KR20220007669A - 세포 배양을 위한 마이크로유체 장치 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20220007669A
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cells
fluid
bioreactor
grooves
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KR1020217040595A
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로버트 어네스트 노돈
오스몬드 쭌 잉 라오
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뉴사우스 이노베이션즈 피티와이 리미티드
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Abstract

본 발명은 세포를 배양하기 위한 다층 마이크로유체 생물반응기 및 방법에 관한 것이다. 홈이 있는 반투과성 기판은 관류 배양 방법을 사용하여 세포를 포획하고 성장시킬 수 있다. 마이크로유체의 기하학적 구조는 세포 증식을 위한 홈 위의 흐름 및 세포 수확을 위한 홈을 따르는 흐름을 지시한다. 일부 구현예는 세포의 성장을 위한 고밀도 및 자동화 공정에 최적화되어 있다.

Description

세포 배양을 위한 마이크로유체 장치 및 사용 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 5월 13일에 출원된 오스트레일리아 가출원 2019901630로부터 우선권을 주장하며, 그의 내용은 이 참조에 의해 본 명세서에 통합되는 것으로 간주되어야 한다.
기술분야
본 발명은 세포 배양에 사용하기 위한 마이크로유체 생물반응기 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 단일 장치에 다중 세포 배양 공정의 통합을 허용하는 고밀도 세포 배양용 마이크로유체 생물반응기에 관한 것이지만 이에만 한정되지 않는다.
세포 및 유전자 요법은 환자의 혈액으로부터 추출된 세포의 변형을 수반하며, 단일 치료로 일부 암 및 유전 질병에 대한 치료법을 제공할 수 있다. 세포 및 유전자 요법이 임상 개념 검증(proof-of-concept)으로부터 규제 승인 및 제품 라이선스에 이르기까지 진행됨에 따라, 주요 장애물은 환자 맞춤형 치료의 규모 확장이 될 것이다. 미국 및 유럽연합에서 세포 및 유전자 요법에 대한 시장은 연간 20만 건을 넘는 환자 맞춤형 치료로 성장할 것으로 예상된다. 치료 유전자로 인간 세포를 변형시키는 현재의 방법은 a) 인간 혈액으로부터 혈액 줄기 세포 또는 면역 세포를 정제하는 단계, b) 바이러스 또는 비바이러스 전달 시스템을 사용하여 치료 DNA 또는 RNA를 표적 세포 내로 도입하는 단계, c) 바이러스 진입 및 안정적인 유전체 통합을 용이하게 하기 위해 며칠 동안 조직 배양함으로써 형질도입된 세포를 유사분열 활성화하는 단계를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 상대적인 안정성, 세포에 대한 최소 독성 및 높은 유전자 전달 속도 때문에 임상 시험에 가장 일반적으로 사용되는 벡터 중 하나이다. 전통적인 공정은 플라스크 기반 수동 배양 공정을 사용하는 대규모 중앙집중식 제조 시설에 대한 상당한 투자를 수반한다. 이러한 공정은 복잡하고 노동집약적일 뿐만 아니라 작업자 실수가 발생하기 쉽고 개방형 플라스크의 사용 때문에 오염 위험이 있다. 또한, 이러한 공정은 임상 치료에 대해 규모가 쉽게 확장되지 않는다.
조직 배양에서 세포를 배양하는 현재의 방법은 규모 확장의 부족 및 특히 간세포와 같은 높은 산소 요구량을 갖는 세포 유형에 대해 바람직하지 않은 산소 변화도(gradient)로 인한 증가할 수 있는 세포 수에 대한 제한 때문에 비효율적일 수 있다. 규모가 제한된 이러한 생산 공정은 번거롭고 엄두도 못 낼 정도로 많은 비용이 든다. 또한, 알려진 조직 배양 장치는 특히 인간 배아 세포와 같이 전단 응력에 대한 내구성이 낮은 세포 유형의 경우 유체 전단 응력을 통한 벌크 매체 흐름에서 비부착 세포가 손실되기 때문에 비효율적이 될 수 있다. 이는 최대 관류(perfusion) 속도에 대한 제한을 통해 세포가 성장할 수 있는 밀도를 제한할 수 있다.
상기 문제들 중 하나 이상을 극복 또는 개선하거나, 적어도 유용한 대안을 제공하는 것이 바람직할 것이다.
문헌, 행위, 재료, 장치, 물품 등에 대한 참조를 포함하여 본 명세서에 포함된 본 발명의 배경기술에 대한 논의는 본 발명의 맥락을 설명하기 위해 포함된다. 이는 언급된 자료의 어느 것도 모든 청구범위의 우선일에 공개되었거나 알려졌거나 통상적인 일반 지식의 일부라는 것을 인정하거나 시사하는 것으로 여겨져서는 안 된다.
일 양태에서 볼 때, 본 발명은 헤더 층, 베이스 층, 및 상기 헤더 층과 상기 베이스 층 사이의 유체 투과성 유동 층을 포함하는 세포 배양용 다층 마이크로유체 생물반응기를 제공한다. 상기 유동 층은 상부 표면 및 하부 표면을 포함하되, 상기 상부 표면은 세포의 보유를 위한 하나 이상의 홈(groove)을 포함한다. 상기 베이스 층은 상기 유동 층을 가로지르는 가스 교환용 가스 유동 경로를 제공한다. 상기 헤더 층은 상기 유동 층 상부 표면 위에 유동 채널을 규정하도록 구성되되, 상기 헤더 층은 (i) 제1 입구 포트; (ii) 제1 출구 포트; (iii) 상기 제1 입구 포트와 상기 유동 채널 사이에 유체 연통을 제공하는 하나 이상의 제1 유체 입구; 및 (iv) 상기 유동 채널과 상기 제1 출구 포트 사이에 유체 연통을 제공하는 하나 이상의 제1 유체 출구를 포함한다. 상기 하나 이상의 유체 입구 및 상기 하나 이상의 유체 출구는 상기 하나 이상의 유체 입구로부터 상기 유동 채널로 들어가는 유체가 상기 하나 이상의 유체 출구를 향하는 제1 유동 방향으로 이동하도록 상기 헤더에 위치하며, 상기 제1 유동 방향은 그 안에 수용된 세포의 파괴를 최소화하기 위해 상기 적어도 하나의 홈을 가로지르고 있다. 이러한 배열에서, 세포 및 매체는 제1 입구 포트로 들어가 홈을 가로질러 흐를 수 있고, 직교 유동 방향인 제1 유동 방향으로 제1 출구 포트에서 빠져나갈 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 헤더 층은 제2 출구 포트, 및 상기 유동 채널과 상기 제2 출구 포트 사이에 유체 연통을 제공하는 하나 이상의 제2 유체 출구를 추가로 포함한다. 상기 하나 이상의 제2 유체 출구는 상기 제2 출구 포트를 통해 상기 유동 채널을 나가는 유체-이는 상기 하나 이상의 홈에 보유된 세포를 함유할 수 있음-가 상기 하나 이상의 제2 유체 출구를 향하는 제2 유동 방향으로 흐르도록 상기 헤더에 위치하며, 상기 제2 유동 방향은 상기 하나 이상의 홈을 따른다. 즉, 제2 유체 출구는 홈에 직교하여 이어지는 유동 채널의 가장자리를 따라 위치한다. 따라서, 제2 유체 출구는 세포 및 매체가 제2 출구 포트에서 제2 유동 방향으로 빠져나갈 수 있게 하는 홈의 단부에 배열될 수 있다. 통상적으로, 상기 제1 유동 방향 및 상기 제2 유동 방향은 실질적으로 직교한다.
일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 홈은 상기 하나 이상의 홈에서 세포의 비특이적 결합을 제한하도록 기능화된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 홈은 상기 하나 이상의 홈에서 세포의 비특이적 결합을 제한하는 중합체로 기능화된다. 이러한 중합체는 기판에 물리적으로 흡착되거나 공유결합될 수 있다. 이에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 Pluronic 127과 같은 PEG 공중합체가 포함된다. 표면을 부동태화하는 데 사용되는 기타 중합체에는 탄수화물 중합체(덱스트란), 또는 쯔비터이온 방오 중합체가 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 헤더 층은 제2 입구 포트, 및 상기 제2 입구 포트와 상기 유동 채널 사이에 유체 연통을 제공하는 하나 이상의 제2 유체 입구를 추가로 포함한다. 상기 하나 이상의 제2 유체 입구는 상기 하나 이상의 제2 유체 입구로부터 상기 유동 채널로 들어가는 유체가 상기 제2 유동 방향으로 상기 하나 이상의 제2 출구를 향해 흐르도록 상기 하나 이상의 홈의 종방향 차원에 실질적으로 직교하는 상기 유동 채널의 차원을 따라 위치한다. 이러한 배열은 상기 제1 방향의 직교 흐름(예를 들어 매체 관류 및 세포 시딩용) 및 상기 제2 방향의 종방향 흐름(예를 들어 세포 추출용)을 모두 허용한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 입구 포트는 하나 이상의 매체 공급원으로부터 유체를 수용하고, 상기 헤더는 상기 제2 입구 포트 내로 상기 유체 매체를 수용하기 위한 하나 이상의 제2 유체 채널을 포함한다. 바람직하게는, 상기 제2 유체 채널은 상기 다층 마이크로유체 생물반응기를 통해 수직 채널을 형성하도록, 상기 헤더 층, 상기 유동 층 및 상기 베이스 층을 통해, 동일선상으로 연장된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 입구 포트는 하나 이상의 매체 공급원으로부터 유체(예컨대 신선한 세포 및 배양 배지 중 하나 또는 양자 모두)를 수용하고, 상기 헤더는 상기 유체 매체를 상기 제1 입구 포트 내로 수용하기 위한 하나 이상의 제1 유체 채널을 포함한다. 바람직하게는 상기 제1 유체 채널은 상기 다층 마이크로유체 생물반응기를 통해 수직 채널을 형성하도록, 상기 헤더 층, 상기 유동 층 및 상기 베이스 층을 통해, 동일선상으로 연장된다.
일부 구현예에서, 상기 다층 마이크로유체 생물반응기는 상기 유동 채널을 제1 유동 채널 및 제2 유동 채널로 분리하는 선택적 투과성 막을 추가로 포함하되, 상기 선택적 투과성 막은 저분자량 대사산물의 교환을 제공한다. 이러한 배열에서, 상기 다층 마이크로유체 생물반응기는 제2 헤더를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 유체 투과성 막은 상기 헤더와 상기 제2 헤더 사이에 있음으로써 이들 사이에 상기 제2 유동 채널을 형성한다. 상기 제2 헤더는 (i) 상기 제2 유동 채널과 유체 연통하는 제2 입구 포트; 및 선택적으로 (ii) 상기 제2 유동 채널과 유체 연통하는 제2 출구 포트를 포함한다. 상기 선택적 투과성 막은 상기 제2 입구 포트로 들어가는 저분자량 유체 대사산물의 교환을 제공하고, 선택적으로 상기 제2 출구 포트를 통해 저분자량 유체 대사산물의 제거를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 헤더는 상기 유동 층 상부 표면과 접하여 얹어지도록 구성된 복수의 구조적 포스트들을 포함한다. 대안적으로/추가적으로, 상기 베이스 층은 (i) 상기 유동 층 하부 표면과 접하여 얹어지도록 구성된 복수의 구조적 포스트들; 및 (ii) 벽 또는 복수의 벽 섹션들 중 하나 또는 양자 모두를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 다층 마이크로유체 생물반응기는 상기 유동 채널의 흐름을 조절하기 위해 하나 이상의 유동 저항기(flow resistor)를 포함한다. 유동 저항기는 생물반응기의 편리한 위치에 제공될 수 있으며, 조절하는 흐름의 상류 또는 하류에 배열될 수 있다. 통상적으로, 상기 하나 이상의 유동 저항기는 길이가 저항의 양을 결정하는 구불구불한 유동 경로의 형태로 상기 헤더 층에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 다층 마이크로유체 생물반응기는 적어도 하나의 추가적인 다층 마이크로유체 생물반응기를 포함하는 스택으로 배열되도록 구성된다. 스택 내에 있는 각각의 다층 마이크로유체 생물반응기는 하나 이상의 관통 포트를 포함하되, 상기 하나 이상의 관통 포트는 상기 헤더 층, 상기 베이스 층 및 상기 유동 층 각각을 통해 동일선상으로, 통상적으로는 사용 시 수직으로 연장되고, 상기 적어도 하나의 추가적인 다층 마이크로유체 생물반응기의 상응하는 관통 포트와의 유체 연통을 제공한다. 일부 이러한 배열에서, 적어도 하나의 추가적인 다층 마이크로유체 생물반응기를 적층 배열로 위치시키기 위한 하나 이상의 정렬 특징부가 제공된다.
다른 양태에서 볼 때, 본 발명은 적어도 하나의 스택으로 배열된, 본 명세서에 개시된 바와 같은 복수의 다층 마이크로유체 생물반응기와 사용하기 위한 생물반응기 세포 배양 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 컨트롤러를 포함하고, 여기서 상기 컨트롤러는 메모리에 저장된 세포 배양 프로토콜에 따라 하나 이상의 유체 펌프의 개별적인 작동을 제어하도록 구성되고, 상기 하나 이상의 유체 펌프는 상기 적어도 하나의 스택을 통해 동일선상으로 제공된 하나 이상의 관통 포트로 유체를 전달하며, 상기 전달된 유체는 상기 저장된 세포 배양 프로토콜에 따라 상기 적어도 하나의 스택 내에 있는 각각의 마이크로유체 생물반응기의 유동 챔버로 들어간다.
일부 구현예에서, 상기 콘트롤러는 상기 콘트롤러 메모리 및 유저 인터페이스와 통신가능하게 결합된 프로세서를 포함하되, 상기 메모리는 하나 이상의 세포 배양 프로토콜을 수행하기 위한 명령을 저장하고, 상기 프로세서에 의해 실행될 때 상기 명령은 상기 컨트롤러가 상기 생물반응기 세포 배양 시스템을 작동시켜 상기 하나 이상의 세포 배양 프로토콜을 수행하도록 한다. 상기 프로세서는 다중 세포 배양 공정을 병렬로, 직접, 또는 예를 들어 클라우드 기반 서버를 통해 원격으로 제어하도록 구성될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 생물반응기 세포 배양 시스템은 (a) 상기 적어도 하나의 스택 아래에 있는 실질적으로 고정된(rigid) 베이스 플레이트; 및 (b) 상기 적어도 하나의 스택 위에 배열된 실질적으로 고정된 커버 플레이트 중 하나 또는 양자 모두를 포함한다. 이상적으로는, 상기 베이스 플레이트 및 상기 커버 플레이트 각각은 적어도 하나의 스택에 구조적 지지를 부여한다.
일부 구현예에서, 상기 실질적으로 고정된 커버 플레이트는 상기 하나 이상의 스택 내에 있는 관통 포트와 하나 이상의 유체 공급원 및/또는 폐기물 저장소 사이에 유체 연통을 제공하는 복수의 개구들을 포함한다. 상기 커버 플레이트를 통해, 다중 스택으로부터의 포트들이, 필요한 유체 공급원 및/또는 폐기물 저장소에 연결하기 위한 공통 채널 내로 모일 수 있다.
통상적으로, 상기 생물반응기 세포 배양 시스템은 상기 하나 이상의 유체 공급원과 유체 연통하는 하나 이상의 펌프를 포함하되, 상기 하나 이상의 펌프는 상기 하나 이상의 세포 배양 프로토콜에 따라 개별 커버 플레이트 개구에 유체를 전달하도록 상기 컨트롤러에 의해 작동된다.
일부 구현예에서, 상기 생물반응기 세포 배양 시스템은 상기 다층 마이크로유체 생물반응기를 적층 배열로 정렬하기 위한 하나 이상의 가이드 특징부를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 컨트롤러는, 다층 마이크로유체 생물반응기의 스택을 통해 동일선상으로, 통상적으로는 사용 시 수직으로 연장되는 세포 추출 관통 포트를 통해 스택 내에 배열되고 상기 개별 다층 마이크로유체 생물반응기의 상기 제2 출구 포트와 유체 연통하는 상기 개별 다층 마이크로유체 생물반응기의 상기 하나 이상의 홈으로부터 세포를 회수하도록 작동가능하다. 상기 하나 이상의 마이크로유체 생물반응기의 스택으로부터 추출된 세포의 오염되지 않은 수집을 위한 리셉터클을 수용하기 위한 커플링이 또한 제공될 수 있다.
또 다른 양태에서 볼 때, 본 발명은 복수의 다층 마이크로유체 생물반응기들을 포함하는 다층 생물반응기 시트를 제공한다. 상기 다층 마이크로유체 생물반응기 각각은 하나 이상의 홈 및 상기 하나 이상의 홈을 가로지르는 유체의 흐름을 제공하는 하나 이상의 관통 포트를 포함하는 배양 챔버를 포함하되, 상기 하나 이상의 관통 포트는 상기 다층 생물반응기 시트의 층들을 통해 동일선상으로 제공된다.
일부 구현예에서, 각각의 다층 생물반응기 시트는 적어도 하나의 다른 다층 생물반응기 시트를 포함하는 시트 스택 내로 배열되도록 구성되며, 상기 시트 스택 내에 있는 각각의 다층 생물반응기 시트의 관통 포트는 동일선상으로, 통상적으로는 사용 시 수직으로 연장되어, 각각의 다층 생물반응기 시트의 개별 다층 마이크로유체 생물반응기의 상기 배양 챔버와 유체 연통을 제공한다.
또 다른 양태에서 볼 때, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같은 시트 스택 내에 배열된 하나 이상의 다층 생물반응기 시트와 사용하기 위한 생물반응기 세포 배양 시스템을 제공하며, 상기 시스템은 (a) 컨트롤러-여기서 상기 컨트롤러는 메모리에 저장된 세포 배양 프로토콜에 따라 하나 이상의 유체 펌프의 작동을 개별적으로 제어함-; (b) 상기 저장된 세포 배양 프로토콜에 따라, 상기 생물반응기 세포 배양 시스템의 적어도 하나의 유체 또는 폐기물 저장소와, 상기 적어도 하나의 유체 또는 폐기물 저장소로의 또는 이로부터의 흐름을 필요로 하는 상기 시트 스택 내의 다중 관통 포트 사이에 유체 커플링을 제공하는 시트 스택 헤더; 및 (c) 상기 저장된 세포 배양 프로토콜에 따라 상기 다층 마이크로유체 생물반응기의 개별 배양 챔버로 상기 관통 포트를 통해 유체를 전달하는 하나 이상의 유체 펌프를 포함한다.
또한 하나 이상의 다층 생물반응기 시트와 사용하기 위한 생물반응기 세포 배양 시스템이 본 명세서에 개시되며, 상기 시스템은 컨트롤러의 메모리에 저장된 세포 배양 프로토콜에 따라 하나 이상의 유체 펌프의 작동을 개별적으로 제어하는 상기 컨트롤러; 상기 저장된 세포 배양 프로토콜에 따라, 상기 생물반응기 세포 배양 시스템의 적어도 하나의 유체 또는 폐기물 저장소와, 상기 적어도 하나의 유체 또는 폐기물 저장소로의 또는 이로부터의 흐름을 필요로 하는 상기 하나 이상의 다층 마이크로유체 생물반응기의 유체 포트 사이에 유체 커플링을 제공하는 커플링 헤더; 및 상기 저장된 세포 배양 프로토콜에 따라 상기 하나 이상의 다층 마이크로유체 생물반응기의 상기 유체 포트를 통해 유체를 전달하는 하나 이상의 유체 펌프를 포함하되; 상기 시스템은 하나 이상의 홈 및 상기 하나 이상의 홈을 가로지르는 유체의 흐름을 제공하는 하나 이상의 관통 포트를 포함하는 하나 이상의 다층 마이크로유체 생물반응기와 사용하도록 구성된다.
본 명세서에 기재된 다양한 양태들 각각은 하나 이상의 다른 양태의 맥락에 기재된 특징들, 변형들 및 대안들을 통합할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 개시된 방법의 공정은 본 명세서에 개시된 생물반응기의 구현예의 특징들을 통합할 수 있으며, 그러한 생물반응기의 특징들은 다른 곳에서 개시된 방법의 공정의 수행을 제공할 수 있다. 효율성을 위해, 그러한 특징들, 변형들 및 대안들은 각각의 그리고 모든 양태에 대해 반복적으로 개시되지 않았지만, 당업자는 일부 양태에 개시된 특징들, 변형들 및 대안들의 그러한 조합이 다른 양태에 대해 유사하게 적용되고, 이는 본 발명의 범위 내에 있으며 본 발명의 주제의 일부를 형성함을 이해할 것이다.
본 발명은 또한 세포를 배양하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
실질적으로 평행한 홈들의 어레이를 갖는 기판을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계;
상기 홈들 중 하나 이상 내로 세포를 도입하는 단계;
상기 홈들을 가로지르는 제1 유동 방향으로 상기 홈 어레이 위에 배양 배지의 흐름을 제공하는 단계; 및
예를 들어, 세포 생존력, 성장 또는 분화를 지원하는 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계
를 포함한다.
유리하게는 상기 홈들을 가로지르는 제1 유동 방향으로 배양 배지의 흐름(직교 흐름)을 제공하는 단계는 세포 생존력을 유지하고, 세포 성장 및/또는 세포 분화를 지원하면서 상기 하나 이상의 홈에서 세포의 보유를 허용한다.
상기 배양 배지의 흐름은 세포의 수에 따라 달라지며, 1일 1백만 개 세포 당 0.2~5 mL, 예를 들어, 1일 1백만 개 세포 당 적어도 0.3, 적어도 0.4 mL, 적어도 0.5 mL, 적어도 0.6 mL, 적어도 0.7 mL, 적어도 0.8 mL, 적어도 0.9 mL, 적어도 1 mL, 적어도 1.1 mL, 적어도 1.2 mL, 적어도 1.3 mL, 적어도 1.4 mL, 적어도 1.5 mL, 적어도 1.6 mL, 적어도 1.7 mL, 적어도 1.8 mL, 적어도 1.9 mL, 적어도 2 mL, 적어도 2.5 mL, 적어도 3 mL, 적어도 3.5 mL, 적어도 4 mL, 적어도 4.5 mL, 적어도 5 mL에 상응하는 유량으로 제공될 수 있다. 일 예에서, 유량은 1일 1백만 개 세포 당 0.5~1.5 mL, 예를 들어, 1일 1백만 개 세포 당 1 mL에 상응한다.
일 예에서, 상기 장치는 배양 배지 입구 및 출구 포트로 구성될 수 있으며, 평균 입구 속도는 예를 들어, 0.18~0.3 mm/min 사이, 또는 0.2~0.27 mm/min 사이, 예를 들어 약 0.22 mm/min 또는 0.23 mm/min으로 설정된다. 세포가 분열하고 증식함에 따라, 입구 속도는 증가할 수 있다. 일 예에서 상기 입구 속도는 세포 배양 3일째에 적어도 40~60%, 예를 들어 50% 증가한다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 상기 제1 유동 방향의 상기 홈 어레이 위의 흐름에 의해 하나 이상의 홈 내로 도입된다. 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 세포는 상기 하나 이상의 홈을 따르는 제2 유동 방향의 흐름에 의해 하나 이상의 홈 내로 도입된다.
일 예에서, 상기 장치는 세포 입구 및 출구 포트로 구성될 수 있다. 세포는 세포 입구 포트로부터 흐름에 의해 상기 장치 내로 도입될 수 있고, 정적(예를 들어, 출구 포트가 폐쇄된 경우) 또는 유동 조건(매체가 상기 장치 밖으로 흐를 수 있도록 출구 포트가 개방된 경우) 하에 (침강에 의해) 하나 이상의 홈 내로 침착되도록 허용될 수 있다.
당업자는 상기 장치 내로 도입되거나 로딩될 세포의 수가 장치 용량에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 일 예에서, 1x108 내지 1x1010개 세포가 예를 들어, 50~200 mL에 로딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 1~14일, 예를 들어, 1~10일, 1~7일, 1~5일, 1~3일, 또는 1~2일 동안 배양된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어 전단 응력을 증가시켜 홈으로부터 세포를 이동시키고 세포 회수/수확을 용이하게 하기 위해 추출 매체의 흐름을 제공함으로써 상기 배양된 세포를 수확하는 단계를 추가로 포함한다. 일반적으로, 유량을 증가시키는 것은 홈의 바닥을 따르는 전단력이 증가하기 때문에 추출 성능을 향상시킬 것이다. 예를 들어, 추출 매체의 흐름은 적어도 0.1 dyne/cm2, 적어도 0.2 dyne/cm2, 적어도 0.3 dyne/cm2, 적어도 0.4 dyne/cm2, 적어도 0.5 dyne/cm2, 적어도 0.6 dyne/cm2, 적어도 0.7 dyne/cm2, 적어도 0.8 dyne/cm2, 적어도 0.9 dyne/cm2, 적어도 1 dyne/cm2, 예를 들어 약 0.8 dynes/cm2의 전단 응력에서 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 상기 제1 유동 방향의 상기 홈 어레이 위의 흐름에 의해 수확된다. 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 세포는 상기 하나 이상의 홈을 따르는 상기 제2 유동 방향의 흐름에 의해 수확된다. 유리하게는, 상기 제2 유동 방향의 흐름은 세포 생존력 및/또는 수율을 증가시킬 수 있다.
일 예에서, 상기 장치는 세포 추출 매체 입구 및 출구 포트로 구성될 수 있으며, 평균 추출 매체 입구 속도는 예를 들어, 적어도 10 mm/min, 적어도 15 mm/min, 적어도 20 mm/min, 적어도 25 mm/min, 적어도 30 mm/min, 적어도 35 mm/min, 적어도 40 mm/min, 적어도 45 mm/min, 적어도 50 mm/min, 적어도 55 mm/min, 적어도 60 mm/min, 적어도 65 mm/min, 적어도 70 mm/min, 적어도 75 mm/min, 적어도 80 mm/min, 적어도 85 mm/min, 적어도 90 mm/min, 적어도 95 mm/min, 적어도 100 mm/min, 적어도 105 mm/min, 적어도 110 mm/min, 적어도 115 mm/min, 적어도 120 mm/min, 적어도 125 mm/min, 적어도 130 mm/min, 적어도 135 mm/min, 적어도 140 mm/min, 적어도 145 mm/min, 또는 적어도 150 mm/min로 설정된다. 예를 들어, 10~200 mm/min 사이, 또는 10~150 mm/min 사이, 예를 들어 약 70 mm/min, 약 71 mm/min, 약 72 mm/min, 약 73 mm/min, 약 74 mm/min, 약 75 mm/min, 약 76 mm/min, 약 77 mm/min, 약 78 mm/min, 약 79 mm/min, 또는 약 80 mm/min로 설정된다.
본 발명은 또한 세포를 형질감염/형질도입하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
실질적으로 평행한 홈들의 어레이를 갖는 기판을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계;
상기 홈들 중 하나 이상 내로 세포를 도입하는 단계;
상기 홈들을 가로지르는 제1 유동 방향으로 상기 홈 어레이 위에 적어도 하나의 외인성 분자의 흐름을 제공하는 단계;
상기 외인성 분자로 세포를 형질감염/형질도입하는 조건 하에 상기 세포 및 상기 적어도 하나의 외인성 분자를 인큐베이션하는 단계
를 포함한다.
유리하게는 상기 홈 어레이를 가로지르는 제1 유동 방향(직교 흐름)으로 적어도 하나의 외인성 분자(예를 들어, 바이러스 벡터)의 흐름을 제공하는 단계는 상기 외인성 분자를 그 안에 수용된 세포에 전달하는 동안 상기 하나 이상의 홈에서 세포의 보유를 허용한다. 상기 방법은 현재 시스템의 확산 제한을 극복함으로써 제공될 외인성 분자(예를 들어, 바이러스 벡터)의 상당한 감소를 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 상기 제1 유동 방향의 상기 홈 어레이 위의 흐름에 의해 하나 이상의 홈 내로 도입된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 홈들로부터 과잉의 상기 외인성 분자를 세척하기 위해 매체의 흐름을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 방법은 배양 배지의 흐름을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서 상기 배양 배지의 흐름은 상기 제1 유동 방향이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어 표적 세포의 수를 확장시키기 위해, 및/또는 예를 들어, 바이러스 벡터의 흡수를 용이하게 하기 위해 하나 이상의 항원(예를 들어, 세포 표면 수용체)을 발현하도록 상기 세포를 활성화시키기 위해, 상기 외인성 분자를 제공하는 단계 이전에 상기 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 방법은 상기 형질감염/형질도입된 세포를 배양하는 단계, 예를 들어, 형질감염/형질도입된 세포의 수를 확장시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 추출 매체의 흐름을 제공함으로써 상기 형질감염/형질도입된 세포를 수확하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 추출 매체는 제2 유동 방향으로의, 즉 상기 홈들을 따르는 흐름에 의해 제공된다.
통상적으로, 상기 제1 유동 방향 및 상기 제2 유동 방향은 실질적으로 직교하지만, 반드시 그럴 필요는 없다.
본 발명은 또한 샘플로부터 세포를 선택하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
실질적으로 평행한 홈들-여기서 상기 홈들은 세포를 선택적으로 포획하는, 그 위에 고정된 포획 시약을 포함함-의 어레이를 포함하는 기판을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계; 및
상기 고정된 포획 시약으로 세포를 선택적으로 포획하는 조건 하에서 하나 이상의 홈을 따르는 흐름에 의해 상기 하나 이상의 홈 내로 세포를 도입하는 단계
를 포함한다.
일 예에서, 상기 장치는 세포 입구 및 출구 포트로 구성될 수 있으며, 평균 입구 속도는 적어도 5~110 mm/min, 적어도 5~50 mm/min, 적어도 5~25 mm/min, 예를 들어, 약 20 mm/min, 약 21 mm/min, 또는 약 22 mm/min으로 설정된다.
일 예 또는 추가의 예에서, 상기 세포의 흐름은 약 0.2 dyne/cm2의 전단 응력에서 제공될 수 있다. 일 예 또는 추가의 예에서, 상기 세포의 흐름은 예를 들어, 적어도 0.05~1.14 dynes/cm2, 적어도 0.05~0.52 dynes/cm2, 적어도 0.05~0.26 dynes/cm2, 예를 들어 약 0.21 dynes/cm2, 0.22 dynes/cm2, 0.23 dynes/cm2으로 설정된 전단 응력에서 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 포획 시약을 상기 홈들에 고정시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은
상기 홈들에 흐름에 의해 상기 세포 포획 시약(예를 들어, 항체)을 제공하는 단계; 및
상기 포획 시약이 상기 홈들의 표면에 결합할 수 있도록 충분한 시간 동안 상기 홈 어레이를 상기 세포 포획 시약과 인큐베이션하는 단계
를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 포획 시약은 상기 홈들을 가로지르는 횡 방향의 상기 홈 어레이 위의 흐름에 의해 제공된다.
일 예에서, 상기 장치는 포획 시약 입구 및 출구 포트로 구성될 수 있으며, 평균 입구 속도는 예를 들어, 적어도 0.001~30 mm/min, 적어도 5~30 mm/min, 적어도 5~20 mm/min, 적어도 5~10 mm/min, 예를 들어, 약 5 mm/min, 약 6 mm/min, 약 7 mm/min 또는 약 8 mm/min으로 설정된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 홈들의 표면 상의 반응성 기를 차단하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은
상기 홈들에 흐름에 의해 상기 차단 시약(예를 들어, Pluronic F-127)을 제공하는 단계;
예를 들어, 세포가 상기 홈들에 비특이적으로 보유되는 것을 방지하도록, 상기 반응 기를 차단하기 위해 충분한 시간 동안 상기 홈 어레이를 상기 차단 시약과 인큐베이션하는 단계
를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 차단 시약은 상기 홈들을 가로지르는 흐름(직교 흐름)에 의해 제공된다.
일 예에서, 상기 장치는 차단 시약 입구 및 출구 포트로 구성될 수 있으며, 평균 입구 속도는 예를 들어, 적어도 0.001~30 mm/min, 적어도 5~30 mm/min, 적어도 5~20 mm/min, 적어도 5~10 mm/min, 예를 들어, 약 3 mm/min, 약 4 mm/min, 또는 약 5 mm/min으로 설정된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 추출 유체의 흐름을 제공함으로써 결합되지 않은 세포를 수확하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 추출 유체는 상기 홈들을 따르는 흐름에 의해 제공된다. 상기 추출 유체는 세포 배양 배지일 수 있다.
하나의 또는 추가의 구현예에서, 상기 방법은 결합되지 않은 세포를 상기 홈들로부터 세척하기 위해 매체의 흐름을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 매체는 상기 홈들을 따르는 흐름에 의해 제공된다. 대안적인 또는 추가의 구현예에서, 상기 세척 매체는 상기 홈들을 따르는 방향의 상기 홈 어레이 위의 흐름에 의해 제공된다.
하나의 또는 추가의 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어 세포 생존력을 유지하거나 세포를 성장시키기 위해, 배양 배지의 흐름을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 배양 배지는 상기 홈들을 따르는 흐름에 의해 제공된다. 대안적인 또는 추가의 구현예에서, 상기 배양 배지는 상기 홈들을 따르는 방향의 상기 홈 어레이 위의 흐름에 의해 제공된다. 일 구현예에서, 상기 방법은 추출 매체의 흐름을 제공함으로써 형질감염/형질도입된 세포를 수확하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 추출 매체는 상기 홈들을 따르는 흐름에 의해 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 항체 포획 시약으로부터 결합된 세포를 방출하기 위해, 예를 들어, 파파인 또는 뉴라미니다제를 사용하여, 결합된 세포를 상기 포획 시약으로부터 방출하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 시약은 상기 홈들을 따르는 또는 상기 홈들을 가로지르는 흐름에 의해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 방출된 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 외인성 분자로 세포를 형질감염/형질도입시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 결합된 세포의 방출 후, 상기 외인성 분자는 상기 홈들을 가로지르는 유동 방향의 흐름에 의해 제공된다. 세포가 결합된 경우, 상기 외인성 분자는 상기 홈들을 따르는 흐름에 의해 제공될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 상기 제1 유동 방향은 상기 하나 이상의 홈의 종방향 차원에 실질적으로 직교한다.
유리하게는 본 발명의 방법은 세포 선택(예를 들어, 항체를 사용함), 유전자 형질도입 및 세포 증식의 통합을 허용한다.
일부 구현예에서, 상기 기판은 가스 투과성이고 상기 장치는 상기 기판을 가로지르는 가스 교환용 하나 이상의 가스 유동 경로를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 가스 유동 경로는 상기 가스 투과성 기판 아래에 있다. 유리하게는, 이러한 구성은 고밀도 세포 배양을 허용하여, 현재 시스템의 확산 제한을 극복한다.
일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 가스 유동 경로는 외부 가스 공급부에 연결된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 예를 들어, 상기 장치 내로 세포를 도입하는 단계 이전에, 상기 하나 이상의 가스 경로를 가스로 충전하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 배양 배지로 상기 장치를 프라이밍하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 포획된 기포를 확산에 의해 제거하기 위해 상기 장치를 가압하는 단계를 추가로 포함한다. 이는 유체와 가스 경로 사이의 가스 압력 차이에 의해 구동된다.
또한 세포 배양용 마이크로유체 생물반응기가 본 명세서에 개시되며, 이는 배양된 세포의 보유를 위해 구성되고 유체의 축방향 흐름에 수직으로 위치하는 적어도 하나의 홈을 포함하는 적어도 하나의 유체 유동 막을 포함하는 유동 층; 상기 적어도 하나의 유동 층의 상단 층 위로 유체의 흐름이 향하도록 구성되고 상기 적어도 하나의 유동 층과 유체 연통하는 적어도 하나의 유체 입구 및 상기 적어도 하나의 유동 층과 유체 연통하는 적어도 하나의 유체 출구를 포함하는 헤더; 및 상기 헤더에 밀봉되고 상기 배양된 세포의 하단 면 위로 유체의 흐름이 향하도록 구성된 하단 층을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 입구는 신선한 세포 배지용 적어도 하나의 세포 배지 입구, 사용된 세포 배지용 적어도 하나의 세포 배지 출구, 신선한 가스용 적어도 하나의 가스 입구, 및 폐가스용 적어도 하나의 가스 출구를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포 배양용 마이크로유체 생물반응기는 또한 상기 적어도 하나의 유체 입구와 유체적으로 연결되고 매체 및 세포의 주입 또는 흡수를 위해 구성된 세포 추출/주입 포트를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 유체 유동 막은 기체 교환을 위해 구성된 소수성 막 및 저분자량 대사산물의 교환을 위한 투석 막을 포함한다. 일부 구현예에서, 용어 "저분자량"은 폐기물(암모니아, 락테이트) 또는 대사 기질(글루코스, 아미노산)과 같은 실질적으로 10,000 달톤 미만의 분자를 의미한다.
일부 구현예에서, 상기 헤더 및 하단 층의 유체 유량은 독립적으로 제어될 수 있다. 이러한 방식으로, 매체의 소비를 최소화하여 비용 효율성을 개선하고 성장 효율성을 최대화하여 세포 수율을 개선할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 유체 유동 막은 유체의 축방향 흐름에 수직으로 위치하는 관류 배양 동안 비부착성 세포 유형의 포획 및 가스 및 대사산물의 교환을 위한 반투과성 홈이 있는 기판을 포함한다. 상기 반투과성 홈이 있는 기판은 가스 교환에 사용된 표면 개질된 소수성 막(폴리디메틸실록산(PDMS)으로 제조됨) 사이에 밀봉될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 고밀도(예를 들어 표준 조직 플라스크 배양보다 100배 높음)로 성장할 수 있도록 폐기물(암모니아, 락테이트) 또는 대사 영양소(글루코스, 아미노산 등)와 같은 저분자량 대사산물을 유동 채널과 교환하기 위해 투석 막(예를 들어 재생 셀룰로스, 폴리설폰, 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 함유하는 중합체 블렌드)과 같은 선택적 투과성 막이 제공될 수 있다.
또한, 평행하게 유체 연결된, 상기 기재한 바와 같은 복수의 세포 배양용 마이크로유체 생물반응기들을 포함하는 생산 플랜트가 본 명세서에 개시되어 있다.
또한, 배양된 세포의 생산 방법이 본 명세서에 개시되어 있으며, 이는 배양된 세포의 현탁액을 상기 기재한 바와 같은 세포 배양용 마이크로유체 생물반응기 내로 도입하는 단계; 및 상기 생물반응기를 통과한 산소 및 세포 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 특징은 본 발명의 범위 내에서 본 명세서에 기재된 다른 특징들 중 임의의 하나 이상과 임의의 조합으로 조합될 수 있다.
본 발명의 구현예들은 세포 및 유전자 요법의 전달에 사용하기 위한, 확장 가능한 세포 제조 공정을 위한 다층 마이크로유체 생물반응기 설계 및 공정에 관한 것이다. 본 발명의 구현예들은 임상 요법을 위해 비용 효율적으로 확장될 수 있는 폐쇄 시스템 내에서 세포 선택, 유전자 전달, 및 배양 증식의 자동화를 제공한다. 홈이 있는 반투과성 기판은 관류 배양법을 사용하여 세포를 포획하고 성장시킬 수 있으며; 마이크로유체의 기하학적 구조는 세포 증식 배양을 위한 홈 위의 흐름, 및 통상적으로 세포 수확 또는 세포 선택을 위한 홈을 따르는 흐름을 지시하며; 세포 선택(단일클론 항체를 사용함), 유전자 형질도입 및 세포 증식 공정의 통합은 상기 마이크로유체 설계의 구현예를 사용하여 가능하게 된다. 본 발명의 구현예들은 세포 배양 배지에서 포유동물 세포의 고밀도 및 자동화된 성장에 최적화된 다층 마이크로유체 생물반응기를 제공한다.
이제 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명할 것이다. 나타낸 구현예들은 단지 예일 뿐이며 본 명세서에 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 여겨져서는 안 된다는 것을 이해해야 한다.
도 1은 일 구현예에 따른 다층 마이크로유체 생물반응기의 분해 개략도로서, 제1 유동 방향 A(직교 흐름)의 유체의 직교 흐름을 나타낸다.
도 2는 도 1의 생물반응기의 개략적인 단면도이다.
도 3은 제1 유동 방향 A 및 제2 유동 방향 B(종방향 흐름)의 흐름을 제공하는 생물반응기의 분해 개략도이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 생물반응기 헤더 층의 하부 표면(아랫면)을 예시한다.
도 5는 도 4의 헤더 층의 하부 오른쪽 코너를 확대한 등각투영도이다.
도 6은 선택적 투과성 막을 포함하고 직교 흐름이 있는 생물반응기의 분해 개략도이다.
도 7은 도 6의 장치의 개략적인 단면도이다.
도 8은 선택적 투과성 막을 포함하고 직교 흐름 및 종방향 흐름이 있는 생물반응기의 분해도이다.
도 9는 본 발명의 다른 구현예에 따른 생물반응기의 분해도이다.
도 10은 도 9의 베이스 층의 하부 오른쪽 코너를 확대한 등각투영도이다.
도 11a 및 도 11b는 각각 분해도 및 조립도에서 스택으로 배열된 복수의 생물반응기들을 나타낸다.
도 12a 내지 도 12c는 본 발명의 일 구현예에 따른 커버 플레이트의 등각 평면도 및 측면도이다.
도 13은 일 예에 따른 흐름, 산소 및 글루코스를 모델링하는 시뮬레이션 출력이다.
도 14는 일 예에 따른 24초 내지 250초 동안 홈 내로의 세포 침착을 모델링하는 시뮬레이션 출력이다.
도 15는 일 예에 따른 렌티바이러스의 수송을 모델링하는 시뮬레이션 출력이다.
도 16은 일 예에 따른 유동 저항기의 교정 데이터를 나타낸다.
도 17은 흐름이 왼쪽 입구로부터 들어가 홈 위를 이동할 때(도 17a) 또는 흐름이 상부 입구로부터 들어가 홈을 따라 이동할 때(도 17b) 시뮬레이션된 3차원 흐름을 나타낸다.
도 18은 본 발명의 일 구현예에 따른 복수의 생물반응기들을 포함하는 다층 시트의 평면도이다.
도 19는 일 구현예에 따른, 세포 로딩, 증식용 배지 관류 및 세포 추출 각각에 대한 밸브 제어를 나타내는 생물반응기의 개략도이다.
도 20은 본 발명의 생물반응기의 홈에서 Raji H2B-GFP 세포의 성장을 나타낸다.
도 21은 홈 직교흐름 관류를 사용한 Raji H2B-GFP의 증식을 나타낸다.
도 22는 직교흐름에 의한 Raji H2B GFP 세포의 불완전 회수를 나타낸다.
도 23은 본 발명의 일 구현예에 따른 생물반응기에서 TF1a-H2B-GFP의 증식을 나타낸다. TF1a-H2B-GFP 세포의 형광 이미지는 14일 동안의 증식을 나타낸다.
도 24는 GFP를 사용한 Jurkat 세포의 형질도입 및 후속 증식을 위한 본 발명의 생물반응기의 사용을 나타낸다.
도 25는 Jurkat 세포에서 GFP의 발현을 나타내는 유세포 분석을 나타낸다; 대조군(왼쪽), 형질도입 및 증식 후(오른쪽).
도 26은 Jurkat 세포의 바이러스 형질도입을 위한 밸브 및 배지 저장소를 포함하는, 도 19에 나타낸 바와 같은 생물반응기를 나타낸다.
도 27은 도 26에 나타낸 바와 같은 생물반응기와 사용된 마이크로유체 회로를 나타낸다.
도 28은 Pluronic F127 계면활성제의 구조를 나타낸다.
도 29는 종방향 흐름 동안 홈에서 CD3+ 세포의 선택적 결합에 대한 기판 화학의 효과를 나타낸다. 도 29a) 항CD3 moAb의 물리적 흡착 이전의 Pluronic F127. 도 29b) Pluronic F127 처리가 없는 항CD3 moAb. 도 29c) 항CD3 moAb의 물리적 흡착 이후의 Pluronic F127.
도 30은 CD3+ 또는 CD34+ 세포의 특이적 포획을 나타낸다.
도 31은 세포 박리 및 배양에 대한 세포 방출 효소(뉴라미니다제)의 효과를 나타낸다.
먼저 도 1을 참조하면, 본 발명의 일 구현예에 따른 세포 배양을 위해 제공된 다층 마이크로유체 생물반응기("생물반응기")(100)의 분해 개략도가 나타나 있다. 생물반응기(100)는 헤더 층(200), 베이스 층(400), 및 상기 헤더 층과 상기 베이스 층 사이에 위치하는 유체 투과성 유동 층(300)을 포함한다.
유동 층(300)은 상부 표면(310) 및 하부 표면(320)을 포함하되, 상기 상부 표면은 세포(50)의 보유를 위한 상기 유동 층 상부 표면에 홈 어레이를 형성하는, 적어도 하나의, 그리고 통상적으로 여러 개의 홈(312)을 포함한다(도 2). 베이스 층(400)은, 예를 들어 유동 층(300)을 둘러싸는 베이스 층 플랜지에 결합함으로써 직접적으로, 또는 생물반응기의 3개 층의 각각과 함께 결합함으로써 간접적으로 헤더 층(200)에 밀봉된다. 베이스 층(400)은 가스 투과성 유동 층(300)을 가로지르는 가스 교환용 가스 유동 경로(410)를 제공한다. 호흡 가스(공기 + 10% CO2)는 가스 입구 포트(430)를 통해 가스 유동 경로(410)로 들어가고 호기 가스(expired gas)는 가스 출구 포트(440)을 통해 빠져나간다.
유동 층(300)은 가스 투과성이므로, 가스 유동 경로(410)의 가스는 홈이 있는 층을 통해 관류하며, 유동 채널(60)에 보유된 세포(50)와 교환된다. 추가로, 유동 채널(60)을 통해 순환되는 매체 내에 함유된 가스도 세포(50)에 의해 흡수된다.
헤더 층(200)은 헤더(300)의 하부 표면(320)과 유동 층의 상부 표면 사이에 형성되는 유동 채널(60)에 하나 이상의 제1 유체 입구(212)를 공급하는 제1 입구 포트(210)를 갖는다. 따라서, 홈(312)은 세포(50)가 침착되고 성장하는 배지 챔버의 바닥(floor)을 형성한다. 통상적으로, 제1 입구 포트(210)는 제1 입구들(212)을 통해 세포 및 배양 배지의 전달을 용이하게 한다. 유동 채널(60)의 반대쪽에 위치한 하나 이상의 제1 유체 출구(222)는 폐 유체의 제거를 용이하게 하기 위해 제공되는 제1 출구 포트(220)와의 유체 연통을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포 수확은 출구 포트(220)를 통해 일어날 수도 있다.
제1 유체 입구(212) 및 제1 유체 출구(222)는 유동 채널(60)로 들어가는 유체가 흐름이 홈(312)을 가로질러 향하도록 유체 출구를 향하는 유체 입구로부터 제1 유동 방향 A로 이동하도록 헤더에 위치한다. 이 직교 유동 방향은 하나 이상의 홈(312) 내로 세포를 로딩하는 데 사용될 수 있다. 세포는 흐름에 의해 유동 채널(60) 내로 도입되고, 유동 조건 하에서도 세포와 주변 유체와의 밀도 차이로 인한 침강에 의해 하나 이상의 홈 내로 침착된다. 세포는 낮은 전단 응력의 영역에 침착되고 유동 조건 하에서도 침착 및 유체역학적 힘에 의해 거기에 유지된다. 세포 배양 배지는 홈(312)의 상단을 가로질러 제공되어, 세포 대사를 위한 영양소 및 성장 인자를 제공하고, 세포를 옮기지 않고 그 안에 보유된 세포에 의해 생성된 폐기물을 제거할 수 있다.
유량은 홈(312) 내로의 세포의 수송 및 침착을 조절한다. 일 예에서, 직교 유량은 직교 흐름에 의해 도입된 세포가 유체 입구 근처의 하나 이상의 홈(312) 내로 침착되도록 하는 것이다. 당업자는 세포 침착이 또한 세포 크기 및 세포 밀도와 세포가 운반되는 유체의 특성의 함수일 것임을 이해할 것이다. 마찬가지로 홈 내의 세포 보유는 세포 농도 및 유량에 의해 제어된다. 레이놀즈 수 및 장치의 기하학적 구조(예를 들어, 홈 깊이)도 세포 보유에 영향을 미친다. 레이놀즈 수는 직교 흐름 속도에 정비례하고 플레이트 분리와 반비례한다. 직교 흐름 동안, 장치 내 세포의 보유는 유체 역학 시뮬레이션에 의해 결정될 수 있는 홈의 베이스에서의 흐름 재순환의 부피에 따라 달라질 것이다. 세포가 홈을 채우도록 증식함에 따라, 세포는 홈으로부터 옮겨지고, 유동 채널(60)을 가로질러 흐르며 홈 어레이가 채워질 때까지 인접한 홈 내로 침강에 의해 침착된다.
도 1 및 도 2에 도시된 배열에서, 흐름은 방향 A, 또는 유동 층(300)에서 홈(312)의 종방향 차원을 가로지르는 "직교 흐름"이다. 통상적으로, 이러한 직교 흐름은 홈(312)의 종방향 차원에 직교(90°)하지만, 직교 흐름을 사용하여 세포 및 배양 배지를 전달하는 유익한 효과를 달성하기 위해 직교 흐름이 정확히 직교할 필요는 없다는 것을 또한 고려해야 한다. 일 구현예에서, 직교 흐름의 각도는 홈의 종방향 차원에 대하여 대략 75° 내지 90°, 바람직하게는 대략 80° 내지 90°, 더 바람직하게는 대략 85° 내지 90°의 범위이다. 일 구현예에서, 직교 흐름은 홈의 종방향 차원에 대하여 대략 90°이다.
도 3은 제1 유동 방향 A의 흐름(직교 흐름), 및 홈(312)의 종방향 차원에 상응하는 제2 유동 방향 B의 흐름(종방향 흐름)을 제공하는 본 발명의 다른 구현예에 따른 생물반응기(100)의 분해 개략도이다. 여기서, 헤더 층(200)은 유동 채널(60)에 하나 이상의 제2 유체 입구(332)를 공급하는 제2 입구 포트(330)를 추가로 포함한다. 하나 이상의 제2 유체 출구(342)는 제2 유체 입구(332)에 대해 유동 채널(60)의 반대 편에 위치하며, 유동 채널로부터 세포의 제거를 위해 제공되는 제2 출구 포트(340)와의 유체 연통을 제공한다. 도 3에 예시된 구현예에서, 제1 입구 포트(210)는 세포 및 배양 배지를 함유하는 유체를 유동 채널(60) 내로 전달하며, 폐기물은 제1 출구 포트(220)를 통해 제거되고, 세포 추출 유체(본 명세서에서 "추출 매체"로도 지칭됨)는 제2 유체 입구 포트(330)를 통해 전달되어 제2 유체 출구(342) 및 제2 유체 출구 포트(340)를 통한 제거를 위해 홈(312)을 따라 배양된 세포를 세척한다. 그러나, 제2 입구(330) 포트가 제공될 필요가 없으며, 제1 유체 입구 포트(210)는 제2 유체 출구(342) 및 제2 유체 출구 포트(340)를 통한 제거를 위해 홈(312)을 따라 배양된 세포를 세척하기 위한 세포 추출 유체를 추가로 전달할 수 있음을 이해해야 한다. 두 가지 배열 모두, 제2 유체 출구 포트(340)를 통한 세포의 제거는 종방향 유동 방향 B로 홈(312)을 따르며, 이는 제2 유체 출구(342)를 통한 제거를 위해 세포가 홈으로부터 효율적으로 옮겨지도록 할 수 있다.
명확함을 위해, 직교 흐름 및 종방향 흐름 양자 모두를 나타내는 추가의 구현예가 도 4에 제시되어 있으며, 이는 헤더 층(200)의 하부 표면, 또는 아랫면을 예시한다. 제2 출구 포트(340)는 하나 이상의 제2 유체 출구(342)를 통해 유동 채널(60)과 유체 연통한다. 도시된 구현예에서, 제2 유체 출구(342)의 쌍은 모든 유체 출구(342)를 제2 출구 포트(340)와 궁극적으로 연결하는 분기된 배열로 인접한 유체 출구의 쌍으로부터의 유체 유동 경로와 차례로 연결하는 유체 유동 경로를 형성하도록 연결된다. 이러한 배열에서, 제2 유동 방향 B로 홈(312)을 따르는 흐름(종방향 흐름)에 의해 세포(50)의 제거를 달성하는 것이 가능하다. 도 3에 도시된 구현예와 유사한 방식으로, 세포 및 배양 배지를 포함하는 유체는 제1 입구 포트(210)를 통해 들어갈 수 있으며, 이때 세포는 방향 A로 흐르는 유동 채널의 배양 배지와 함께 홈(312)을 가로질러 그리고 홈(312) 내로 전파될 수 있다. 세포 배양 공정의 종료 시, 세포는 배양된 세포가 홈(312)을 따라 제2 출구 포트(340)로 옮겨지도록 제2 출구 포트(340)를 통해 제거될 수 있다. 홈(312)을 따르는 층류(laminar) 흐름은 보유된 세포(50)를 제2 출구 포트(340)를 향해 옮기므로 이들은 생물반응기로부터의 제거를 위해 밀봉된 리셉터클에 수집될 수 있다.
당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 본 명세서에서 "입구 포트" 및 "출구 포트"의 맥락으로 사용되는 바와 같은 용어 "포트"는 유동 채널(60)에 대해 유체의 유입 및 유출을 제공하는 유동 경로의 일부로 넓게 해석되어야 한다. 예를 들어, 제1 유체 입구 포트(210)는 튜브 등(미도시)에 의해 제1 유체 공급원과 직접 유체 커플링함으로써 유체의 유입을 제공하는 구멍(도 1)으로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 제1 유체 입구 포트(210)는 제1 관통 보어(381, 382)와 유체 연통하는 보다 간접적인 유체 경로에 의해 유체의 유입을 제공하는 유체 유동 경로의 접합부(도 4)로서 제공될 수 있다.
또한 도 3에는 유동 채널(60)과의 유체 연통을 제공하는 하나 이상의 제2 유체 입구(332)와 유체 연통하는 제2 입구 포트(330)가 도시되어 있다. 하나 이상의 제2 유체 입구(332)는, 하나 이상의 제2 유체 입구(332)로부터 유동 채널(60)로 들어가는 유체가 제2 유체 방향 B로 하나 이상의 제2 유체 출구(342)를 향해 흐르도록 하나 이상의 홈(312)의 종방향 차원과 직교하는 헤더의 차원을 따라 위치한다. 헤더 층 아랫면(도 4)의 하부 오른쪽 코너를 확대한 등각투영도가 도 5에 제시되어 있으며, 이는 최종적으로 제2 유체 입구(332)를 통해 유동 채널(60) 내로 개방되는, 제2 입구 포트(330)로부터의 유체 유동 채널의 분기점의 6개의 레이어를 나타낸다. 마찬가지로, 도 5는 궁극적으로 제1 출구 포트(220)에 공통 유체 경로를 제공하는 트리 구조를 형성하는 층상 접합부에 의해 연결된 유체 연통하는 제1 유체 출구(222)를 나타낸다.
또한 도 4 및 도 5에는 구조적 포스트(250)가 도시되어 있으며, 일부 구현예에서 이는 헤더(200)의 아랫면에 제공된다. 구조적 포스트(250)는 홈(312)을 둘러싸고 홈(312) 사이에 걸쳐 있는 기판 상에서 유동 층 상부 표면(310)과 접하여 얹어지도록 구성된다. 소정 구현예에서, 헤더 층(200), 유동 층(300) 및 베이스 층(400) 중 하나 이상은 실리콘 고무(PDMS)와 같은 엘라스토머 재료로 제조될 수 있다. 구조적 포스트(250)는 헤더(200)의 설계 내로 통합되어, 사용하는 동안 유동 채널(60) 및 홈(312)의 개방성(patency)을 보장하기 위한 구조적 지지를 부여할 수 있다. 일부 구현예에서, 헤더 층(200) 및/또는 베이스 층(400)은 더 큰 강성을 제공하는 열가소성 재료로 제조될 수 있으며, 이에 따라 사용하는 동안 유동 채널(60) 및 홈(312)의 개방성을 보장하는 구조적 포스트가 더 적게 필요할 수 있다. 적합한 열가소성 재료에는 몇 가지 예를 들면 사이클릭 올레핀 공중합체(예를 들어, Zeonor® 1060R), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리스티렌, 및 폴리카보네이트가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예가 도 6의 개략도에 제시되어 있으며, 이는 유동 채널(60)을 저분자량 대사산물이 가로질러 교환할 수 있는 2개의 평행한 유동 채널로 기능적으로 분리하는 선택적 투과성 막(500)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 선택적 투과성 막(500)은 투석 막 또는 유사한 막 재료로 제조될 수 있다. 적합한 막 재료에는 재생 셀룰로스, 폴리설폰, 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함하는 중합체 블렌드가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 선택적 투과성 막(500)은 분자량이 20 kD 미만, 더 바람직하게는 15 kD 미만, 훨씬 더 바람직하게는 10 kD 미만인 분자를 교환하기에 적합한 기공 크기를 갖는 투석 막을 포함한다. 이러한 배열에서, 선택적 투과성 막(500)은 제2 헤더(700) 및 헤더(200)를 분리하여 제2 유동 채널(70)을 형성한다. 세포는 제1 입구 포트(210)를 통해 유동 채널(60)에 들어가고 홈(312) 내에 침착된다. 유체, 통상적으로 10kD 미만의 분자량을 갖는 영양소를 함유하는 베이스 배지가 제2 입구 포트(730)를 통해 제2 유동 채널(70)에 들어가고 제2 출구 포트(740)를 통해 빠져나가며, 여기서 10 kD 미만의 분자는 막(500)을 가로질러 확산되어 홈(312) 내의 세포로 영양소를 전달하기 위한 유동 채널(60)에 들어간다. 홈(312) 내의 세포에 의해 생성된 대사성 폐기물 분자는 막(500)을 가로질러 확산되고, 유동 채널(70)로 들어가고 제2 출구 포트(740)를 통해 배출된다. 한편, 성장 배지는 제1 입구 포트(210)를 통해 유동 채널(60)로 들어간다. 폐기물은 제1 출구 포트(220)를 통해 유동 채널(60)로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 모든 폐기물이 제1 출구 포트(220)를 통해 배출될 수 있기 때문에 제2 출구(740)는 제공될 필요가 없다. 그러나 이는 세포 손상을 초래할 수 있으므로 바람직하지 않을 수 있다. 도 1의 구현예에서와 같이, 도 6은 방향 A의 세포 및 매체의 직교 흐름을 제공한다. 관통 보어(381)는 세포의 전달을 위한 수직 채널을 제공하며; 관통 보어(391)는 세포의 제거를 위한 수직 채널을 제공한다. 관통 보어(481, 483)는 가스의 전달 및 제거를 위한 수직 채널을 제공한다. 도 7은 도 6의 장치의 단면도를 제공한다.
선택적 투과성 막(500)의 제공과 관련된 이점은 제2 유동 채널(70) 내로 유체를 전달하는 것이 유동 채널(60) 내로 유체를 전달하는 것과 별도로 제어될 수 있다는 것이며, 이는 채널(70) 및 채널(60)의 상이한 유량, 예를 들어 성장 배지보다 베이스 배지에 대해 더 높은 유량을 허용한다. 이는 필요한 성장 배지의 양을 감소시켜 비용 절감으로 이어질 수 있다.
도 8은 선택적 투과성 막(500)을 포함하는 또 다른 구현예를 예시하며, 이는 헤더(200)가 유동 방향 B로 홈(312)을 따르는 세포의 종방향 흐름을 제공하는 제2 출구 포트(340)를 포함하기 때문에, 직교 유동 방향 A로 세포 및 매체를 전달하는 것뿐만 아니라, 종방향 유동 방향 B로 세포를 제거하는 것 양쪽 모두가 있다. 도시된 구현예에서, 제2 입구 포트(330)는 또한 세포, 및 생물반응기(100)를 사용하는 세포 배양 프로토콜에 필요한 기타 시약의 전달을 위해 제공되며, 그 예는 본 명세서에 제공되어 있다. 도 6 내지 도 8의 구현예에서, 유동 층(200)의 상부 표면(310) 및 투과성 층(500)의 하부 표면과 함께 유동 채널(60)을 규정하는 헤더 층(200)의 전체 두께를 통해 형성된 보이드가 있음에 유의해야 한다. 관통 보어(381)는 세포의 전달을 위한 수직 채널을 제공하고, 관통 보어(383)는 세포의 제거를 위한 수직 채널을 제공하며, 관통 보어(481, 483)는 가스의 전달 및 제거를 위한 수직 채널을 제공한다.
특히, 도 1, 3, 6 및 8은 호흡 가스를 가스 유동 경로(410)로 전달하고 호기 가스를 제거하기 위해 헤더 층(200) 및 유동 층(300)을 통해 수직 채널을 형성하는 관통 보어로서의 가스 투입 채널(481) 및 가스 배출 채널(483)을 나타낸다. 일부 구현예에서, 관통 보어는 제공되어, 각각의 입구 포트로 유체를 전달하고, 생물반응기의 각각의 출구 포트로부터 유체를 제거하기 위한 수직 채널을 형성하며, 각각의 관통 보어는 생물반응기(100)의 3개의 모든 층을 통해 동일선상으로 연장되며, 각각의 유체 출구는 상응하는 채널과 유체 연통한다.
도 9는 헤더 층(200), 유동 층(300) 및 베이스 층(400)을 포함하는 또 다른 구현예에 따른 생물반응기(100)의 분해도이다. 도시되어 있지는 않지만, 헤더(200)의 특징부는 도 4와 관련하여 기재된 특징부에 상응한다. 유동 층(300)의 블록(312)은 방향 B로 연장되는 기다란 평행한 홈들을 나타낸다. 베이스 층(400)은 가스 유동 경로(410)에 공급하는 가스 입구(430) 및 가스 출구(440)를 포함한다. 추가로, 다수의 관통 보어가 나타나 있다. 도시된 구현예에서, 관통 보어(381, 382)는 세포 및 배양 배지를 각각 제1 입구 포트(210)에 전달하기 위한 수직 채널을 제공한다(하지만 이들은 대안적으로 도 6 내지 8에서와 같이 별도의 입구 포트를 통해 전달될 수 있음). 관통 보어(383 및 384)는 세포 및 추출 유체를 각각 제2 입구 포트(340)에 전달하기 위한 수직 채널을 제공한다(하지만 이들 역시 별도의 입구 포트를 통해 전달될 수 있음). 관통 보어(391 및 392)는 각각 세포의 추출 및 사용된 매체의 제거를 위한 수직 채널을 제공한다.
도 10은 도 9의 베이스 층(400)의 하부 오른쪽 코너를 확대한 등각투영도이다. 이 도면은 구조적 지지를 부여하고 사용하는 동안 가스 유동 경로(410)의 개방성을 보장하기 위해 유동 층(300)의 하부 표면(320)과 접하여 얹어지도록 구성된 베이스 층(400)의 구조적 포스트(450)를 나타낸다. 추가로, 구불구불한 벽(460)은 가스 입구 포트(430)로부터 가스 출구 포트(440)로 구불구불한 경로로 가스 흐름을 지시한다. 그러나, 벽(460)은 벽 부분 또는 섹션에 제공될 수 있거나, 단순히 가스 입구 포트(430)로부터 가스 출구 포트(440)로 흐르는 가스가 전혀 제공될 필요가 없다는 것을 이해해야 한다. 일부 구현예에서 구조적 포스트(450)는 생물반응기 차원 및/또는 재료가 유체 유동 경로의 붕괴가 낮아지도록 하는 것인 경우 대안적으로/추가로 생략될 수 있다.
일부 구현예에서, 생물반응기는 베이스 층(400)의 하단 표면에 상응하는 홈 또는 노치와 협력하는(또는 그 반대의 경우도 마찬가지임) 생물반응기의 상단 층(헤더(200) 또는 제2 헤더(700)) 상의 텅 또는 돌출부(도시되지 않음)와 같은 하나 이상의 정렬 특징부를 추가로 포함한다.
마이크로유체 장치는 특히 세포 침착 및 세포 분리 공정에 대해 매우 정밀한 흐름 제어가 필요하다. 공압 제어 흐름은 유량이 유체의 압축성보다는 유동 저항기의 유압 저항에 의존하기 때문에 시린지 펌프 또는 롤러 펌프보다 선호된다. 따라서, 일부 구현예에서 유동 저항기는 관류의 속도를 제어하기 위해 유체 경로 내로 통합된다. 도 4에 가장 잘 나타난 바와 같이, 유동 저항기(371)는 수직 채널(381)로부터 제1 입구 포트(210) 내로, 그리고 추가로 제1 유체 입구(212)를 통해 유동 채널(60) 내로, 통상적으로 세포를 함유하는 유체의 흐름 속도를 조절한다. 유동 저항기(372)는 수직 채널(382)로부터 제1 입구 포트(210) 내로, 그리고 추가로 제1 유체 입구(212)를 통해 유동 채널(60) 내로, 통상적으로 배양 배지를 함유하는 유체의 흐름 속도를 조절한다. 유동 저항기(373)(길이로 인해 유동 저항기(371)와 거의 동등한 저항을 제공함)는, 수직 채널(383 및 384)로부터의 흐름 속도를 조절하여, 각각 통상적으로 세포 및 추출 유체를 함유하는 유체를 제2 입구 포트(330) 내로, 그리고 추가로 제2 유체 입구(332)를 통해 유동 채널(60) 내로 전달한다.
본 명세서의 구현예에 나타난 유동 저항기의 성질 및 위치는 단지 예시일 뿐임을 이해해야 한다. 유동 저항기는 통상적으로 헤더 층(200) 내에 통합되지만, 이들의 위치는 유동 채널(60)의 상류 또는 하류에 있을 수 있으며, 이들의 배열은 도시된 바와 같이 구불구불하거나 길거나, 헤더 기판을 따라 또는 그 주위로 감겨지고 향하게 될 수 있거나 당업자가 알 수 있는 바와 같은 기타 배열일 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 유동 저항기의 성질 및 위치는, 적어도 부분적으로, 생물반응기(100)가 구성되는 기판 층이 차지하는 공간의 크기 및 차원 및/또는 제조 제한에 의해 결정될 수 있다.
도 11a 및 11b는 각각 분해도 및 조립도에서 스택(600)에 배열된 복수의 생물반응기들(100)을 나타낸다. 스택은 스택에 구조적 지지를 부여하는 실질적으로 고정된 베이스 플레이트(610) 및 실질적으로 고정된 커버 플레이트(620)를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 포스트(도시되지 않음)와 같은 가이드 특징부는, 개별 생물반응기의 유체 투입 채널(381, 382, 383, 384), 유체 배출 채널(391, 392), 가스 투입 채널(481) 및 가스 배출 채널(483)을 형성하는 관통 보어의 정렬 및 흐름 개방성을 보장하기 위해 복수의 생물반응기들을 통해 제공된 동일선상의 포스트 채널(도시되지 않음)을 통해 연장된다. 도 11a 및 11b는 도 9에 도시된 3층 설계를 갖는 20개의 다층 마이크로유체 생물반응기(100)의 스택을 예시한다. 단일 다층 마이크로유체 생물반응기로부터의 층(200, 300 및 400)이 분해도(도 11a)에 나타나 있다. 유리하게는, 20개의 생물반응기 모두는 세포 배양 공정에 필요한 각각의 유체에 대해 공통 유체 공급원에 의해 공급된다. 그러나, 생물반응기들의 스택은 단일 생물반응기, 또는 예를 들어 5, 10, 20, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 100개의 생물반응기들을 포함할 수 있음을 이해해야 한다.
도 11a 및 11b에 예시된 구현예는 이동된 말초 혈액 단핵 세포에서 통상적으로 1% 빈도로 발생하는 CD34+ 세포를 선택하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 층당 200개의 홈이 있는 경우, 2x109개의 세포가 홈 내로 침착되고 약 3.5x108개 세포/ml의 밀도로 홈에서 성장할 수 있다. 일 예에서, 각각 25x3개의 층을 갖는 4개의 스택은 1010개의 세포를 정제하고 1% CD34+ 세포 분획으로부터 1010개의 세포를 증식(x100 증식)하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 생물반응기(100)는 각각 복수의 생물반응기를 포함하는 다층 시트로 제조된다. 도 18에 도시된 구현예에서, 4개의 생물반응기(100)의 유동 층은 단일 A5 크기 PDMS 시트로 형성되었다. 유동 층 시트는 상응하는 헤더 층 시트 및 베이스 층 시트와 조립되고 4개의 개별 생물반응기를 포함하는 다층 시트를 형성하도록 결합될 수 있다. 다중 생물반응기는 제조자에 의해 또는 최적화된 설계 또는 재료의 소비를 위해 결정될 수 있는 레이아웃 및 시트 크기에 따라 시트 상에 배열될 수 있다. 시트는 개별 다층 생물반응기를 형성하기 위해 절단될 수 있거나, 다층 시트 자체가 시트 스택을 형성하기 위해 적층될 수 있다. 스택의 각각의 시트에 있는 각각의 생물반응기는 동일선상으로 제공된 관통 포트를 가지며, 이는 스택이 조립될 때 스택(600)과 관련하여 논의된 방식으로 생물반응기들 중 개별적인 하나들에 유체를 전달하도록 수직으로 연장된다.
유리하게는, 생물반응기가 유체 유입 및 유체 배출 채널을 형성하는 수직 보어를 통해 평행하게 연결되기 때문에, 스택 내에 있는 각각의 개별 생물반응기는 각각의 필요한 유체의 단일 공급원에 의해 공급될 수 있으며, 폐기물은 스택 내에 있는 모든 생물반응기로부터 단일 폐기물 리셉터클 내로 수집될 수 있다. 시트 스택에서 인접한 생물반응기의 상응하는 유체 입구 및 출구는 적절하게 배열된 매니폴드에 의해 유동적으로 커플링될 수 있으며, 여전히 단지 각각의 필요한 유체의 단일 공급원, 및 단일 폐기물 리셉터클을 필요로 한다.
도 12a 내지 12c는 스택(600)을 유체 공급원 및/또는 폐기물 저장소에 커플링하기 위한 튜빙을 수용하기 위해 상단 표면(610)에 복수의 개구들을 갖는 커버 플레이트(620)의 예를 더 상세하게 예시한다. 도시된 구현예에서, 세포는, 유체 유입 채널(381)을 통해 각각의 생물반응기에 차례로 공급하는 개구(681)와 튜브(도시되지 않음)를 연결함으로써 단일 백, 용기, 플라스크 또는 기타 리셉터클로부터 스택 내에 있는 모든 생물반응기로 전달될 수 있다. 배양 배지는, 유체 유입 채널(382)을 통해 각각의 생물반응기에 차례로 공급하는 개구(682)와 튜브(도시되지 않음)를 연결함으로써 단일 백, 용기, 플라스크 또는 기타 리셉터클로부터 스택 내에 있는 모든 생물반응기로 전달될 수 있다. 세포 분리가 필요한 프로토콜에서, 세포는 유체 유입 채널(383)을 통해 각각의 생물반응기에 공급하는 개구(683)와 튜브(도시되지 않음)를 연결함으로써 스택 내에 있는 모든 생물반응기로 전달될 수 있다. 추출 유체는 유체 유입 채널(384)을 통해 각각의 생물반응기에 차례로 공급하는 개구(684)와 튜브(도시되지 않음)를 연결함으로써 공급부(백, 용기, 플라스크 등)로부터 스택 내에 있는 모든 생물반응기로 전달될 수 있다. 산소와 같은 호흡 가스는 대기에 대한 개방 연결에 의해, 또는 각각의 생물반응기의 가스 유동 경로(410)에 공급하기 위한 가스 유입 채널(481)을 통해 압력 하에 캐니스터로부터 대기 또는 가스를 구동하는 펌프를 사용하여, 개구(641)를 통해 공급될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 도 11a 및 11b에 예시된 유형의 하나 이상의 스택(600)은 생물반응기 세포 배양 시스템 내로 통합된다. 이상적으로, 세포 배양 시스템은, 세포 배양 프로토콜을 수행하기 위해 필요한 시약을 함유하는 복수의 시약 백들 또는 용기들의 형태로, 그리고 커버 플레이트(620)와 같은 매니폴드를 통해 스택에 유체 커플링되는 유체 공급원 및 스택(들)을 포함하는 하우징을 갖는다. 이 시스템은 컨트롤러 메모리와 통신가능하게 커플링된 프로세서, 및 하우징 내로 이상적으로 통합되고 시스템의 오퍼레이터에 접근 가능한 터치 스크린, 및/또는 디스플레이 및 키패드를 포함할 수 있는 유저 인터페이스를 포함하는 컨트롤러를 포함한다. 메모리는 하나 이상의 세포 배양 프로토콜을 수행하기 위한 명령을 저장하고, 명령은, 프로세서에 의해 실행될 때, 컨트롤러가 하나 이상의 세포 배양 프로토콜을 수행하도록 생물반응기 세포 배양 시스템을 작동하게 한다.
하우징 내부에는 하나 이상의 유체 공급원과 연통하는 하나 이상의 유체 펌프가 있다. 펌프는 컨트롤러에 의해 작동되어, 유체 라인의 밸브의 개방과 폐쇄를 제어함으로써 컨트롤러 메모리에 저장된 세포 배양 프로토콜에 따라 개별 커버 플레이트 개구로 유체를 전달한다. 일부 구현예에서, 프로세서는 생물반응기 입구에 커플링된 압력 공급원을 독립적으로 조절하도록 구성된 마이크로컨트롤러를 포함한다.
유저 인터페이스는 하나 이상의 세포 배양 프로토콜을 메모리로부터 선택하기 위해, 또는 메모리에 입력하기 위해, 오퍼레이터로부터 하나 이상의 입력을 수신한다. 각각의 배양 프로토콜은 메모리에 저장된 상응하는 명령 세트를 가지며, 이는 프로세서에 의해 수행될 때, 컨트롤러가 선택된/입력된 프로토콜에 따라 시스템의 펌프 및 기타 구성요소를 작동하게 한다.
예를 들어, 컨트롤러는 스택을 통해 동일선상으로 연장되고 개별 생물반응기의 제2 출구 포트와 유체 연통하는 세포 추출 채널을 통해 개별 생물반응기의 홈으로부터 세포를 추출하도록 작동할 수 있다. 이상적으로, 하우징은 추출된 세포의 오염되지 않은 수집을 위해 추출 채널에 커플링된, 백, 플라스크 또는 바이알과 같은 리셉터클을 수용하기 위한 플랫폼 또는 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 컨트롤러는 데이터 액세스, 프로토콜의 변형 및 제어, 및 원격 소프트웨어 업데이트를 위해 프로세서에 대한 원격 액세스를 가능하게 하는 Wi-Fi 또는 이더넷 연결을 통해 인터넷에 연결되어 있다. 추가로, 컨트롤러는 스캐너 또는 기타 장치와 작동가능하게 커플링되어 환자 자료의 보안 추적 및 각 환자에 대한 프로토콜의 맞춤화를 위한 바코드 또는 전자 태그와 같은 식별자를 샘플로부터 자동으로 판독하거나 수신할 수 있다.
홈 어레이 중 하나 이상의 홈 내로의 세포 침착
본 발명은 홈 어레이의 하나 이상의 홈 내로 세포를 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 세포는 홈을 가로지르는 흐름(홈의 종방향 차원에 직교하는 직교 흐름) 또는 홈을 따르는 흐름(종방향 흐름)에 의해 도입될 수 있다. 세포는 유동 조건 또는 정적 조건 하에서 세포와 주변 유체의 밀도 차이로 인한 침강에 의해 침착된다. 세포를 홈 어레이 내로 도입하기 전에, 장치가 채워질 때까지 장치 내로 배양 배지를 흐르게 함으로써(직교 흐름 및/또는 종방향 흐름) 장치는 먼저 프라이밍될 수 있다. 세포는 체액(예를 들어 혈액), 처리된 또는 부분적으로 처리된 체액(예를 들어, 혈소판 및/또는 혈청을 제거하기 위해 처리된 혈액)에 존재할 수 있거나, 장치 내로 도입되기 전에 적절한 유체 매체(예를 들어, 배양 배지)에 재현탁될 수 있다.
장치는 세포 입구 및 출구 포트로 구성될 수 있다. 세포가 정적 조건 하에서 하나 이상의 홈 내로 침착되는 경우, 입구 포트로부터의 흐름에 의해 세포를 접종한 후 출구 포트는 폐쇄될 것이다.
세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 세포는 단세포 유기체 또는 다세포 유기체로부터 유래할 수 있다. 일부 경우에, 세포는 유전적으로 조작되며, 예를 들어 세포는 키메라 세포일 수 있다. 세포는 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 세포 등일 수 있다. 세포는 인간 또는 인간이 아닌 동물 또는 포유동물로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, 세포가 동물로부터 유래하는 경우, 세포는 심장 세포, 섬유아세포, 각질형성세포, 간세포, 연골세포, 신경 세포, 골세포, 골아세포, 근육 세포, 혈액 세포, 내피 세포, 줄기 세포, 면역 세포(예를 들어, T-세포, B-세포, 대식세포, 호중구, 호염기구, 비만 세포, 호산구) 등일 수 있다. 일부 경우에서, 세포는 암세포이다. 세포는 비부착성 세포주(예를 들어 L1.2, 마우스 면역 B; Jurkat, 인간 CD4+ T; Ramos, 인간 면역 B) 또는 부착성 세포주(GPE86, 마우스 배아 섬유아세포)뿐만 아니라, 1차 세포(primary cell)일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 세포는 1차 면역 세포 또는 줄기 세포와 같은 1차 세포이다. 일 구현예에서, 세포는 1차 면역 세포, 예를 들어 T 세포이다. 일 구현예에서, 세포는 비부착성이고 배양 방법은 현탁액 중 세포의 배양을 위한 것이다. 다른 구현예에서, 세포는 부착성이고, 배양 방법은 현탁액 중 부착성 세포의 배양을 위한 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "면역 세포"는 질병 및 이물질에 대해 신체를 방어하는 면역 시스템의 세포를 지칭한다. 면역 세포의 비제한적 예에는 골수 유래 수지상 세포와 같은 수지상 세포; B 세포, T 세포 및 자연 살해 세포와 같은 림프구; 및 대식세포가 포함된다. 면역 세포는, 일부 구현예에서, 골수, 비장, 또는 적합한 대상체의 혈액으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 면역 세포는 인간, 또는 원숭이, 유인원, 소, 양, 염소, 말, 당나귀, 라마, 토끼, 돼지, 마우스, 쥐, 기니피그, 햄스터, 개, 고양이 등과 같은 인간이 아닌 포유동물로부터 발생할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 면역 세포는 T-세포, 바람직하게는 인간 T-세포이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "줄기 세포"는 자가 재생 및 다중 계통 분화 양자 모두가 가능한 클론 생성 세포를 지칭한다. 줄기 세포는 기원에 따라 배아 줄기 세포(ESC) 또는 출생 후 줄기 세포/체 줄기 세포/성체 줄기 세포(ASC)로 분류된다.
배아 줄기 세포(ESC)는 배반포라고 하는 2~11일령의 배아로부터 유래할 수 있다. 이들은 생식 세포를 포함한 임의의 유형의 세포로 분화할 수 있는 전능성(totipotent)이다. ESC는 미분화 상태에서 무제한으로 전파되고 유지될 수 있기 때문에 불멸로 간주된다.
성체 줄기 세포(ASC)는 대부분의 성체 조직에서 발견된다. 이들은 하나 초과의 세포 유형으로 분화할 수 있지만 모든 세포 유형으로 분화할 수는 없는 다능성(multipotent)이다. AASC는 기원에 따라 조혈 줄기 세포(HSC) 및 중간엽 줄기 세포(MSC)로 더 분류할 수 있다. HSC는 제대혈 또는 말초혈로부터 얻을 수 있다. MSC는 태아의 중배엽 층에서 기원하고, 성체에서는 골수 줄기 세포(BMSC), 윤부(limbal) 줄기 세포, 간 줄기 세포, 진피 줄기 세포 등과 같은 다양한 조직에 존재하는 것들이다.
줄기 세포는 또한 성인 치아 치수(pulp) 조직, 유치의 치수 조직, 치주 인대, 정단 유두, 및 협측 점막을 포함하는 구강 안면 조직으로부터 분리되었다.
HSC는 무제한 자가 재생이 가능한 장기 하위세트와, 제한된 간격 동안 자가 재생하는 단기 하위세트로 나눌 수 있다. HSC는 자가 재생하지 않는 소수혈통 전구세포(oligolineage progenitor)를 생성하며, 차례로 분화 잠재력이 있는 더 제한된 자손을 생성하고, 마지막으로 골수성(단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 수지상 세포), 적혈구(적혈구세포), 거핵구(혈소판) 및 림프계(T-세포, B-세포, NK-세포)를 포함하는 기능적으로 성숙한 세포를 생성한다.
세포 배양
세포는 생존력 및/또는 세포 성장을 유지하는 조건 하에, 예를 들어, 1~14일 동안 배양될 수 있다. 성장은 세포 분열(유사분열) 또는 분화와 같은 다른 과정에 의해 특징지어질 수 있으며, 이 동안 세포는 전체 유기체의 조직 또는 기관과 유사한 기능을 할 수 있는 특정 유형으로 변할 수 있다.
배양 동안, 세포 배양 배지는 세포 대사를 위해 하나 이상의 홈에 보유된 세포에 영양소 및 성장 인자를 제공하고 세포에 의해 생성된 폐기물을 제거하기 위해 홈 어레이의 상단을 가로질러 제공된다.
일 예에서, 배양 배지는 홈 어레이를 가로질러 연속적으로 흐른다. 이러한 유형의 흐름은 본 명세서에서 "연속 흐름"으로 지칭된다. 연속 흐름은 바로 연속적인 것이다. 배지는 중단 없이 연속적으로 펌핑되어 영양소 및 성장 인자의 연속적인 스트림을 생성한다. 대안적으로, 배양 배지는 진동 흐름 또는 박동 흐름에 의해 제공될 수 있다. 진동 흐름은 평균 속도가 0인 진동 흐름을 지칭한다. 박동 흐름은 평균 속도가 0이 아닌 정상 흐름에 중첩된 진동 흐름이다.
유체가 본 명세서에 개시된 다층 마이크로유체 생물반응기의 유동 채널을 통해 흐를 때, 유체의 속도 및 점도에 따라 층류 또는 난류의 두 가지 유형 중 어느 하나의 흐름이 발생할 수 있다. 일 예에서, 세포 배양 배지는 층류에서 홈 어레이를 가로질러 관류된다. 층류는 난류가 되는 임계값 미만의 더 낮은 속도에서 발생하는 경향이 있다. 난류는 소용돌이 또는 유체 입자의 작은 패킷을 특징으로 하는 비정상 흐름 영역이며, 이는 측면 혼합을 발생시킨다. 비과학적 용어로, 층류는 매끄러운 반면, 난류는 거칠다. 통상적으로, 본 발명의 방법에 유용한 장치의 흐름은 낮은 레이놀즈 수(통상적으로 10 미만) 때문에 층류이다.
장치는 세포 배양 배지 입구 및 출구 포트로 구성될 수 있다. 배지는 시린지 펌프, 연동 펌프, 유압, 또는 온칩 마이크로펌프에 의해 입구 포트(들)로부터 홈을 가로질러 관류될 수 있다. 배지 관류는 성장 인자 및 단백질의 공급을 제어할 뿐만 아니라 세포에 대한 유체-유도된 힘의 노출을 조절한다.
단일 통과 관류 및 재순환 관류의 두 가지 관류 모드가 있다. 단일 통과 관류에서, 세포 배양 배지는 홈 어레이를 가로질러 관류되어 출구 포트(들)에 연결된 폐기물 용기(들)로 흐르게 하며, 이 동안 관류된 성장 인자, 세포 대사산물, 및 분비된 인자가 짧은 시간 동안 세포에 노출된다. 재순환 관류에서, 배지, 세포 대사산물 및 분비된 인자는 홈 어레이를 가로질러 재순환되고 더 오랜 기간 동안 세포에 노출된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "배양 배지"는 세포의 성장을 지원하기 위해 설계된 배지를 지칭한다. 세포 배양 배지는 일반적으로 적절한 에너지원 및 세포 주기를 조절하는 화합물(종종 베이스 배지 또는 기초 배지라고 지칭함)을 포함한다. 통상적인 배양 배지는 아미노산, 비타민, 무기 염, 글루코스, 및 선택적으로, 성장 인자, 호르몬, 및/또는 부착 인자의 보체로 구성된다. 배양물은 중요한 영양소(예를 들어, 글루코스)로 한 번 이상 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 예를 들어, 세포를 변형시키기 위해, 예를 들어, 성장 인자, 형질도입 증강제가 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지의 두 가지 흐름이 있으며, 하나는 통상적으로 베이스 배지 성분을 함유하고, 다른 하나는 통상적으로 높은 값의 영양소/보충제를 포함하는 성장 배지 성분을 함유한다. 영양소 외에도, 배지는 또한 pH 및 삼투압을 유지하는 것을 돕는다. 일부 구현예에서, 당업자는 배양되는 세포가 배양 배지, 및 세포 배양을 위한 조건을 결정할 것임을 이해할 것이다. 적합한 세포 배양 배지 및 배양 조건(호기성, 혐기성, 온도, pH)의 선택은 당업자의 통상적인 기술 범위 내에 있다.
O2는 스파징, 막 확산 및 매체 관류에 의해 배양물에 공급될 수 있다. 후자의 방법에서, 매체는 배양 시스템에 들어가기 전에 산소 공급 챔버를 통해 관류되어, O2의 지속적인 보충을 보장할 수 있다. 통상적으로, 배양에 인접한 저산소 조건을 피하기 위해 지속적인 산소 보충이 필요하다. 이는 높은 세포 밀도 배양에서 특히 중요하다.
일 예에서, 홈들의 어레이를 포함하는 기판은 가스 투과성이고 장치는 가스와 유체 연통하는 가스 투과성 기판 아래의 하나 이상의 가스 유동 경로를 포함한다. 예를 들어, 세포가 (하나 이상의 홈에서) 이미 배양되어 있는 가스 투과성 기판의 바로 아래에 하나 이상의 가스 유동 경로를 포함하는 것은 세포와 원하는 분위기 사이의 더 나은 가스 교환을 제공할 수 있다. 또한 기체-액체 인터페이스가 필요하지 않다.
일 예에서, 생물반응기는 특수 제작된 CO2 인큐베이터에 배치된다. 일반적으로 포유동물 세포 배양의 경우, 인큐베이터의 CO2 수준이 산소 수준을 규정한다. 인큐베이터의 온도와 CO2 수준 및 습도를 제어하는 것은 배양된 세포의 건강 및 성장에 중요하다. 대부분의 포유동물 세포주 및 1차 세포의 경우, 최적 성장 온도는 37℃이다. 대략 95%의 가습된 대기는 배양물의 건조를 피한다. CO2는 통상적으로 pH를 조절하기 위한 매체 완충제 시스템의 일부로서 필요하다. 가장 일반적으로 사용되는 CO2 - 중탄산염 완충 시스템은 7.2 내지 7.4의 pH를 제공하는 5~10% CO2의 챔버 분위기에 의존한다.
또 다른 예에서, 장치는 가스 공급부에 연결된 입구 포트 및 출구 포트로 구성된다. O2의 연속 흐름은 매체를 통해서만 가스 교환이 일어나는 전통적인 단층 배양 시스템보다 유리할 수 있다.
마이크로유체 세포 배양 시스템에서, 기판의 가스 투과성 및 용해도 미만의 압력에서의 가스의 용해로 인해, 시스템 프라이밍, 세포 현탁액 로딩 및 배지 관류 공정 동안 기포가 형성될 수 있다. 기포는 마이크로규모 세포 배양에 해로우며, 마이크로채널의 막힘 또는 세포에 대한 전단 손상으로 이어질 수 있다.
일 예에서, 가스가 유동 채널로부터 가스 채널로 투과되도록 구동하는 가스 투과성 기판을 가로질러 압력 차가 인가된다.
세포 형질감염/형질도입
본 발명은 또한 외인성 분자를 세포 내로 도입하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "외인성" 분자는 세포에 정상적으로 존재하지 않지만, 세포 내로 도입될 수 있는 분자를 지칭한다. "세포에 정상적으로 존재하는"은 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건에 의해 결정된다. 예를 들어, 조직/기관의 배아 발달 단계 동안에만 존재하는 분자는 상기 조직/기관의 성체 세포에 대한 외인성 분자이다. 마찬가지로, 열 충격에 의해 도입된 분자는 열 충격을 받지 않은 세포에 대한 외인성 분자이다. 외인성 분자는 예를 들어, 오작동하는 외인성 분자의 기능화 버전 또는 정상적으로 기능하는 외인성 분자의 오작동 버전, 또는 상이한 세포 구획에서 또는 내인성 수준보다 더 높은 수준으로 발현되는 외인성 분자를 포함할 수 있다.
외인성 분자는 화학 합성에 의해 생성된 소분자, 또는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 이들의 임의의 변형된 유도체, 또는 상기 분자들 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체와 같은 거대분자일 수 있다.
진핵 세포 내로 핵산을 의도적으로 전달하거나 도입하는 것을 통상적으로 "형질감염"이라고 지칭한다. 형질감염은 또한 다른 방법 및 세포 유형을 지칭할 수 있지만, 다른 용어가 종종 선호된다. 형질전환은 통상적으로 박테리아, 및 식물 세포를 포함한 비동물 진핵 세포에서 비바이러스성 DNA 전달을 설명하는 데 사용된다. (초나선 플라스미드 DNA 또는 siRNA 작제물과 같은) 유전 물질, 또는 심지어 항체와 같은 단백질이 "형질감염될" 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "형질감염"은 일반적으로 박테리아 세포 및 비동물 진핵 세포를 포함하는 세포 내로의 분자의 비바이러스성 전달에 관한 것이다.
세포 내로 외인성 분자를 도입하는 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 지질 매개 전달(즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포솜), 전기천공, 직접 주입, 세포 융합, 입자 충격, 인산칼슘 공침, DEAE-덱스트란 매개 전달 및 바이러스 벡터 매개 전달을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 유전자 작제물의 조작 또는 전달을 위한 벡터의 사용을 포함한다. 벡터는 복제되거나 발현될 수 있는 다른 세포 내로 외래 유전 물질을 인공적으로 운반하는 데 사용될 수 있는 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자이다. 외래 DNA를 함유하는 벡터는 "재조합 벡터"로 지칭된다. 벡터의 예에는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드, 염색체외 요소, 미니염색체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
벡터는 일반적으로 인서트(전이유전자) 및 벡터의 "백본" 역할을 하는 더 큰 서열로 구성된 DNA 서열이다. 유전 정보를 다른 세포로 전달하는 벡터의 목적은 통상적으로 표적 세포에서 인서트를 분리, 증식, 또는 발현하는 것이다. 표적 세포에서 전이유전자의 발현을 위해 특별하게 설계된 벡터는 "발현 벡터"라고 하며, 일반적으로 전이유전자의 발현을 구동하는 프로모터 서열을 갖는다. 적절한 벡터의 선택은 당업자의 지식 범위 내에 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 가장 넓은 맥락에서 취해져야 하며, TATA 박스 또는 개시제 요소를 포함하는 유전체 유전자의 전사 조절 서열을 포함하며, 이는 예를 들어 발달 및/또는 외부 자극에 반응하여, 또는 조직 특이적 방식으로, 핵산의 발현을 변경하는 추가 조절 요소(예를 들어, 상류 활성화 서열, 전사 인자 결합 부위, 인핸서 및 사일런서)가 있거나 없는 정확한 전사 개시에 필요하다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "프로모터"는 또한 재조합, 합성 또는 융합 핵산, 또는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 부여하거나, 활성화하거나, 향상시키는 유도체를 설명하는 데 사용된다. 예시적인 프로모터는 발현을 추가로 향상시키고/시키거나 상기 핵산의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경하기 위한 하나 이상의 특이적 조절 요소의 추가 카피를 함유할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산의 발현이 프로모터에 의해 제어되도록 핵산에 대해 프로모터를 위치시키는 것을 의미한다. 프로모터는 예를 들어, 내부 리보솜 진입 부위를 통해 수많은 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "바이러스"는 숙주 세포 없이는 성장하거나 복제될 수 없는 감염 개체의 임의의 커다란 군을 지칭한다. 바이러스는 통상적으로 유전 물질의 RNA 또는 DNA 코어를 둘러싸는 단백질 코트를 함유하지만, 반투과성 막은 없으며, 살아있는 세포에서만 성장 및 증식할 수 있다. 바이러스는 바이러스 유전체의 전부 또는 일부를 함유하는 벡터가 그러한 입자의 생성을 위해 적절한 세포 또는 세포주 내로 형질도입될 때와 같은 경우에 형성되는 것들을 포함한다. 생성된 바이러스 입자는 핵산을 세포 내로 전달하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 용도를 갖는다. 따라서, 바이러스는 패키징된 바이러스 유전체이다. 바이러스는 단일 입자, 입자들의 스톡 또는 바이러스 유전체를 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 바이러스 벡터는 바이러스 기원의 적어도 하나의 요소를 포함하고 바이러스 벡터 입자 또는 바이러스 내로 패키징될 수 있는 핵산 벡터 작제물을 지칭한다. 본 명세서에서 바이러스 벡터에 대한 언급은 단백질 코트 내에 패키징된 바이러스와 상호교환가능하게 사용된다. 바이러스 벡터 입자 또는 바이러스는 DNA, RNA 또는 기타 핵산을 세포 내로 전달하는 목적을 위해 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 우두바이러스(vaccinia) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터(예를 들어, HSV), 배큘로바이러스 벡터, 거대세포바이러스(CMV) 벡터, 유두종바이러스 벡터, 원숭이 바이러스(SV40) 벡터, 신드비스(Sindbis) 벡터, 셈리키삼림열바이러스(Semliki Forest virus) 벡터, 파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바이러스 벡터는 통상적으로 (비히클 또는 셔틀로서) 외인성 유전자를 세포 내로 전달하기 위해 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 조작된 바이러스를 포함한다.
바이러스 벡터 또는 바이러스 입자가 관심 유전 물질을 세포 내로 전달하는 데 사용되는 경우, 이 기술을 "형질도입"으로 지칭한다. 따라서 일반적으로, 세포를 "형질도입하는" 것은 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자를 사용하여 유전 물질을 세포 내로 전달하는 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 핵산 분자는 단일 또는 이중 가닥일 수 있고; 선형, 분지형 또는 환형일 수 있고; 임의의 길이일 수 있는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한다. 핵산은 이중체를 형성할 수 있는 것뿐만 아니라 삼중체 형성 핵산을 포함한다. 핵산은 또한 DNA 또는 RNA의 유사체 또는 유도체를 포함한다. 유사체는 하나 이상의 변경된 백본(예를 들어, 포스페이트-당 백본 유사체), 5탄당(들) 또는 핵염기(들)(예를 들어, 범용 염기, 이종 핵산)를 포함할 수 있다. 예에는 펩티드 핵산(PNA), 모르폴리노 올리고머, 잠금 핵산(LNA)뿐만 아니라, 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스 핵산(TNA)이 포함된다. 핵산은 예를 들어, 폴리펩티드, 조절 RNA(예를 들어, 마이크로RNA, 소간섭 RNA(siRNA), 안내 RNA(gRNA), 및 안티센스), 리보자임, 및 소형 헤어핀과 같은 유전자 산물을 인코딩할 수 있다.
외인성 분자(예를 들어, 벡터)는 직교 흐름 및/또는 종방향 흐름에 의해 세포의 도입과 동시에 또는 후속으로 장치 내에 도입될 수 있다. 외인성 분자(예를 들어, 벡터)는 본 명세서에 기재된 배양 방법에 의한 세포 증식 후에 장치 내에 도입될 수 있다. 외인성 분자는 바이러스 형질도입을 지원하는 리포솜 제형, 리포펙틴 또는 배양 배지를 포함하는 형질감염/형질도입을 촉진하는, 예를 들어 세포 내로의 진입을 보조, 촉진, 또는 용이하게 하는 매체에 공급될 수 있다. 일부 방법에서, 세포는 바이러스 벡터의 첨가 전에 활성화되며, 예를 들어, T 세포는 IL-7 및 IL-15와 같은 시토카인과 조합된 CD3- 및 CD28-특이적 항체를 통해 TCR 활성화 경로의 자극에 의해 활성화될 수 있다.
본 방법은 정적(예를 들어, 단일 로딩) 또는 유동 형질감염/형질도입, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 유동 형질도입 방법은 외인성 분자(예를 들어, 벡터)가 전체 형질감염/형질도입 기간 동안 장치를 통해 연속적으로 관류되는 연속 관류, 또는 바이러스 벡터가 예를 들어 연동 펌프를 사용하는 장치를 통해 재순환될 수 있는 재순환 관류를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 외인성 분자가 로딩되고 정적 조건 하에서 인큐베이션이 허용되는 경우 연속 관류가 사용된다. 단축된 형질감염/형질도입 기간 후, 외인성 분자의 새로운 스톡이 장치 내로 로딩되어 외인성 분자를 더 추가하고 세포 배양 배지 영양소/성장 인자를 보충할 수 있다.
형질감염/형질도입 후, 세포는 본 명세서에 기재된 배양 방법에 의해 증식될 수 있다. 형질감염/형질도입된 세포의 증식은 적절한 내약성 마커가 형질감염/형질도입된 DNA에 포함되는 경우 약물 선택에 의해 달성될 수 있다. 이러한 구현예에서, 약물을 함유하는 선택적인 매체가 형질감염/형질도입된 세포를 증식하는 데 사용된다.
세포 선택
본 발명은 또한 홈 상에 고정된 포획 또는 결합 시약을 사용하여 세포를 선택하는 방법을 제공한다. 항체는 포획 시약으로 사용될 수 있다. 항체는 각각, 세포가 특정 표면 항원의 발현, 또는 계통 특이적 항원의 발현의 결여에 기초하여 홈을 따라 흐를 때, 세포를 양성 또는 음성으로 선택하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 항CD34 항체를 사용한 양성 선택에 의해 CD34+ 조혈 줄기/전구세포를 선택하거나 풍부하게 하는 데 사용될 수 있다. 다른 예에서, 본 방법은 항T-세포 항체(예를 들어, CD2, CD3, CD4/CD8, T-세포 수용체 α/β)를 사용하는 T 세포를 선택하거나 풍부하게 하는 데 사용될 수 있다. 포획된 세포는 예를 들어 단백질분해 효소 키모파파인, 또는 뉴라미디나제를 사용하여 항체로부터 방출될 수 있다. 세포는 본 명세서에 개시된 배양 방법에 의해 후속적으로 증식될 수 있고/있거나 본 명세서에 개시된 방법에 의해 형질도입/형질감염될 수 있다.
항체는 다클론 또는 단일클론 항체일 수 있다. 바람직하게는, 항체 제조는 친화성-정제된다. 특히 유용한 항체는 고체 표면에 흡착된 후 반응성을 유지하며, 추가로, 완전히 건조되었을 때 구조적 완전성을 유지하고, 재수화될 때 반응성이 있다.
항체는 당업자에게 알려진 통상적인 방법을 사용하여 홈 어레이에 고정될 수 있다. "고정된" 결합 파트너는 홈에 영구적으로 또는 반영구적으로 흡착된, 매립된 또는 고정된 결합 파트너를 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 세포를 장치 내로 도입하는 단계 이전에 홈 상에 항체를 고정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 항체는 직교 흐름 및/또는 종방향 흐름에 의해 홈에 제공되고, 정적 조건 또는 유동 조건 하에 그에 흡착되도록 인큐베이션하기 위해 방치될 수 있다. 일부 구현예에서, 홈의 표면 상의 반응성 기는 포획 시약 고정 후에 차단된다. 생체분자의 비특이적 흡착을 방지하는 임의의 코팅이 사용될 수 있다. 이러한 코팅은 일반적으로 물을 결합하는 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 Pluronic 127과 같은 PEG 공중합체이다. 사용할 수 있는 다른 중합체에는 탄수화물 중합체(덱스트란) 또는 양쪽성이온 방오 중합체가 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "특이적으로 결합한다"는 샘플에 존재하는 세포 상의 다른 리간드 또는 성분보다 세포 상에 제공된 리간드와의 특정 포획 시약의 우선적인 상호작용을 지칭한다. 예를 들어, 제공된 리간드와 특이적으로 결합하는 특이적 결합제는 샘플의 다른 성분과의 임의의 비특이적 상호작용에 비해 관찰가능한 양 또는 정도로, 적합한 조건 하에서, 제공된 리간드와 결합한다. 적합한 조건은 주어진 특이적 결합제와 주어진 리간드 사이의 상호작용을 허용하는 것이다. 이러한 조건은 pH, 온도, 농도, 용매, 인큐베이션 시간 등을 포함하며, 주어진 특이적 결합제 및 리간드 쌍 간에 상이할 수 있지만, 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "항체"는 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 온전한 면역글로불린 분자뿐만 아니라 면역글로불린 분자의 단편을 지칭한다.
항체는 임의의 클래스(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 또는 하위클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 것일 수 있다. 클래스는 함유하는 중쇄의 유형에 따라 구별된다. IgG 분자는 γ-사슬로 알려진 중쇄를 포함하고; IgM는 μ-사슬을 가지고; IgA는 α-사슬을 가지고; IgE는 ε-사슬을 가지며; IgD는 δ-사슬을 가진다.
항체는 하나의 중쇄 유형(예를 들어, μ, δ, γ, α, 또는 ε)과 하나의 경쇄 유형(예를 들어, λ 또는 κ)의 결합에 의해 형성될 수 있다. 기존 항체의 기본(단량체) 단위는 이황화 결합에 의해 함께 연결된 2개의 동일한 중쇄와 2개의 동일한 경쇄로 구성되는 4개의 폴리펩티드 단위이며, 경쇄(HC 및 LC)는 또한 안정화를 위한 분자내 이황화 결합을 함유한다. 경쇄는 중쇄보다 더 짧고, 저분자량을 가진다. 항체의 일반적인 모양은 Y의 중심에 유연한 힌지(도메인 간) 영역이 있는 Y이다. 각각의 폴리펩티드 사슬은 불변 영역 및 가변 영역을 갖는다.
경쇄 가변 영역에 대한 공통 표기법은 VL이고, 경쇄 불변 영역에 대한 공통 표기법은 CL이다. 표기법은 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄의 상이한 불변 영역 도메인을 나타내는 CH1, CH2, 및 CH3를 갖는 불변 영역(CH)에 대해 유사하다. 단편 결정화가능(Fc) 영역은 중쇄(CH)로부터의 불변 영역만을 함유하지만, 단편 항원-결합 영역(Fab)은 중쇄 및 경쇄(VH 및 CL) 양쪽의 불변 도메인 및 가변 도메인을 모두 포함한다. 단편 가변 영역 FV 영역은 2개의 가변 도메인만을 함유한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "가변 영역"은 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 부분을 지칭하며, 예를 들어, CDR의 아미노산 서열; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 예를 들어, 가변 영역은 3개의 CDR과 함께 3개 또는 4개의 FR(예를 들어, FR1, FR2, FR3 및 선택적으로 FR4)을 포함한다. VH는 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "상보성 결정 영역"(동의어 CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 그 존재가 특이적 항원 결합에 대한 주요 기여자인 항체 가변 영역의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 가변 영역은 통상적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 식별되는 3개의 CDR 영역을 갖는다. 일 예에서, CDR 및 FR에 할당된 아미노산 위치는 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991](본 명세서에서 "카바트 넘버링 시스템"이라고도 지칭함)에 따라 정의된다. 카바트 넘버링 시스템에 따르면, VH FR 및 CDR은 다음과 같이 위치한다: 잔기 1~30(FR1), 31~35(CDR1), 36~49(FR2), 50~65(CDR2), 66~94(FR3), 95~102(CDR3) 및 103~113(FR4). 카바트 넘버링 시스템에 따르면, VL FR 및 CDR은 다음과 같이 위치한다: 잔기 1~23(FR1), 24~34(CDR1), 35~49(FR2), 50~56(CDR2), 57~88(FR3), 89~97(CDR3) 및 98~107(FR4).
"프레임워크 영역"(FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "온전한 항체"는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 전체 또는 전장 항체를 지칭한다. 불변 도메인은 야생형 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 야생형 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
항체는 결합가(valency)가 다를 수 있다. 일부 면역글로불린은 J 사슬을 통한 그의 Fc 도메인의 결합을 통해 다량체를 형성할 수 있다.
항체는 다클론, 단일클론, 재조합체일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "다클론 항체"는 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 항체의 혼합 집단을 지칭한다. 수식어 "다클론"은 항체 집단의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산이 필요한 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 다클론 항체는 숙주가 병원체 또는 항원에 대항하는 항체를 만들도록 유도하기 위해 숙주(예를 들어, 염소) 내로의 접종 또는 감염에 의해 전체 병원체 또는 분리된 항원을 도입하도록 만들 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "단일클론 항체"(mAb)는 실질적으로 균질한 항체의 집단, 또는 상기 항체의 집단으로부터 얻어지는 항체를 지칭한다. 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 본질적으로 동일하다. 단일클론 항체는 단일 항원 부위에 대항하여 매우 특이적이다. 또한, 통상적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대항하는 상이한 항체를 포함하는 기존의 (다클론) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대항한다. 수식어 "단일클론"은 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 얻어지는 바와 같은 항체의 특성을 지칭하며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산이 필요한 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 문헌[Kohler et al., Nature (1975) 256:495]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. "단일클론 항체"는 또한 예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature (1991) 352:624-628] 및 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol. (1991) 222:581-597]에 기재된 기법을 사용하여, 또는 당업계에 알려진 기타 방법에 의해 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
항체의 "항원 결합 단편"은 온전한 항체의 하나 이상의 가변 영역을 포함한다. F(ab')2, Fab, Fab' 및 Fv와 같은 면역글로불린 분자의 단편은 면역글로불린 단백질 구조의 특정 부분을 분해하거나 절단하기 위해 환원제 및 프로테아제를 사용하여 면역글로불린 분자로부터 선택적으로 절단될 수 있다. 면역글로불린 분자의 단편은 또한 재조합으로 제조될 수 있다.
이들이 유래된 항체의 항원(예를 들어, 폴리펩티드 항원)과 선택적으로 결합하는 일부 능력을 보유하는 이러한 항체 단편은 당업계에 잘 알려진 방법(예를 들어, 상기 Harlow 및 Lane 참조)을 사용하여 제조될 수 있으며, 하기와 같이 추가로 설명된다.
Fab 단편은 항체 분자의 1가 항원-결합 단편으로 구성되며 전체 항체 분자를 효소 파파인으로 분해하여, 온전한 경쇄 및 중쇄의 일부로 구성된 단편을 수득하여 생성될 수 있다.
항체 분자의 Fab' 단편은 전체 항체 분자를 펩신으로 처리한 후, 환원시켜, 온전한 경쇄 및 중쇄의 일부로 구성된 분자를 수득하여 얻을 수 있다. 이러한 방식으로 처리된 항체 분자 1개 당 2개의 Fab' 단편이 얻어진다.
항체의 (Fab')2 단편은 후속 환원 없이, 전체 항체 분자를 효소 펩신으로 처리하여 얻을 수 있다. (Fab')2 단편은 2개의 이황화 결합에 의해 함께 고정된 2개의 Fab' 단편의 이량체이다.
Fv 단편은 2개의 사슬로 표현되는 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 함유하는 유전자 조작 단편으로 정의된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "재조합 항체"는 (a) 면역글로불린 유전자(예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자)를 이식받은 동물(예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체; (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체; (c) 재조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체; 및 (d) 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 접합(splicing)하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체와 같은, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 지칭한다.
재조합 항체는 임의의 형식으로 생산될 수 있다. 완전한 항원 결합 부위를 보유하는 가장 작은 항원 결합 단편은 전부 가변(V) 영역으로 구성된 Fv 단편이다. 분자의 안정화를 위해 가용성이고 유연한 아미노산 펩티드 링커를 사용하여 V 영역을 scFv(단일쇄 단편 가변) 단편에 연결하거나, Fab 단편(단편, 항원-결합)을 생성하기 위해 불변(C) 도메인이 V 영역에 첨가된다. scFv 및 Fab는 원핵 숙주에서 쉽게 생산될 수 있는 광범위하게 사용되는 단편이다. 다른 항체 형식에는 이황화-결합 안정화된 scFv(ds-scFv), 단일쇄 Fab(scFab)뿐만 아니라, 디아-, 트리아- 및 테트라-바디와 같은 이량체 및 다량체 항체 형식, 또는 올리고머화 도메인에 연결된 scFv로 구성된 상이한 형식을 포함하는 미니바디(miniAb)가 포함된다. 가장 작은 단편은 낙타과 중쇄 항체 및 단일 도메인 항체(sdAb)의 VHH/VH이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "항체"는 또한 인간화 항체, 영장류화 항체, 인간 항체, 동인간화(synhumanized) 항체 및 키메라 항체를 포괄한다.
선택 후, 세포는 본 명세서에 기재된 배양 방법에 의해 증식될 수 있다. 형질감염/형질도입된 세포의 증식은 적절한 약물-내성 마커가 형질감염/형질도입된 DNA에 포함되는 경우 약물 선택에 의해 달성될 수 있다. 그러한 구현예에서, 형질감염/형질도입된 세포를 증식하기 위해 약물을 함유하는 선택적 배지가 사용된다.
세포 수확
본 발명의 방법은 수집 및 사용을 위해 유동 스트림 내로 그리고 장치의 외부로 세포를 홈으로부터 이동시키기 위해 추출 매체의 직교 흐름 및/또는 종방향 흐름을 제공하는 것을 포함하는 수확 단계를 포함할 수 있다.
추출 매체의 직교 흐름은 특히 세포의 지속적인 공급이 필요한 실험실 응용에서 특히 유용할 수 있지만, 종방향 흐름 추출이 더 효율적이며, 따라서 대규모 세포 배양 시스템에 바람직하다.
본 발명의 구현예에 따른 마이크로유체 생물반응기(100)의 설계를 안내하기 위해 수치 시뮬레이션을 사용하였다. 컴퓨터 유체 역학, 물질 전달, 및 화학 반응에 일반적으로 사용되는 COMSOL Multiphysics를 a) 세포 수송 및 마이크로홈 내로의 침착; b) 글루코스 및 산소의 흡수 및 c) 렌티바이러스 벡터의 세포 내로의 수송을 모델링하는 데 사용하였다.
실시예 1: 고밀도 성장을 위한 흐름, 세포 및 글루코스 농도의 시뮬레이션
제공된 장치의 기하학적 구조, 반투과성 막의 특성, 및 유량에서 세포가 고밀도 세포 성장을 위한 적절한 영양소를 갖는지 여부를 시험하기 위해 COMSOL Multiphysics를 사용하여 유체 역학 및 물질 수송을 시뮬레이션하였다. 유동 층은 산소에 대해 투과성인 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 제조되었다. 산소 및 글루코스 물질 수송의 시뮬레이션에 대한 파라미터는 표 1에 나타나 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
세포가 마이크로홈 내부의 조직 밀도(108~109개 세포/ml)에서 성장할 수 있음을 확인하기 위해 산소 및 글루코스 농도를 시뮬레이션하였다. 도 13에 나타낸 2D 시뮬레이션의 기하학적 구조는 홈이 있는 기판 위에 직교 흐름이 있는 PDMS 다층 생물반응기의 횡단면이다. 시뮬레이션은 산소가 가스 투과성 홈이 있는 막의 아랫면 및 장치의 상단 상에 0.2 bar로 있다고 가정한다. 플레이트 분리는 100 μm이었다. 홈 깊이, 너비 및 피치는 각각 200 μm, 150 μm 및 200 μm이었다. 홈의 베이스의 세포 농도는 109개 세포/ml이었으며, 각 홈의 하단의 80%가 세포로 채워진 것으로 가정하였다. 입구 매체 유속은 왼쪽에서 오른쪽으로 0.05 mm/s이었다(스트림라인)은 흰색 선으로 표시됨)(도 13a).
홈을 가로지르는 층류를 나타내는 스트림라인에 의해 나타난 바와 같이 패킹된 세포 덩어리와 매체 사이의 경계에서 흐름 분리가 발생하였다. 매우 적은 양의 매체가 바이오매스에 침투했다. 정수압(hydrostatic pressure)은 예상대로 채널을 따라 선형으로 감소했다.
글루코스 및 산소의 농도가 도 13c 및 13d에 나타나 있다. 각 홈의 하위 80% 부피에서 바이오매스에 의한 글루코스 및 산소의 비 흡수(specific uptake)는 세포주 측정에 기초하였다(글루코스 비 흡수 = 0.73e-17[mol/s/세포], 산소 비 흡수 = 2.6e-17[mol/s/세포]). 글루코스 공급 농도는 10 mM이었다. 글루코스 농도가 4 mM 초과로 유지되는 한 세포는 생존할 수 있다. 글루코스는 유동 채널(0.15 mM / mm)을 가로지르는 하류에서 고갈되었다. 또한 각 홈 내에서 글루코스 증감(gradient)이 있었다. 글루코스 농도는 각 홈의 베이스에서 약 0.2 mM 고갈되었다.
산소(공기 중 20% 부피 분율)를 평행한 플레이트 홈 경계의 상부 및 하부 경계로부터 세포에 공급하였다(도 13d). 산소는 물 중 용해도(37C에서 0.25 mM)가 비교적 낮기 때문에 가장 희소한 대사산물이다. 시뮬레이션은 물보다 6.7배 더 높은 산소 용해도를 갖는 유동 층에 대해 PDMS와 같은 산소 투과성 물질을 사용함으로써 세포로의 산소 수송이 향상된다는 것을 보여주었다. 안정한 산소 농도 프로파일이 세 번째 및 네 번째 홈에 의해 하류에서 확인되었다. 바이오매스의 중간에서 가장 낮았다(0.11 mM). 골수 세포는 통상적으로 5% atm(약 5 mM)에서 성장하므로, 이 모델에서 낮은 산소가 세포 성장을 제한할 것 같지 않다.
이 시뮬레이션은 장치가 표준 플라스크 또는 백 배양보다 약 1000배 더 높은 108~109개 세포/ml에서 성장한 세포의 산소 및 글루코스 요구량을 공급할 수 있음을 입증한다.
도 17은 흐름이 왼쪽 입구로부터 들어가 홈을 가로질러 이동할 때(도 17a) 또는 흐름이 상부 입구로부터 들어가 홈을 가로질러 이동할 때(도 17b) 시뮬레이션된 3차원 흐름을 나타낸다. 흐름이 홈을 가로지르는 경우(도 17a), 입자는 홈의 종방향 차원에 직교하는 원형 경로를 가진 스트림라인을 따르기 때문에 와류에 갇힐 것이다. 흐름이 홈과 동일한 방향을 향하는 경우, 홈 내부의 입자는 하부 출구를 통해 나가는 홈의 벽과 평행한 스트림라인을 따를 것이다(도 17b). 도 17은 또한 동일한 입구 유체 속도에 대해, 상부 입구로부터 들어가는 흐름이 왼쪽 입구로부터 들어가는 흐름에 비해 더 높은 홈 내부의 유체 속도를 생성한다는 것을 나타낸다. 또한 홈의 베이스의 벽 전단 응력을 이 시뮬레이션 방법을 사용하여 추정하였다. 22 mm/min의 평균 상부 입구 유속에서 항체에 의해 세포가 선택적으로 포획되었음이 아래에 나타나 있다. 이 흐름은 홈의 베이스에서 0.0218 Pa 벽 전단 응력을 생성하였다.
실시예 2: 홈 내로의 세포 침착의 시뮬레이션
세포는 1.05~1.1의 비중을 가지며, 배양 배지에 침전물이 있다. 홈 내로의 세포의 침전은 4.8 μm/min의 입구 유체 속도 및 4.2 μm/s의 세포 침강 속도를 갖는 층류 혼합 모델을 사용하여 모델링하였다. 도 14는 침강 거리가 200 미크론에 불과하기 때문에 침강을 사용하여 단시간(약 200초)에 처음 5개의 홈에 대부분의 세포가 침착되었음을 보여준다. 세포가 홈 기판에 침착되면 배양 공정 동안 고정되며, 이는 장치 밖으로 세포가 흘러나오지 않으면서 매체를 교환할 수 있게 한다. 세포를 높은 생존율로 유지하는 배양 배지의 통상적인 관류 속도는 약 1 ml/백만 세포/일이다. 홈이 있는 기판 내로의 세포 침착에 대한 시뮬레이션 파라미터가 하기 표 2에 나타나 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
시뮬레이션은 또한 모델에 의해 사용된 기하학적 구조에서, 홈에 대한 입구에서의 흐름 분리 때문에 채널을 가로질러 향하는 흐름(직교 흐름)에 의해 홈으로부터 세포를 회수할 수 없다는 것을 보여주었다(도 17a).
실시예 3: 홈이 있는 기판에서 침착된 세포에 의한 바이러스 흡수의 마이크로유체 수송 시뮬레이션
본 발명에 의해 해결되는 해결하고자 하는 또 다른 문제는 세포의 표면으로 유전자 벡터를 수송하는 속도가 느리다는 것이다. 바이러스 벡터의 확산 속도는 약 2x10-8 cm2/sec이다. 확산 시간은 거리의 제곱에 비례하므로, 바이러스 입자가 1 mm 확산되는 데 140 hr이 걸리지만, 50 미크론 확산하는 데에는 30분밖에 걸리지 않는다. 세포로의 바이러스 수송을 증가시키는 현재의 방법은 임상 규모에서 자동화하기 어려운 원심분리(스피노큘레이션)을 사용한다. 그러나, 마이크로유체 시스템에서 확산 거리는 극적으로 감소한다. 홈의 하단에 있는 세포 단층으로 렌티바이러스를 수송하는 속도를 시뮬레이션하기 위해 COMSOL Multiphysics를 사용하였다(도 15). 홈이 있는 기판 상의 세포로의 바이러스 수송을 시뮬레이션하기 위한 시뮬레이션 파라미터는 표 3에 나타나 있다. 세포로의 바이러스 수송은 100 μm 깊이 홈과 비교하여 얕은 50 μm 깊이 홈을 사용하여 향상되었는데, 이는 홈 깊이가 100 μm인 경우(도 15의 왼쪽 그래프) 흐름 분리가 발생하여 단층으로의 바이러스 수송을 방해하였기 때문이다. 마이크로홈의 베이스에 있는 소용돌이는 확산 배리어를 도입하였는데, 그 흐름이 주요 유동 채널의 유량보다 대략 10배 낮기 때문이다. 이 시뮬레이션은 세포로의 바이러스 수송에 최적인 홈 깊이를 선택해야 할 필요성을 입증한다.
Figure pct00005
실시예 4: PDMS(실리콘 고무) 마이크로홈 생물반응기의 제작
표준 포토리소그래피를 사용하여 네거티브 몰드를 제작하였다. 유동 층 설계는 실리콘 웨이퍼 상에 스핀-코팅된 네거티브 포토레지스트(KMPR 1050, MMRC Pty Ltd) 상에 디자인 접촉이 인쇄된 쿼츠 포토그래픽 마스크(1 μm 피처, Bandwidth Foundry, Sydney University) 또는 고해상도(2400 dpi, 50 μm 피처) A4 포지티브 리소그래피 필름(Rose Graphics)에 인쇄되었다. UV 광으로 포토마스크를 정렬하고 노출시키기 위해 마스크 얼라이너를 사용하였다.
네거티브 실리콘 웨이퍼 몰드를 부드러운 엠보싱으로 복제하여 실리콘 마스터에 비해 내구성이 더 크고, 동일한 기하학적 구조를 가진 다중 장치를 만드는 데 재사용할 수 있는 2차 ZEONOR® 1060R 열가소성(Zeon Asia Pty Ltd, 싱가포르 소재) 네거티브 몰드를 만들었다. ZEONOR® 1060R 열가소성 몰드의 핫 엠보싱에 실리콘 마스터의 PDMS(SYLGARD™ 184, The Dow Chemical Company) 몰드를 사용하였다.
실험실 프로토타입에서, 3층 PDMS 장치를 정렬 포스트가 있는 3D 프린팅 도구로 정렬하고 클린룸에서 공기 플라스마로 함께 접합시켰다. 이를 이어서 구조적 지지, 취급 용이성 및 오토클레이브처리능력(autoclavability)을 위해 유리 판에 접합시켰다.
실시예 5: 설계
도 1에 상응하는 일반적인 설계는 세포 접종 및 수확을 위한 별도의 포트뿐만 아니라, 매체 공급을 위한 포트도 갖는다. 매체 유량이 세포 접종 및 수확에 필요한 유량보다 훨씬 낮기 때문에 매체 포트는 유량을 감소시키기 위해 유동 저항기에 연결되어 있다. 소규모 설계(4 x 106개의 세포)에 대한 차원은 표 4에 나타나 있다.
Figure pct00006
Figure pct00007
25배(108개의 세포)만큼 성장 부피를 증가시키는 대규모 설계에 대한 차원이 표 5에 나타나 있다. 이 장치는 이 수의 세포를 성장시키기 위해 50~100 ml 조직 배양 플라스크가 필요하다는 점을 고려하면 매우 컴팩트하다.
Figure pct00008
도 19의 구현예를 참조하면, 생물반응기는 직교 흐름 및 종방향 흐름 모두를 제공하여, 세포 로딩, 세포 증식 및 세포 추출의 상태를 달성하기 위한 다수의 밸브 및 매체 저장소를 제공한다. 세포 로딩을 위해(도 19a) 세포 입구(1381) 및 매체 관류 출구(1392)는 개방되지만, 세포 추출 입구(1330), 세포 추출 출구(1391) 및 매체 관류 입구(1382)는 폐쇄된다. 세포 증식을 위해(도 19b) 성장 배지는 개방되어 있는 매체 관류 입구(1382) 및 매체 관류 출구(1392), 및 폐쇄되어 있는 세포 입구(1381), 세포 추출 입구(1330) 및 세포 추출 출구(1391)를 통해 매체 저장소로 관류된다. 세포 추출을 위해(도 19c), 세포 추출 입구(1330) 및 세포 추출 출구(1391)는 개방되고 세포 입구(1381), 매체 관류 입구(1382) 및 매체 관류 출구(1392)는 폐쇄된다.
표 6은 도 18에 도시된 바와 같이, 4개의 생물반응기가 단일 A5 시트 상에 제공되는, 본 발명의 일 구현예에 따른 또 다른 생물반응기에 대한 파리미터를 제공한다.
Figure pct00009
표 7은 본 발명의 구현예에 따른 자동화 생물반응기 세포 배양 시스템에 의해 활용될 수 있는 일회용 대규모 유닛을 형성하는 24개의 생물반응기 시트의 스택(도 18)에 사용하기 위한 또 다른 다층 생물반응기에 대한 파라미터를 제공한다.
Figure pct00010
실시예 6: 유동 저항기의 보정
도 16에 나타난 바와 같이, 보정된 유압 저항기를 사용하여 헤더(200) 상의 유동 저항기를 사용하는 흐름 제어가, 제1 입구 포트(210)를 통한 세포 공급원으로부터의 세포 로딩, 제2 입구 포트(330)를 통한 세포 추출 유체 전달, 및 배양 배지의 공급원으로부터 제1 입구 포트(210) 내로 전달된 배양 배지에 대해 정확하고 재현성이 있음을 확인하였다. 압력 공급원 및 유동 센서는 각각 XenoWorks® Digital Microinjector(Sutter Instrument) 및 FM-ECO-Micro-1X, 분당 1~80 μL(CorSolutions, 미국 뉴욕 주 이타카 소재)이었다. 유량은 디지털 압력 공급원을 설정하여 제어하였다. 유동 경로는 3방향 수동 작동 밸브, 또는 튜브 클램프를 사용하여 폐쇄했다.
실시예 7: 마이크로홈 생물반응기를 사용한 세포 침착, 증식 및 회수의 시연
생물반응기 설계(108개 세포의 용량을 가짐)를 사용하여 비부착 B 세포주 Raji-H2B-GFP를 성장시켰다. 대략, 8x106개의 Raji H2B-GFP 세포가 생물반응기 내로 직교 흐름 침착에 의해 로딩되었고 17일 기간에 걸쳐 생물반응기를 채우도록 증식되었다. 도 21에서 시뮬레이션된 유사한 흐름 방식을 사용하여 첫 번째 5~10개의 홈(1일째, 도 21 참조) 내로 세포를 침착시켰다. 시간 경과 형광 현미경을 사용하여 적분 GFP 형광으로부터 성장 속도를 추적했다(도 20). 세포가 증식함에 따라, 세포는 하류 홈으로 넘친다. 이 성장 패턴은 도 20에 예시되어 있다. 유량은 세포 수가 증가함에 따라 증가했다. 매체 관류 유량은 대략 1 ml/백만개 세포/일로 설정되었으며, 이는 마이크로홈에 의한 세포 보유에 대해서는 충분히 낮지만 세포 성장 및 증식을 지원하기에는 충분히 높다.
세포는 17일째에 합류로 성장하여, 홈이 있는 기판 전체를 채우고, 세포가 장치의 출구를 통과했다. 17일째에 증식된 세포(67.5% 생존율로 출구에서 회수된 30.9 x 106개의 세포, 도 22)를 완전히 수확하는 것은 불가능했다. 최대 유량은 7.2 ml/일로 관류 속도가 세포 증식을 따라가지 못하였기 때문에(즉, 50~100 ml/일이어야 함, 도 22 참조) 생존율이 감소했다.
이 실험으로부터 홈이 있는 기판(홈 깊이 80 μm, 너비 150 μm, 간격 100 μm)의 합류 세포 밀도는 1천 7백만개 세포/cm2인 것으로 추정된다. 세포는 홈 내부에서 약 3억 5천만개 세포/ml의 밀도로 성장한다. 따라서 (60mmХ15mm) 장치는 최대 1,500만개의 세포를 성장시킬 것으로 예상된다.
본 발명자들은 세포 회수 및 생존율을 증가시키기 위한 양방향 홈 생물반응기를 개발했다. 세포는 직교 흐름 또는 종방향 흐름을 사용한 홈 내로의 침착에 의해 로딩될 수 있다. 본 발명자들은 또한 마이크로유체 배양 관류 유량이 장치에 의해 지원되는 세포의 수를 따라갈 수 있도록 배양 면적의 길이를 4배 감소시켰다.
Jurkat, Raji, Nalm6, TF1a 세포주를 양방향 흐름 장치에서 성장시켰다(도 23). 직교 흐름을 사용하여 200 μL(5백만개 세포/mL)로 대략 1x106개의 세포를 로딩하였다. 로딩 효율은 약 80%이었다. 종방향 흐름에 의해 14일째에 세포를 수확하였다(87% 생존율을 갖는 12.2 x 106개, 도 23 참조). 증식 프로토콜의 요약이 표 8에 나타나 있다.
Figure pct00011
실시예 8: 투과성 홈 생물반응기를 사용한 세포 선택, 유전자 수송 및 세포 증식의 마이크로유체 통합
홈 마이크로 생물반응기는 a) 홈에 결합된 단일클론 항체를 사용한 표적 세포의 선택 b) 포획된 표적 세포의 유전자 형질도입 및 (c) 평행하게 연결된 다수의 마이크로유체 장치를 포함하는 단일 카트리지 내에서 형질도입된 세포의 배양 증식을 수행하는 데 사용될 수 있다. 이러한 공정의 순서는 하기와 같이 밸브 및 압력 공급원의 공압 제어에 의해 자동화될 수 있다:
세포 접종은 생물반응기에 연결된 유압 라인을 통해 외부 세포 저장 저장소로부터의 세포 입력을 통해 달성될 수 있으며, 여기서 세포 수송은 폐세포 용액을 수용하기 위한 개방형 세포 폐기물 출구와 함께 압력 공급원을 통해 외부 세포 저장소에 연결된 공압 라인으로부터의 공압으로 달성된다.
표적 세포 농축은, 외부 세포 저장소로부터의 개방 세포 입력 및 유압 라인을 통해 생물반응기에 유체 연결된 세포 세척 저장소로부터의 세포 세척 입구의 개방과 함께, 유량 기록계에 연결된 유압 라인을 통한 세포 세척 저장소로부터의 세포 세척의 입력 및 폐세포 세척 출구 저장소의 개방을 통해 달성된다.
유전자 수송은 벡터 저장소에 연결된 공압 라인 및 압력 공급원을 통한 벡터 흐름이 있는 유압 라인을 통해 벡터 저장소로부터 생물반응기 내로의 벡터의 입력을 통해 달성되며; 또한, 벡터 흐름 유압 라인이 개방되어 생물반응기로부터 통과하는 과잉 벡터 흐름을 허용한다.
세포 배양 증식은 세포 수확을 위한 세포 출력 라인으로 느슨한 세포의 흐름을 모니터링하기 위해 바이오매스 센서에 연결된 배지 폐기물 라인 및 저장소를 통한 공기 및 이산화탄소의 입력 및 폐 성장 배지의 출력과 함께, 생물반응기의 상단 및 하단으로의 유압 공급 라인을 통해 생물반응기의 배양 세포에 대한 신선한 배양 배지를 공급하는 것을 통해 달성된다.
세포 수확은 흐름 판독기를 통한 외부 공급원으로부터 생물반응기로의 세포 세척의 입력 및 세포 출력 라인을 통한 수확된 세포의 출력으로 달성된다.
실시예 9: Jurkat 세포의 바이러스 형질도입
이 실험은 마커로서 녹색 형광 단백질(GFP)을 세포 내로 전달하기 위한 렌티바이러스 벡터를 사용하는 Jurkat 세포의 형질도입을 설명한다. Jurkat 세포는 GFP를 발현하는 hrSIN 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. Phoenix ECO 패키징 세포주로부터 생성된 벡터는 표 9에 나타나 있는 프로토콜에 따라 바이러스 형질도입에 사용되었다.
Figure pct00012
바이러스 배양 배지(VCM)를 시스템 내로 플러싱하여 다음 24시간에 걸쳐 지속적인 형질도입을 위해 감소된 유량으로 세포 배양 배지를 교체하였다. 이어서 형질도입된 세포를 관류 배양에 의해 후속 일에 걸쳐 증식시켰다. 후속 증식 세포를 수확하고 유세포분석기로 분석하였다. 도 24는 형질도입 후 2일째 및 후속 형질도입 3일 후 5일째에, 접종 시 양방향 흐름 생물반응기의 광시야 현미경 사진을 보여준다. 수확 시 94%의 Jurkat 세포가 GFP를 발현했다(도 25, 표 10). 형질도입 효율을 향상시키는 데 사용되는 제제인 레트로넥틴은, 예를 들어 홈을 따르는 흐름에 의해 형질도입 전에 장치 내에 도입될 수 있다.
도 26은 이 실험에 사용된 생물반응기를 나타낸다. 세포 로딩 입구 및 바이러스 함유 매체(VCM) 입구는 마이크로홈의 방향에 수직으로 세포 및 VCM의 흐름을 지시한다. 흐름은 VCM 출구에서 장치 밖으로 통과한다. 형질도입 효율을 향상시키는 데 사용되는 제제인 레트로넥틴은, 예를 들어 레트로넥틴 입구 및 출구 포트를 사용하여 마이크로홈의 방향과 평행한 흐름에 의해 형질도입 전에 장치 내에 도입될 수 있다. 그러나, 효율적인 형질도입을 위해 레트로넥틴이 필요하지 않았다. 또한 레트로넥틴 입구 및 출구 포트는 마이크로홈의 방향에 평행한 흐름에 의한 세포 수확에 사용되었다.
Figure pct00013
도 27은 마이크로유체 생물반응기 장치가 레트로넥틴, 세포 및 VCM을 로딩하기 위한 가압 밀봉 용기에 어떻게 연결되었는지를 나타낸다. XenoWorks® Digital Microinjector를 각 용기 내부의 압력 헤드를 조절하여 유량을 제어하는 데 사용하였다. 하기 방법 단계를 사용하여 바이러스 형질도입을 수행하였다:
1. 대략 1백만개 세포를 마이크로유체 장치 내로 로딩하였으며; 200 μL의 세포 현탁액(5x106개 Jurkat 세포/ml에서) 20분에 걸쳐 +125 hPa의 압력 헤드를 사용하여 피브로넥틴 없이 장치 내로 로딩하였다.
2. 이어서 1 ml의 해동된 VCM(GFP를 전달하는 렌티바이러스)을 1시간에 걸쳐 +500 hPa에서 마이크로유체 장치 내로 주입하였다.
3. 이어서 마이크로유체 장치 및 저장소를 밤새 조직 배양 인큐베이터로 옮겼다. +40 hPa의 압력 헤드를 사용하여 VCM 유량을 밤새 감소시켰다.
4. 형광 현미경을 사용하여 마이크로유체 장치를 다음 날 이미지화하여 세포 내부의 GFP의 발현을 정량화하였다.
이 실험은 바이러스를 농축하기 위해 원심분리 및 레트로넥틴을 사용하지 않고 폐쇄 시스템에서 Jurkat 세포의 렌티바이러스 형질도입을 입증한다.
실시예 10: 세포 분리
물리적으로 흡착된 단일클론 항체를 사용하여 표적 세포가 홈과 동일한 방향으로 향하는 흐름(종방향 흐름)으로 홈 베이스를 따라 굴러갈 때 표적 세포를 포획하였다. Pluronic F127을 사용하여 항원 음성 세포의 비특이적 흡착을 감소시켰다. 형광 세포주의 혼합물을 1:1 비율로 사용하여 세포 분리의 성능을 평가하였다.
Pluronic F127은 비특이적 단백질 결합을 감소시키는 계면활성제이며 특히 마이크로유체 단백질 분석에 효과적이다. 이는 소수성 PDMS에 강력하게 결합하는 -CH3 기로 변형된 폴리에틸렌 글리콜 거대분자이다(도 28). 본 발명자들은 항원 음성 세포의 비특이적 결합에 대한 Pluronic F127의 효과를 평가하였다. 세포 혼합물은 1:1 비율(50000개 세포/ml)의 Jurkat-H2B mCherry(CD3 양성, CD34 음성) 및 TF1a-H2B-GFP(CD3 음성, CD34 양성)이었다.
4℃에서 하룻밤 흡착에 의해 마이크로유체 생물반응기 내부의 항CD3 moAb(4D3, 50 μg/ml)를 물리적으로 흡착함으로써 CD3 세포를 선택하였다. 2시간 동안 홈을 따르는 1:1 비율의 CD3+:CD3- 세포 혼합물의 연속 흐름에 의해 세포의 포획을 관찰하였다. 세포 포획 후 세포 생존율을 결정하기 위해, 세포를 직교 흐름 관류 배양에 의해 계내(in situ)에서 배양하였다. 보다 상세한 프로토콜이 표 11에 기재되어 있다.
Figure pct00014
Figure pct00015
항CD3 moAb 흡착 전에 Pluronic 127로 코팅된 장치는 Jurkat-H2B-mCherry(CD3+)에도 그리고 TF1a H2B GFP(CD3-)에도 결합하지 않았다(도 29a). 항CD3 moAb 단독으로 코팅된 모듈을 사용한 CD3+ 세포(Jurkat-H2B-mCherry)의 더 강한 결합이 존재하였다(도 29b). 흡착된 항CD3 moAb의 선택성은 항체 결합 후 Pluronic과의 비특이적 세포 결합을 차단함으로써 향상되었다(도 29c). 본 발명자들은 또한 결합된 세포가 24시간에 걸쳐 분리되고 관류 배양에서 증식될 수 있음을 보여주었다.
본 발명자들은 양방향 흐름 마이크로유체 생물반응기를 사용하여 유전자 수송 및 배양 증식을 통합하는 소규모 실행가능성을 입증하였다.
실시예 11
본 발명자들은 홈의 베이스를 따라 흐름이 있을 때 세포가 그의 표면 항원에 결합하는 단일클론 Ab에 의해 포획됨을 보여주었다. 홈을 따르는 평균 유속은 21.5 mm/min이었다. Comsol 시뮬레이션은 홈의 베이스에서의 유체 전단 응력이 0.2 dynes/cm2임을 보여주었다.
본 발명자들은 효소 뉴라미니다제를 사용하여 포획된 세포의 방출 및 표적 세포의 후속 증식을 입증하였다.
소수성 폴리스티렌 조직 배양 접시를 CD3 또는 CD34 항원과 결합하는 단일클론 항체(moAb)로 물리적으로 흡착시킨 후, 계면활성제 Pluronic F127로 처리하였다. CD34+(TF1a-GFP) 및 CD3+(Jurkat Cherry)의 1:1 혼합물을 30분 동안 160 RMP으로 오비탈 셰이커 상의 접시에서 배양한 후 결합되지 않은 세포를 수확하였다. 도 30은 항CD3 MoAb 또는 항CD34 MoAb가 각각 결합된 CD3+(검은색 막대) 또는 CD34+ 세포(흰색 막대)가 풍부함을 나타낸다. 처리되지 않은 폴리스티렌 접시에 대한 세포의 비특이적 결합은 Pluronic F127에 의해 차단되었다.
결합된 CD3+ 세포 및 CD34+ 세포는 조직 배양(각각, 흰색 대각선이 있는 검은색 또는 검은색 대각선이 있는 흰색)에서 증식되었지만, 본 발명자들은 세포를 기판으로부터 방출함으로써 증식 및 수율이 증가함을 보여주었다.
효소 뉴라미니다제는 배양 5일 후 증식 수준이 증가된, 결합된 CD3+ 또는 CD34+ 세포를 절단하였다(도 30).
이들 실험에서, 세포는 오비탈 전단 없이 처리된 폴리스티렌 상에 인큐베이션되었다. 일반적으로 결합된 CD3+(검은색 막대) 및 CD34+ 세포(흰색 막대)의 풍부도는 오비탈 셰이킹 없이 더 낮았다(도 30 대 도 31 참조). 효소 뉴라미니다제는 항체-결합된 세포를 분리하여, 결합된 세포(대각선이 있는 막대)를 비교적 적게 남겼다. 효소에 의해 방출된 세포(흰색 점선 막대, CD34+ 세포; 검은색 점선 막대, CD3+ 세포)는 결합된 세포(검은색 수평선이 있는 흰색, CD34+ 세포, 흰색 수평선이 있는 검은색, CD3+ 세포)보다 더 잘 성장하였다. 따라서, 유체 전단 및 효소 방출은 순도 및 생존 세포의 수율을 증가시킨다.
본 발명의 구현예들은 인간 세포 및 유전자 요법에 사용하기 위해 유전자 변형 세포를 포함하는, 세포를 제조하기 위한 다층 마이크로유체 생물반응기를 제공한다. 본 발명의 구현예들은, 종종 플라스크 또는 백(bag) 기반이고 숙련된 직원 및 복잡한 다단계 공정을 필요로 하여 엄청나게 비싼 처리 비용을 초래하고 접근성 및 삶의 변화 및 질병 치료 요법의 도입을 제한하는 큰 공간을 차지하는(large-footprint) 기존의 기계에 대한 실행가능하고 경제적인 대안을 제공한다.
일부 구현예에서, 개별 생물반응기는 평행하게 연결되며, 예를 들어 적층된 스택으로, 통상적으로 다층 시트를 사용하여, 대규모 세포 제조를 위한 마이크로유체 프로세서를 형성한다. 통상적으로, 마이크로유체 프로세서 스택은 일회용(환자당 1회 사용)이다. 대규모 세포 제조는 일부 구현예에서 하나 이상의 마이크로유체 생물반응기 또는 생물반응기 스택을 생물반응기 세포 배양 시스템 내로 로딩함으로써 자동화될 수 있으며, 여기서 시스템은 플라스크 기반 세포 배양 시스템에 수반되는 오염 및 사람의 실수의 위험을 제거하는 폐쇄 시스템에서 가스 및 유체 흐름, 온도, 습도, 타이밍 및 샘플 취급과 같은 파라미터를 조절하도록 작동할 수 있는 컨트롤러를 갖는다.
실험실 응용에서는 필요한 수의 세포를 생성하기 위해 단일 또는 소수의 다층 마이크로유체 생물반응기가 필요할 수 있지만, 프로세서 제어 구성요소를 사용하는 대규모 생산은 대규모 세포 생산을 위한 프로토콜의 자동화를 가능하게 하며, 여기서 프로토콜은 환자마다 다양할 수 있고 임상적 요구에 따라 결정될 수 있다. 직교 흐름 및, 많은 구현예에서, 종방향 흐름을 제공하는 능력과 함께, 홈이 있는 유동 층의 기하학적 구조는 다양한 세포 배양 공정 동안 홈 내부의 세포 보유 및 배양된 세포의 효율적인 제거에 대한 제어를 제공한다.
기하학적 구조는 필요한 세포 배양 목표, 처리될 세포의 수, 접종원 내 세포의 빈도 및 제조될 세포의 수에 따라 변형되고 크기 조정될 수 있다. COMSOL Multiphysics와 같은 소프트웨어 패키지를 사용한 시뮬레이션은 이러한 기하학적 구조의 빠르고 안정적인 시뮬레이션을 가능하게 한다. 유리하게는, COMSOL Multiphysics와 같은 제품을 사용하여 시뮬레이션된 모델은 설계 및 경계 조건의 효과를 시뮬레이션하기 위해 변형될 수 있으며, 다양한 세포 배양 공정을 위한 홈의 기하학적 구조를 안내하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 구현예들에 따른 생물반응기는 세포 분리, 선택, 형질도입, 형질감염, 증식, 또는 이들의 조합과 같은 다양한 공정에 대해 "조정"될 수 있다. 원하는 공정에 대한 기하학적 구조가 결정되면, 개별 생물반응기는 통상적으로 스택으로 평행하게 연결될 수 있으며, 필요한 매체 공급원에 연결된 단일 유체 라인은, 각 입력을 공급하는 수직 유체 유동 채널을 제공하고 폐기물 출력 및 추출된 세포 각각에 대한 출구 경로를 제공하는 관통 보어를 통해 각각의 개별 입구에 공통 공급을 제공한다.
세포 생산의 규모 확장 및 규모 축소를 위한 종래의 접근방식은 각각 생물반응기 시스템의 부피와 수의 증가를 수반하였다. 이는 물리적(열 및 산소 수송과 같은 물질 수송 및 혼합 시간), 생화학적(매체 조성 및 유동학) 및 공정 단계(세포 단리, 유전자 수송 및 배양 증식을 포함함)가 임상 용량에 따라 달라질 것이기 때문에 비용이 많이 들고 복잡하다. 세포 산물 및 공정이 각 환자에 대해 특이적이기 때문에 더 복잡한 문제가 발생하며; 변형되는 것은 환자 또는 조직 일치 기증자의 세포이다. 기존 실험실 방법 및 공급망을 사용하여 수천 개의 맞춤형 세포 산물을 제조하는 실행계획은 이전에 극복할 수 없었던 과제를 제시한다. 본 발명의 구현예들은 다중 공정 단계가 수행될 수 있는 그러한 방식으로 고유한 마이크로유체 기하학적 구조를 반투과성 기판에 통합함으로써 이러한 요구를 해결한다. 이 고유한 배열은 또한 더 나은 세포 조작, 높은 세포 밀도를 제공하고 매체의 소비 및 세포 생산 시간 프레임을 크게 감소시킨다.
본 발명은 세포 패시징(피펫팅) 및 원심분리, 또는 막히는 경향이 있는 여과 장치와 같은 번거로운 수동 방법을 대체하는, 시약 및 매체 교환 단계의 자동화를 제공한다. 개시된 방법, 장치 및 시스템은 복잡한 '생산 라인' 공정(세포 선택/유전자 수송/증식)을 단일(그러나 확장가능한) 마이크로유체 생물반응기 장치와 시약 및 세포의 흐름을 지시하는 프로그램가능한 컨트롤러로 대체한다. 본 발명은 또한 세포 및 유전자 요법을 위한 세포 제조의 조직 일치(자가 또는 동종) '규모 확장'의 비용 문제를 해결한다.
대규모 세포 생산을 제공하는 구현예에서, 병렬 흐름 저항 네트워크는 각각의 마이크로유체 서브유닛으로의 흐름이 동일하고, 예를 들어 공급 채널의 기하학적 구조 또는 유동 채널의 기하학적 구조에 영향을 받지 않도록 보장한다. 유리하게는, 유량 및 매체 성분을 포함하는 동일한 작동 및 생산 파라미터가 소규모(단일 마이크로유체 생물반응기) 및 대규모(평행하게 연결된 다중 마이크로유체 생물반응기) 시스템에 배포된다. 본 방법은 소규모로 저렴하게 최적화되며, 성장시킬 세포의 수가 증가하는 경우 최적화 공정을 반복할 필요 없이 병렬 복제에 의해 규모확장된다.
유리하게는, 마이크로유체 저항성 병렬 네트워크의 사용은 다중 유닛 프로세서 또는 스택의 각 마이크로유체 생물반응기에 동일한 흐름을 보장하지만, 대규모 시스템의 개별 스택은 개별 환자 요구에 필요한 프로토콜에 따라 세포의 병렬 처리를 위해 컨트롤러의 제어 하에 개별적으로 구성될 수 있다. 시험 동안 예기치 않게 관찰된 것은, 직교 흐름을 사용하면, 세포가 성장 단계 동안(이뿐만 아니라 세포 침착 동안) 연속적인 하류 홈을 채우고, 반드시 그럴 필요는 없지만 세포를 출구에서 지속적으로 수확할 수 있다는 것이다. 이러한 이점은 배치 처리(백 또는 교반 생물반응기)를 사용하여 전통적으로 수행되는 기존의 대규모 생산에는 존재하지 않는다.
(청구범위를 포함하여) 본 명세서에 사용된 용어 "포함하다"("comprise", "comprises"), "포함된" 또는 "포함하는"은 언급된 특징, 정수, 단계 또는 구성요소의 존재를 구체화하는 것으로 해석되어야 하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계 또는 구성요소 또는 이들의 그룹의 존재를 배제하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 앞서 기재된 부분에 다양한 변형, 추가 및/또는 변경이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
향후의 특허출원은 본 출원에 기초하거나 우선권을 주장하는 다양한 국가에 제출될 수 있다. 하기 청구범위는 단지 예로서 제공되며, 그러한 향후의 출원에서 청구될 수 있는 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 발명 또는 발명들을 추가로 정의하거나 재정의하기 위해 추후 청구범위에 특징이 추가되거나 생략될 수 있다.

Claims (71)

  1. 헤더 층, 베이스 층, 및 상기 헤더 층과 상기 베이스 층 사이의 유체 투과성 유동 층을 포함하는 세포 배양용 다층 마이크로유체 생물반응기로서,
    (a) 상기 유동 층은 상부 표면 및 하부 표면을 포함하되, 상기 상부 표면은 세포의 보유를 위한 하나 이상의 홈(groove)을 포함하고;
    (b) 상기 베이스 층은 상기 유동 층을 가로지르는 가스 교환용 가스 유동 경로를 제공하고;
    (c) 상기 헤더 층은 상기 유동 층 상부 표면 위에 유동 채널을 규정하도록 구성되며, 상기 헤더 층은
    (i) 제1 입구 포트;
    (ii) 제1 출구 포트;
    (iii) 상기 제1 입구 포트와 상기 유동 채널 사이에 유체 연통을 제공하는 하나 이상의 제1 유체 입구; 및
    (iv) 상기 유동 채널과 상기 제1 출구 포트 사이에 유체 연통을 제공하는 하나 이상의 제1 유체 출구
    를 포함하며;
    상기 하나 이상의 유체 입구 및 상기 하나 이상의 유체 출구는 상기 하나 이상의 유체 입구로부터 상기 유동 채널로 들어가는 유체가 상기 하나 이상의 유체 출구를 향하는 제1 유동 방향으로 이동하도록 상기 헤더에 위치하며, 상기 제1 유동 방향은 그 안에 수용된 세포의 파괴를 최소화하기 위해 상기 적어도 하나의 홈을 가로지르는
    다층 마이크로유체 생물반응기.
  2. 제1항에 있어서, 상기 헤더 층은
    - 제2 출구 포트; 및
    - 상기 유동 채널과 상기 제2 출구 포트 사이에 유체 연통을 제공하는 하나 이상의 제2 유체 출구
    를 포함하며;
    상기 하나 이상의 제2 유체 출구는 상기 제2 출구 포트를 통해 상기 유동 채널을 나가는 유체가 상기 하나 이상의 제2 유체 출구를 향하는 제2 유동 방향으로 흐르도록 상기 헤더에 위치하며, 상기 제2 유동 방향은 상기 하나 이상의 홈을 따르는
    다층 마이크로유체 생물반응기.
  3. 제2항에 있어서, 상기 헤더 층은
    - 제2 입구 포트; 및
    - 상기 제2 입구 포트와 상기 유동 채널 사이에 유체 연통을 제공하는 하나 이상의 제2 유체 입구
    를 추가로 포함하며;
    상기 하나 이상의 제2 유체 입구는 상기 하나 이상의 제2 유체 입구로부터 상기 유동 채널로 들어가는 유체가 상기 제2 유동 방향으로 상기 하나 이상의 제2 출구를 향해 흐르도록 상기 하나 이상의 홈의 종방향 차원에 실질적으로 직교하는 상기 헤더의 차원을 따라 위치하는
    다층 마이크로유체 생물반응기.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제2 입구 포트는 하나 이상의 매체 공급원으로부터 유체를 수용하고, 상기 헤더는 상기 제2 입구 포트 내로 상기 유체 매체를 수용하기 위한 하나 이상의 제2 유체 채널을 포함하는 다층 마이크로유체 생물반응기.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제2 유체 채널은 상기 다층 마이크로유체 생물반응기를 통해 수직 채널을 형성하도록, 상기 헤더 층, 상기 유동 층 및 상기 베이스 층을 통해, 바람직하게는 동일선상으로, 연장되는 다층 마이크로유체 생물반응기.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 입구 포트는 하나 이상의 유체 공급원으로부터 유체를 수용하고, 상기 헤더는 상기 유체 매체를 상기 제1 입구 포트 내로 수용하기 위한 하나 이상의 제1 유체 채널을 포함하는 다층 마이크로유체 생물반응기.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1 유체 채널은 상기 다층 마이크로유체 생물반응기를 통해 수직 채널을 형성하도록, 상기 헤더 층, 상기 유동 층 및 상기 베이스 층을 통해, 바람직하게는 동일선상으로, 연장되는 다층 마이크로유체 생물반응기.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유동 방향과 상기 제2 유동 방향은 실질적으로 직교하는 다층 마이크로유체 생물반응기.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 채널을 제1 유동 채널 및 제2 유동 채널로 분리하는 선택적 투과성 막을 추가로 포함하되; 상기 선택적 투과성 막은 저분자량 대사산물의 교환을 제공하는 다층 마이크로유체 생물반응기.
  10. 제9항에 있어서, 제2 헤더를 추가로 포함하되, 상기 선택적 투과성 막은 상기 헤더와 상기 제2 헤더 사이에 있음으로써 이들 사이에 제2 유동 채널을 형성하며,
    상기 제2 헤더는
    (i) 상기 제2 유동 채널과 유체 연통하는 제2 입구 포트; 및 선택적으로
    (ii) 상기 제2 유동 채널과 유체 연통하는 제2 출구 포트
    를 포함하되; 상기 선택적 투과성 막은 상기 제2 입구 포트로 들어가는 저분자량 유체 대사산물의 교환을 제공하고, 선택적으로 상기 제2 출구 포트를 통해 저분자량 유체 대사산물의 제거를 제공하는
    다층 마이크로유체 생물반응기.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 홈은 상기 하나 이상의 홈에서 세포의 비특이적 결합을 제한하도록 기능화된 다층 마이크로유체 생물반응기.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤더는 상기 유동 층 상부 표면과 접하여 얹어지도록 구성된 복수의 구조적 포스트들을 포함하는 다층 마이크로유체 생물반응기.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베이스 층은
    (i) 상기 유동 층 하부 표면과 접하여 얹어지도록 구성된 복수의 구조적 포스트들; 및
    (ii) 벽 또는 복수의 벽 섹션들
    중 하나 또는 양자 모두를 포함하는 다층 마이크로유체 생물반응기.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 입구 포트는 신선한 세포 및 배양 배지 중 하나 또는 양자 모두를 수용하는 다층 마이크로유체 생물반응기.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 채널의 흐름을 조절하기 위해 하나 이상의 유동 저항기를 포함하는 다층 마이크로유체 생물반응기.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 다층 마이크로유체 생물반응기를 포함하는 스택으로 배열되도록 구성되며, 각각의 다층 마이크로유체 생물반응기는 하나 이상의 관통 포트를 포함하되, 상기 하나 이상의 관통 포트는 상기 헤더 층, 상기 베이스 층 및 상기 유동 층 각각을 통해 동일선상으로 연장되고 상기 적어도 하나의 추가적인 다층 마이크로유체 생물반응기의 상응하는 관통 포트와 유체 연통을 제공하는 다층 마이크로유체 생물반응기.
  17. 제16항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 다층 마이크로유체 생물반응기를 적층 배열로 위치시키기 위한 하나 이상의 정렬 특징부를 포함하는 다층 마이크로유체 생물반응기.
  18. 생물반응기 세포 배양 시스템으로서,
    (a) 적어도 하나의 스택으로 배열된 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 복수의 다층 마이크로유체 생물반응기;
    (b) 컨트롤러-여기서 상기 컨트롤러는 메모리에 저장된 세포 배양 프로토콜에 따라 하나 이상의 유체 펌프의 개별적인 작동을 제어하도록 구성되고, 상기 하나 이상의 유체 펌프는 상기 적어도 하나의 스택을 통해 동일선상으로 제공된 하나 이상의 관통 포트로 유체를 전달하며, 상기 전달된 유체는 상기 저장된 세포 배양 프로토콜에 따라 상기 적어도 하나의 스택 내에 있는 각각의 마이크로유체 생물반응기의 유동 챔버로 들어감-
    를 포함하는 생물반응기 세포 배양 시스템.
  19. 제18항에 있어서, 상기 콘트롤러는 상기 콘트롤러 메모리 및 유저 인터페이스와 통신가능하게 결합된 프로세서를 포함하되, 상기 메모리는 하나 이상의 세포 배양 프로토콜을 수행하기 위한 명령을 저장하고, 상기 프로세서에 의해 실행될 때 상기 명령은 상기 컨트롤러가 상기 생물반응기 세포 배양 시스템을 작동시켜 상기 하나 이상의 세포 배양 프로토콜을 수행하도록 하는 생물반응기 세포 배양 시스템.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    (a) 상기 적어도 하나의 스택 아래에 있는 실질적으로 고정된(rigid) 베이스 플레이트; 및
    (b) 상기 적어도 하나의 스택 위에 배열된 실질적으로 고정된 커버 플레이트
    중 하나 또는 양자 모두를 포함하며;
    상기 베이스 플레이트 및 상기 커버 플레이트 각각은 적어도 하나의 스택에 구조적 지지를 부여하는 생물반응기 세포 배양 시스템.
  21. 제20항에 있어서, 상기 실질적으로 고정된 커버 플레이트는 상기 하나 이상의 스택 내에 있는 관통 포트와 하나 이상의 유체 공급원 및/또는 폐기물 저장소 사이에 유체 연통을 제공하는 복수의 개구들을 포함하는 생물반응기 세포 배양 시스템.
  22. 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 유체 공급원과 유체 연통하는 하나 이상의 펌프를 포함하되, 상기 하나 이상의 펌프는 상기 하나 이상의 세포 배양 프로토콜에 따라 상기 커버 플레이트 개구들의 개별 개구에 유체를 전달하도록 상기 컨트롤러에 의해 작동되는 생물반응기 세포 배양 시스템.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다층 마이크로유체 생물반응기 중 하나들을 적층 배열로 정렬하기 위한 하나 이상의 가이드 특징부를 포함하는 생물반응기 세포 배양 시스템.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨트롤러는, 다층 마이크로유체 생물반응기의 스택을 통해 동일선상으로 연장되는 세포 추출 관통 포트를 통해 스택 내에 배열되고 상기 개별 다층 마이크로유체 생물반응기의 상기 제2 출구 포트와 유체 연통하는 상기 개별 다층 마이크로유체 생물반응기의 상기 하나 이상의 홈으로부터 세포를 추출하도록 작동가능한 생물반응기 세포 배양 시스템.
  25. 제24항에 있어서, 상기 하나 이상의 마이크로유체 생물반응기의 스택으로부터 추출된 세포의 오염되지 않은 수집을 위한 리셉터클을 수용하기 위한 커플링을 포함하는 생물반응기 세포 배양 시스템.
  26. 복수의 다층 마이크로유체 생물반응기들을 포함하는 다층 생물반응기 시트로서, 상기 다층 마이크로유체 생물반응기 각각은 하나 이상의 홈 및 상기 하나 이상의 홈을 가로지르는 유체의 흐름을 제공하는 하나 이상의 관통 포트를 포함하는 배양 챔버를 포함하되, 상기 하나 이상의 관통 포트는 상기 다층 생물반응기 시트의 층들을 통해 동일선상으로 제공되는 다층 생물반응기 시트.
  27. 제26항에 있어서, 각각의 다층 생물반응기 시트는 적어도 하나의 다른 다층 생물반응기 시트를 포함하는 시트 스택 내로 배열되도록 구성되며, 상기 시트 스택 내에 있는 각각의 다층 생물반응기 시트의 관통 포트는 동일선상으로 연장되어 각각의 다층 생물반응기 시트의 개별 다층 마이크로유체 생물반응기의 상기 배양 챔버와 유체 연통을 제공하는 다층 생물반응기 시트.
  28. 제27항에 따른 시트 스택 내에 배열된 하나 이상의 다층 생물반응기 시트와 사용하기 위한 생물반응기 세포 배양 시스템으로서, 상기 시스템은
    (a) 컨트롤러-여기서 상기 컨트롤러는 메모리에 저장된 세포 배양 프로토콜에 따라 하나 이상의 유체 펌프의 작동을 개별적으로 제어함-;
    (b) 상기 저장된 세포 배양 프로토콜에 따라, 상기 생물반응기 세포 배양 시스템의 적어도 하나의 유체 또는 폐기물 저장소와, 상기 적어도 하나의 유체 또는 폐기물 저장소로의 또는 이로부터의 흐름을 필요로 하는 상기 시트 스택 내의 다중 관통 포트 사이에 유체 커플링을 제공하는 시트 스택 헤더; 및
    (c) 상기 저장된 세포 배양 프로토콜에 따라 상기 다층 마이크로유체 생물반응기의 개별 배양 챔버로 상기 관통 포트를 통해 유체를 전달하는 하나 이상의 유체 펌프
    를 포함하는 생물반응기 세포 배양 시스템.
  29. 세포를 배양하는 방법으로서, 상기 방법은
    i) 실질적으로 평행한 홈들의 어레이를 포함하는 기판을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계;
    ii) 상기 홈들 중 하나 이상 내로 세포를 도입하는 단계;
    iii) 상기 홈들을 가로지르는 제1 유동 방향으로 상기 홈 어레이 위에 배양 배지의 흐름을 제공하는 단계;
    iv) 생존력, 성장 또는 분화를 지원하는 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 세포는 상기 제1 유동 방향의 상기 홈 어레이 위의 흐름에 의해 하나 이상의 홈 내로 도입되는 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 배양 배지의 흐름은 1일 1백만 세포 당 0.2 내지 5 mL에 상응하는 유량으로 제공되는 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 1~14일 동안 배양되는 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 추출 매체의 흐름을 제공함으로써 상기 배양된 세포를 수확하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 추출 매체는 상기 홈들을 따르는 제2 유동 방향의 흐름에 의해 제공되는 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 추출 매체의 흐름은 적어도 10 mm/min의 평균 유속 또는 적어도 0.1 dyne/cm2의 전단 응력에서 제공되는 방법.
  36. 세포를 형질감염/형질도입하는 방법으로서, 상기 방법은
    i) 실질적으로 평행한 홈들의 어레이를 갖는 기판을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계;
    ii) 상기 홈들 중 하나 이상 내로 세포를 도입하는 단계;
    iii) 상기 홈들을 가로지르는 제1 유동 방향으로 상기 홈 어레이 위에 적어도 하나의 외인성 분자의 흐름을 제공하는 단계;
    iv) 상기 외인성 분자로 세포를 형질감염/형질도입하는 조건 하에 상기 세포 및 상기 적어도 하나의 외인성 분자를 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 세포는 상기 제1 유동 방향의 상기 홈 어레이 위의 흐름에 의해 하나 이상의 홈 내로 도입되는 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 방법은 상기 홈들로부터 과잉의 상기 외인성 분자를 세척하기 위해 매체의 흐름을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 배양 배지의 흐름을 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 매체의 흐름은 상기 제1 유동 방향인 방법.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 외인성 분자를 제공하는 단계 이전에 상기 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 형질감염/형질도입된 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 추출 매체의 흐름을 제공함으로써 상기 형질감염/형질도입된 세포를 수확하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 추출 매체는 상기 홈들을 따르는 제2 유동 방향의 흐름에 의해 제공되는 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 추출 매체의 흐름은 적어도 10 mm/min의 유속 또는 적어도 0.1 dyne/cm2의 전단 응력에서 제공되는 방법.
  46. 제34항 또는 제44항에 있어서, 상기 제1 유동 방향 및 상기 제2 유동 방향은 실질적으로 직교하는 방법.
  47. 샘플로부터 세포를 선택하는 방법으로서, 상기 방법은
    i) 실질적으로 평행한 홈들-여기서 상기 홈들은 세포를 선택적으로 포획하는, 그 위에 고정된 포획 시약을 포함함-의 어레이를 포함하는 기판을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계; 및
    ii) 상기 고정된 포획 시약으로 세포를 선택적으로 포획하는 조건 하에서 하나 이상의 홈을 따르는 흐름에 의해 상기 하나 이상의 홈 내로 세포를 도입하는 단계
    를 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 방법은 상기 포획 시약을 상기 홈들에 고정시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 방법은
    i) 상기 홈들에 흐름에 의해 상기 세포 포획 시약을 제공하는 단계; 및
    ii) 상기 포획 시약이 상기 홈들의 표면에 결합할 수 있도록 충분한 시간 동안 상기 홈 어레이를 상기 세포 포획 시약과 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 포획 시약은 상기 홈들을 가로지르는 횡 방향의 상기 홈 어레이 위의 흐름에 의해 제공되는 방법.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 홈들의 표면 상의 반응성 기를 차단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 방법은
    i) 상기 홈들에 흐름에 의해 상기 차단 시약을 제공하는 단계;
    ii) 상기 반응 기를 차단하기 위해 충분한 시간 동안 상기 홈 어레이를 상기 차단 시약과 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 차단 시약은 상기 홈들을 가로지르는 흐름에 의해 제공되는 방법.
  54. 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 추출 매체의 흐름을 제공함으로써 결합되지 않은 세포를 수확하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  55. 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 결합되지 않은 세포를 상기 홈들로부터 세척하기 위해 매체의 흐름을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  56. 제47항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 배양 배지의 흐름을 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  57. 제47항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 결합된 세포를 상기 포획 시약으로부터 방출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 방법은 상기 방출된 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 추출 매체의 흐름을 제공함으로써 상기 세포를 수확하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 추출 매체는 상기 홈들을 따르는 흐름에 의해 제공되는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 추출 매체의 흐름은 적어도 10 mm/min의 유속 또는 적어도 0.1 dyne/cm2의 전단 응력에서 제공되는 방법.
  62. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포를 형질감염/형질도입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 외인성 분자는 상기 홈들을 가로지르는 횡 방향의 흐름에 의해 제공되는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 방법은 상기 형질감염/형질도입된 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  65. 제50항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 횡 방향은 상기 하나 이상의 홈의 종방향 차원에 실질적으로 직교하는 방법.
  66. 제29항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기판은 가스 투과성이고 상기 장치는 상기 기판을 가로지르는 가스 교환용 하나 이상의 가스 유동 경로를 포함하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 하나 이상의 가스 유동 경로는 상기 가스 투과성 기판 아래에 있는 방법.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 상기 하나 이상의 가스 유동 경로는 외부 가스 공급부에 연결되는 방법.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 하나 이상의 가스 경로를 가스로 충전하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  70. 제29항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 배양 배지로 상기 장치를 프라이밍하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  71. 제29항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 포획된 기포를 확산에 의해 제거하기 위해 상기 장치를 가압하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4277974A1 (en) * 2021-01-12 2023-11-22 Berkeley Lights, Inc. Systems, apparatuses, and methods for cellular therapeutics manufacture
EP4194542A1 (en) * 2021-12-07 2023-06-14 Fluigent Apparatus for feeding a liquid medium to a fluidic system
WO2024072513A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 Xellar, Inc. Pipette interface systems and methods for viscous fluid injection
CN115595268A (zh) * 2022-12-14 2023-01-13 四川大学（Cn） 一种体外模拟人体微循环涡流的细胞共培养流动腔装置
CN116926020A (zh) * 2023-09-19 2023-10-24 深圳源兴基因技术有限公司 一种疱疹病毒载体细胞高密度培养方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999015629A1 (en) * 1997-09-25 1999-04-01 Cytomatrix, Llc Methods and devices for the long-term culture of hematopoietic progenitor cells
US7241423B2 (en) * 2000-02-03 2007-07-10 Cellular Process Chemistry, Inc. Enhancing fluid flow in a stacked plate microreactor
US20110213288A1 (en) * 2007-04-23 2011-09-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Device And Method For Transfecting Cells For Therapeutic Uses
EP3778858A1 (en) * 2008-07-16 2021-02-17 Children's Medical Center Corporation Device with microchannels and method of use
US8481303B2 (en) * 2009-10-12 2013-07-09 Corning Incorporated Microfluidic device for cell culture
TWI421340B (zh) * 2010-03-16 2014-01-01 Nat Univ Tsing Hua 微流道晶片及其使用方法
US20160340631A1 (en) * 2011-10-20 2016-11-24 Research Foundation Of The City University Of New York Layered microfluidic array
CA2934662C (en) * 2013-12-20 2024-02-20 President And Fellows Of Harvard College Low shear microfluidic devices and methods of use and manufacturing thereof
JP2015186474A (ja) * 2014-03-13 2015-10-29 アークレイ株式会社 細胞培養方法、細胞培養部材、及び細胞培養装置
CN104560713B (zh) * 2015-01-31 2016-09-07 重庆大学 用于培养及检测肺癌细胞的微流控芯片制备方法
NL2014840B1 (en) * 2015-05-21 2017-01-31 Intecrypt B V Microfluidic device for in vitro 3D cell culture experimentation.
EP3411150A2 (en) * 2016-02-04 2018-12-12 Massachusetts Institute of Technology Modular organ microphysiological system with integrated pumping, leveling, and sensing
CN115044471A (zh) * 2016-08-27 2022-09-13 三维生物科技有限公司 生物反应器
WO2018119296A1 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. System and method of using a microfluidic electroporation device for cell treatment

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