対側を通過するのを防止する（ステップ４０６）。

滞留時間の後、垂直流５１２の方向が反転されて、垂直流５１２ｂを形成する。逆方向垂直流５１２ｂは、細胞をゲルまたはメッシュ５０６から放出し（ステップ４０８）、ゲルまたはメッシュ５０６から除去された任意の遺伝子情報導入剤を洗い流す。この放出ステップ（ステップ４０８）は図５Ｃに示されている。図５Ｃに見られるように、細胞５０２の全部ではないにしても、多くの細胞５０２が今や追加の遺伝子情報５１４を保持している。図５Ｄに示すように、方法４００は更に、流れフィールド５０４を通る水平流を再開することによって、放出された細胞を収集すること（ステップ４１０）を含む。

図６は、別の例示的な形質導入スタック６００の断面図を示す。この形質導入スタック６００は、図３Ａ～図３Ｅに示す形質導入スタック１０２と同様である。しかし、形質導入スタック６００は、その細胞随伴キャビティ６０４の壁に配置されたエレクトロポレーション電極６０２の追加の特徴を含む。細胞６０６がキャビティ６０４に随伴されている間に電極６０２に十分な電圧が印加されると、細胞６０４の細胞膜は一時的により透過性になり、プラスミド６１０、ＣＲＩＳＰＲ複合体、脂質ナノ粒子または他の核酸または合成核酸ベクターのような遺伝物質のより多くの受動的導入を可能にする。

図７Ａ～７Ｄは、細胞形質導入システム７００の別の実施例の様々な図を示す。図７Ａは、例示的細胞形質導入システム７００のブロック図である。図７Ｂは、細胞形質導入システム７００に含めるのに適した、例示的な細胞形質導入スタック７０２の断面図である。図７Ｃは、細胞形質導入スタック７０２における、第１または第３の基板７０４および７０８としての使用に適した例示的な基板の平面図を示す。図７Ｄは、形質導入スタック７０２出ての使用に適した、例示的な第２の基板７０６の平面図を示す。当該細胞導入システムは、幾つかの実施形態において、図２に示した方法２００に従って操作できる。

図７Ａ～７Ｄおよび図１Ａ～１Ｅを参照すると、細胞形質導入システム７００は、細胞形質導入システム１００と同様である。細胞形質導入システム１００と同様に、この細胞形質導入システムは、３つの基板、即ち、第１の基板７０４、第２の基板７０６および第３の基板７０８から形成された細胞形質導入スタック７０２を含む。第１の基板７０４は、第１の膜７１０によって第２の基板７０６から分離されている。第２の基板７０６は、第２の膜７１２によって第３の基板７０８から分離されている。細胞形質導入システム７００における第１および第２の膜７１０および７１２は、細胞形質導入システム１００で使用される第１および第２の膜１１０および１１２と実質的に同じであることができる。即ち、膜７１０および７１２は、膜１１０および１１２に適したものと同じ材料で作ることができ、第１の膜７１０の細孔径は、第１の膜１１０について上述したものと同じでよく、第２の膜７１２の細孔は、第２の膜１１２について上述した細孔と同じであってよい。

細胞形質導入システム１００と同様に、細胞形質導入システム７００もまた、流体リザーバ７２６、サンプルリザーバ７３８、および廃棄物リザーバ７２４を含むことができ、これらは上記で述べた流体リザーバ１２６、サンプルリザーバ１３８、および廃棄物リザーバ１２４と同様の構成を有することができる。細胞形質導入システム７００はまた、２つのポンプ７２２および７３４、ならびに細胞形質導入スタック７０２を介して、流体、細胞、および遺伝子情報導入剤（または他の添加剤）をポンプ輸送および方向付けするための様々なバルブを含む。ポンプ７２２および７３４は、コントローラ７７０によって制御することができる。

細胞形質導入システム１００とは対照的に、細胞形質導入システム７００は、マニホルド１１４および１２０のような、任意の垂直流体マニホルドを欠いている。その代わりに、３つの基板７０４、７０６、および７０８の全部が、両端において一体化された水平流体マニホルド７１６を含む。上述のように、一体型流体マニホルドとは、別個の基板または他の構成要素に形成される代わりに、デバイスの一組の流れチャンバと同じ基板内に形成された流体マニホルドを指す。更に、図７Ｃおよび図７Ｄに最もよく見られるように、第１、第２、および第３の基板７０４、７０６、および７０８内の流れチャンバは、図１Ｅに示された単一のより広い流れフィールド１４２、１４４および１４６の代わりに、複数の平行な流体チャネル７５２から形成されている。

流体、細胞、および遺伝子情報導入剤（または他の添加剤）が、細胞形質導入システム７００を通って導かれる様々な経路もまた、図７Ａに示されている。これらには、細胞または遺伝子情報導入剤（および／または他の添加剤）の導入前に、システム７００が緩衝液でプライミングされ、次いで細胞培地でプライミングされるプライミング経路と、細胞および遺伝子情報導入剤（および／または他の添加剤）が形質導入スタック７０２に装填される装填経路が含まれている。図７Ａはまた、細胞および遺伝子情報導入剤（または他の添加剤）を細胞随伴キャビティ７４８（例えば、図７Ｂおよび図７Ｄに示される）の中に随伴させるために、細胞培地などの流体が、形質導入スタック７０２を通って垂直に（即ち、第１、第２、および第３の基板７０４、７０６、および７０８の平面に対して垂直に）流される細胞取込み経路を示している。図７Ａはまた、洗浄経路を示しており、この経路を介して細胞媒介物のような流体が形質導入スタック７０２を通り、反転垂直流に沿って流されて細胞を細胞随伴キャビティ７４８から放出し、また放出された細胞から遺伝子情報導入剤（またはその他の添加剤）を洗い流し、第１の膜７１０を通って廃棄物リザーバ７２４へと流入する。最後に、細胞抽出経路が示されており、洗浄された細胞は、この経路を介して細胞形質導入スタック７０２から除去され、サンプル収集リザーバ７４０へと収集されることができる。

図７Ｂは、細胞形質導入システム７００での使用に適した例示的な細胞形質導入スタック７０２の断面を示している。この断面は、細胞形質導入スタック７０２の長さに沿って（即ち、図７Ａに示す形質導入スタック７０２を横切って左から右へ）取られる。この断面図は、第１、第２および第３の基板７０４、７０６および７０８、ならびに幾つかの細胞随伴キャビティ７４８のそれぞれに形成された流路を切断する。基板７０４、７０６、および７０８の各々は、約０．５ｍｍ～約４ｍｍの厚さの範囲であり得る。幾つかの実施形態において、基板７０４、７０６および７０８は、約０．５ｍｍ～約２．０ｍｍの厚さである。基板７０４、７０６および７０８は、約５．０ｃｍ～約２５ｃｍの範囲の長さおよび幅を有することができる。幾つかの実施形態では、基板７０４、７０６および７０８は、ほぼ等しい長さおよび幅を有する。幾つかの実施形態において、基板７０４、７０６、および７０８の長さ（即ち、流体チャネル７５２の軸に対して平行）は、それらの幅（即ち、流体チャネル７５２の軸に対して垂直）の広さよりも５０％～２００％長い。幾つかの実施形態において、基板７０４、７０６および７０８は、それらの長さよりも広い。

第１の基板７０４に形成された流体チャネル７５２は、約１００ミクロン～約２００ミクロン（例えば、約１４０ミクロン）の深さ、約５０ミクロン～１．０ｍｍ（例えば、約８００ミクロン）の幅、約１０ｃｍ～約２０ｃｍ（例えば、約１５ｃｍ）の長さである。第２の基板７０６に形成された流体チャネル７５２は、第１の基板７０４に形成された流体チャネル７５２と同様の長さおよび幅を有することができるが、幾つかの実施形態では、より浅い。例えば、第２の基板７０６に形成された流体チャネル７５２は、約５０ミクロン～１５０ミクロン（例えば、約６０ミクロン～約７０ミクロン）の深さを有することができる。第３の基板７０８の流体チャネル７５２は、幾つかの実施形態では、第１の基板７０４の流体チャネル７５２と同じ寸法を有する。

図７Ｂに示すように、流体随伴キャビティ７４８は、第２の基板７０６の長さに沿って不均一に分布することができる。例えば、第２の基板７０６の流体チャネル７５２の長さに沿った隣接する細胞随伴キャビティ７４８間の距離は、形質導入スタック７０２の先端（図７Ａに示される細胞随伴経路に関して）に向かって減少することができる。細胞随伴キャビティは、約１００万個の細胞に適合するような大きさの円形、正方形、または他の規則的または不規則な形状であることができる。例えば、図７Ｂに示す実施形態において、細胞随伴キャビティは、チャネル７５２の幅以下、例えば約５００ミクロン～１．０ｍｍの範囲内（例えば、約６６０ミクロン）の直径または幅を有することができる。細胞随伴キャビティ７４８は、第２の基板７０６の流体チャネル７５２上に開口し、第２の基板７０６の残りの厚さを貫通する。

図７Ｃは、図７Ａに示した細胞形質導入スタック７０２における第１および第３の基板７０４および７０８としての使用に適した、例示的な基板の平面図を示す。図７Ｃに示すように、この例示的な基板は、何れかの端部において一体化され、流体チャネル７５２によって接続されたマニホルド７１６を含む。一体化されたマニホルド７１６は主要チャネル７７１から形成され、この主要チャネルは、図７Ａに示した流体素子が結合できる基板の長さに沿ったポート７７２を備えた流体チャネル７５２に対して実質的に垂直に走る。流体チャネル７５２は、主チャネル７７１の中に直接に結合する。

図７Ｄは、図７Ａに示した細胞形質導入スタック７０２における第２の基板７０６としての使用に適した例示的な基板の平面図を示す。第２の基板の流体チャネル７５２は、高レベルの剪断および／または高剪断勾配にしばしば敏感である細胞および遺伝子情報導入剤、または他の添加剤を担持するように設計されているので、第２の基板７０６は、細胞形質導入スタック７０２の第１および第３の基板７０４および７０６を形成する基板に含まれるものよりも更に複雑な形状を備えた一体化されたマニホルド７１６を含む。図７Ｄに示されるマニホルドは、基板に形成された流体チャネル７５２に対して実質的に垂直に延びる一次チャネル７８０を含む。一次チャネル７８０は、一端において、基板の長さに沿った流体ポート７８２で終端し、そこには図７Ａに示した細胞形質導入システム７００の流体素子が結合できる。一次チャネル７８０は、それらの端部が流体ポート７８２から遠くなるにつれて、二次チャネル７８４が一次チャネル７８０から分岐するにつれて狭くなる。第２のチャネル７８４は、次に、それらが最終的に基板の流体チャネル７５２に分岐するまで、第３および第４のチャネル７８６および７８８へと分岐する。このようなマニホルドの更なる詳細は、米国特許第９，４２１，３１５号に見出すことができ、その全体を本明細書の一部として援用する。

実験結果
図７Ａ～７Ｄに示された構成を有する細胞形質導入システムを、当該システムの形質導入効率を評価するために、従来のスピノキュレーション形質導入技術と比較して試験した。図８は、この実験の結果を示す。

実験では、細胞培地に懸濁された不死化ヒトＴリンパ球細胞株（Ｊｕｒｋａｔ細胞）に由来する１００万個の細胞を、図７Ａに示すサンプル装填経路に沿って図７Ａ～７Ｄのデバイスに導入した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする市販のレンチウイルスベクターを含む培地（ＲＰＭＩ、１０％ウシ胎仔血清［ＦＢＳ］および抗生物質［Ｐ／Ｓ］を補充したもの）を０．１ｍＬ／分に維持した垂直流で３０分間流すことにより、細胞随伴キャビティ７４８の中に細胞を随伴させた。この垂直流は、図７Ａに示した細胞随伴経路に沿って細胞形質導入システム７００を通過した。次いで、新しい培地を用い、逆方向垂直流（流速０．１ｍＬ／分）で１０分間、細胞をデバイス内で洗浄した。対照サンプルについては、レンチウイルスベクターのスピノキュレーションのための標準プロトコールに従い、ＧＦＰをコードする市販のレンチウイルスベクターを用いて８００Ｇで３０分間、百万個のＪｕｒｋａｔ細胞をスピノキュレートした（例えば、遠心接種した）。両方の例において感染多重度（ＭＯＩ）は３．０であった。陰性対照サンプルはベクターなしでインキュベートした。

ＧＦＰ＋レンチウイルスベクターで処理した後、細胞をデバイス（実験サンプルの場合）またはスピノキュレーション管（対照サンプルの場合）から取り出した。細胞を新鮮なＲＰＭＩ培地に再懸濁し、標準的な細胞培養条件下で４日間培養した。培養した細胞を、前方散乱および側方散乱を用いたフローサイトメトリーで分析して、細胞における遺伝子導入効率を評価した。その結果を、生存細胞の総集団におけるレンチウイルス形質導入されたＧＦＰ＋細胞のパーセンテージとして図８に示す。

図８に示すように、本開示のデバイスは、例えばレンチウイルスベクターのような適切なベクターを用いた外因性遺伝物質の形質導入に有用である。例えば、本開示のデバイスにおいてレンチウイルスベクターで処理されたＪｕｒｋａｔ細胞は、ウイルス構築物で安定的または一過的に形質導入され、この形質導入細胞は測定可能な量のマーカータンパク質（ＧＦＰ）を発現し、その発現はウイルスベクターでの処理後に少なくとも４日間維持された。更に、対照細胞では無視できる量のマーカータンパク質しか発現しなかったので、このマーカータンパク質の発現はウイルス形質導入細胞に特異的であった。結果は更に、当該デバイスが、一般に接着細胞と比較して形質導入がより困難な、懸濁細胞を形質導入するために有効であることを示している。

より重要なことに、この結果は、本開示のデバイスが、スピノキュレーション法と比較してより大きな形質導入効率を与えることを実証する。図８に示すように、本開示のデバイスを使用して、約４５％の細胞がレンチウイルスベクターで形質導入された。これと比較して、通常のスピノキュレーション法で達成された形質導入効率は、約２３％とかなり低い。この結果は、スピノキュレーション法と比較して、本開示のデバイスが全体の形質導入率において有意な改善（約１００％）を与えることを実証している。従って、これらの結果は、本開示のデバイスが、標的細胞への遺伝子送達のために、既存のシステムおよび方法に対して有意な利点を与えることを示すものである。更に、本開示のデバイスは、細胞生存率を損なうことなく形質導入効率を改善することに留意すべきである。

本明細書は、多くの具体的な実施の詳細を含むものであるが、これらは、発明の範囲または特許請求される可能性のある範囲を限定するものではなく、むしろ特定の発明の特定の実施形態に特異的な特徴の説明として解釈されるべきである。別々の実施形態の文脈において本明細書で説明される特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて実施することもできる。逆に、単一実施形態の文脈において記載される様々な特徴は、複数の実施形態において別々に、または任意の適切なサブコンビネーションで実施することもできる。更に、特徴は、特定の組み合わせで作用するものとして上記で記述され、また当初はそのように特許請求の範囲に記載されていたとしても、特許請求の範囲に記載された組み合わせから１以上の特徴が、ある場合にはその組み合わせから切り離され得るものであり、また特許請求の範囲に記載の組合せがサブコンビネーションまたはサブコンビネーションの変形に向けられ得るものである。同様に、図面では動作が特定の順序で描かれているが、これは、望ましい動作を達成するためには示された特定の順序または一連の順番どおりに実施されること、または図示された全部の動作が実行されることを要とするとして理解されるべきではない。一定の状況では、マルチタスク処理および並列処理が有利な場合があり得る。更に、上述の実施形態における様々なシステム構成要素の分離は、全ての実施形態においてそのような分離を必要とするものとして理解されるべきではなく、記載された構成要素およびシステムは、一般に、単一の製品に一体化し、または複数の製品にパッケージ化することができる。「または」への言及は、「または」を使用して記載された任意の用語が、記載された用語の単一、複数、および全部のうちの何れかを示すように包括的であると解釈され得るものである。「第１」、「第２」、「第３」等のラベルは、必ずしも順序を示すことを意味するものではなく、類似または類似の項目または要素を単に区別するために一般的に使用される。従って、本主題の特定の実施形態が記載されている。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれるものである。場合によっては、特許請求の範囲に列挙された動作は異なる順序で実行することができ、依然として望ましい結果を達成できるものである。更に、添付の図面に示されるプロセスは、望ましい結果を達成するために、示された特定の順序または逐次的な順序を必ずしも必要としない。

Claims (11)

1. 第１の流体マニホルドに結合された少なくとも１つの第１の流れチャンバを画定する第１の基板と、
   細胞随伴層を画定する第２の基板であって、前記細胞随伴層は、
   少なくとも１つの第２の流れチャンバと、
   複数の細胞随伴キャビティであって、各細胞随伴キャビティは、一端が前記少なくとも１つの第２の流れチャンバの中へと開口し、前記第２の基板を通って延出し、少なくとも１つの細胞を保持する大きさである、複数の細胞随伴キャビティ―と、
   実質的に前記第２の基板の平面内にある前記少なくとも１つの第２の流れチャンバへの少なくとも１つの入口と、
   実質的に前記第２の基板の平面内にある前記少なくとも１つの第２の流れチャンバからの少なくとも１つの出口と
   を含む、第２の基板と、
   前記第１の基板と前記第２の基板との間に配置された第１の膜であって、前記第１の膜は、細胞の通過を防止しかつウイルス粒子の通過を可能とするため、０．１ミクロン～１．０ミクロンの第１の直径を有する、第１の複数の細孔を備える、第１の膜と、
   第２の流体マニホルドに結合された少なくとも１つの第３の流れチャンバを画定する第３の基板と、
   前記第２の基板と前記第３の基板との間に配置された第２の膜であって、前記第２の膜は、ウイルス粒子の通過を防止するために十分小さいが、細胞培地の通過を可能にするために十分に大きい第２の直径であって、前記第１の直径よりも小さい第２の直径を有する、第２の複数の細孔を備える、第２の膜、
   を含む装置であって、
   前記装置は、前記第１および第２の流体マニホルドを更に含み、
   前記第１の流体マニホルドの第１の端部は、前記第１の基板によって画定される前記少なくとも１つの第１の流体チャンバに結合し、
   前記第２の流体マニホルドの第１の端部は、前記第３の基板によって画定される前記少なくとも１つの第３の流体チャンバに結合し、
   前記第１の流体マニホルドの第２の端部は、前記第２の流体マニホルドの第２の端部に流体的に結合されて、流体が前記第１の流体マニホルド、前記第１の膜、前記複数の細胞随伴キャビティ、前記第２の膜、前記第２の流体マニホルドを通って循環し、前記第１の流体マニホルドに戻ることができるようになっている、装置。
2. 前記第１の流体マニホルドおよび前記第２の流体マニホルドのうち少なくとも１つは、垂直流マニホルドを含む、請求項１に記載の装置。
3. 前記第１の流体マニホルドおよび前記第２の流体マニホルドのうち少なくとも１つは、水平流マニホルドを含む、請求項１に記載の装置。
4. 前記第１の流体マニホルドの前記第２の端部と前記第２の流体マニホルドとの間にバルブにより結合された廃棄チャネルを更に含み、前記バルブは、前記第１の流体マニホルドの前記第２の端部から排出される流体流れを廃棄物リザーバへと選択的に迂回させるように構成される、請求項１に記載の装置。
5. 前記第１の流体マニホルドの前記第２の端部へと流体をポンプ輸送するように構成された第１のポンプを更に含む、請求項１に記載の装置。
6. 前記第２の流体マニホルドの前記第２の端部に流体をポンプ輸送するように構成された第２のポンプを含み、前記第２のポンプは、前記第１のポンプと同じポンプであるか、または前記第１のポンプとは異なる、請求項５に記載の装置。
7. 前記第１の基板は前記少なくとも１つの第１の流体チャンバの遠位端に結合された出口を更に含む、請求項１に記載の装置。
8. 前記細胞随伴キャビティは、前記少なくとも１つの第２の流体チャンバの遠位端に向かう方が、前記少なくとも１つの第２の流体チャンバの近位端に向かうよりも高い密度を有する、請求項１に記載の装置。
9. 前記細胞随伴キャビティの各々は、それぞれの細胞随伴キャビティの側壁に配置された一対のエレクトロポレーション電極を含む、請求項１に記載の装置。
10. 少なくとも１つの第１の流れチャンバを第１の流体マニホルドに結合する少なくとも１つの第１の流れチャンバを画定する第１の基板と、
    細胞随伴層を画定する第２の基板であって、前記細胞随伴層は、
    少なくとも１つの第２の流れチャンバと、
    メッシュまたは多孔質ゲルから形成された少なくとも１つの細胞随伴領域であって、前記少なくとも１つの細胞随伴領域の各々は、対応する第２の流れチャンバに隣接して配置され、遺伝子導入剤を含浸される、細胞随伴領域と、
    前記第２の基板を通って延び、且つ前記第２の基板に対して実質的に垂直に配向された第２の複数の流体通路であって、前記第２の複数の流体通路の各々は、一端において、前記少なくとも１つの第２の流れチャンバの１つの中に開口する、第２の複数の流体通路と
    を含む、第２の基板と、
    前記第１の基板と前記第２の基板との間に配置された第１の膜であって、前記第１の膜は、細胞の通過を防止しかつウイルス粒子の通過を可能とするため、０．１ミクロン～１．０ミクロンの第１の直径を有する、第１の複数の細孔を備える、第１の膜と、
    第２の流体マニホルドに結合された少なくとも１つの第３の流れチャンバを画定する第３の基板と、
    前記第２の基板と前記第３の基板との間に配置された第２の膜であって、前記第２の膜は、ウイルス粒子の通過を防止するために十分小さいが、細胞培地の通過を可能にするために十分に大きい第２の直径であって、前記第１の直径よりも小さい第２の直径を有する、第２の複数の細孔を備える、第２の膜、
    を含む装置。
11. 細胞形質導入の方法であって、
    細胞を少なくとも１つの第１の流れチャンバに導入することであって、少なくとも１つの第１の流れフィールドは、それぞれの第１の流れチャンバの領域に広がり、且つ複数の遺伝子情報導入剤が含浸されているそれぞれのメッシュまたはゲルに隣接している、導入することと、
    第１の流体を、前記少なくとも１つの第１の流れフィールドに対して実質的に垂直な第１の方向に、且つ前記メッシュまたはゲルを通して流し、それによって前記導入された細胞を前記メッシュまたはゲルの中に取り込み、且つ第１の時間前記遺伝子情報導入剤と緊密に接触させ、それによって前記遺伝子情報導入剤に担持された前記遺伝子情報を随伴細胞の中に導入することを可能にすることと、
    前記少なくとも１つの第１の流れチャンバの反対側のメッシュまたはゲルの側を通しての、前記細胞および前記遺伝子情報導入剤の通過を防止することと、
    前記第１の流体の流れの方向を第２の時間だけ反転させ、それによって前記細胞を前記メッシュまたはゲルから放出し、前記細胞を洗浄することと、
    前記放出された細胞を、収集のために前記少なくとも１つの第１の流れチャンバから流出させることと
    を含む、方法。

Images