JP2014233209A - 細胞分離方法および細胞分離装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 塊状細胞を含む細胞溶液から、同一の装置によって、細胞を容易に分離することが可能な細胞分離方法等を提供する。
【解決手段】 弁１９ａを開き、弁１９ｂ、１９ｃは閉じておく。所定量の細胞含有溶液を溶液保持部５に充填した後、溶液保持部５内の細胞含有溶液に圧力を付与すると、細胞含有溶液が細胞分離部７ａに送られる。細胞分離部７ａに送られた細胞含有溶液は、細胞分離部７ａ内に配置されたフィルター２３を通過して、細胞分離部７ｂへ送られる。例えば１００μｍ以上のサイズの細胞（塊状細胞）を分離回収した後の細胞含有溶液は、溶液貯留部９に貯留される。所定量の細胞含有溶液が溶液貯留部９に貯留すると、次に、弁１９ａを閉じ、弁１９ｂ、１９ｃを解放する。次に、解放部１１から圧力を加えることで、溶液貯留部９内の細胞含有溶液が細胞分離部１５へつながる流路２１へ送り出される。
【選択図】図１

Description

本発明は、サイズによって細胞（塊状細胞を含む）を分離可能な細胞分離方法および細胞分離装置に関するものである。

細胞を含む溶液から特定の細胞を分離する方法として、分注用ノズルと基板の間に正極性の高電圧をかけ、静電誘導によってノズル先端の液にプラスの電荷を付与し、静電吸引力によって液を基板側に飛ばす方法がある。例えばΦ１００μｍ〜Φ２００μｍのマイクロチャネル内に細胞を溶液と共に流し、超音波で液滴を作り、その中に蛍光によって色分けされた細胞を入れる。この時に液滴が帯電されるので、高電界を用いて液滴と共に細胞を左右に分離することができる。

この方法では、数万Ｃｅｌｌｓ／ｓの速度が可能である。このため、この装置は、価格は高価であるが、細胞の選別機として世界中に普及している。しかし、この装置では、分離時の細胞のダメージが大きいという問題がある。また、塊状細胞が存在すると、細胞ごとにバラバラになる。このため、分離回収した細胞を再生医療に用いることはできない。

これに対して、マイクロ管内に細胞を流し細胞表面の蛍光によって細胞を識別し、ウェルプレートを動かして分離する方法がある。この方法は、ウェルプレートに入れられた微細粒子にレーザ光や水銀ランプを照射して微細粒子から蛍光を発生させる。計測用チップと回収プレートは、計測部に対してＸ方向とＹ方向に移動して位置決めを行うことができ、回収部はＺ方向に移動する。吸引・吐出キャピラリによって、蛍光を発する微細粒子を含めた全数の微細粒子を選択的に吸引し、回収プレートの所定の位置に排出することで、細胞を選択的に回収することができる（特許文献１）。

一方、溶液の流れによって細胞を分離する方法がある。まず、複数の入口から、粒子を含む流体と粒子を含まない流体をそれぞれ導入する。それぞれの流路の合流部は、粒子を含む流体の流れの幅を分離対象とする粒子の径よりも狭くしておく。さらに、合流部の下流側に、幅広の流路を接続する。これにより、合流部に続く幅の広い流路において、層流のプロファイルが拡大することを利用して、流れと垂直な方向に粒子の分離を行うことができる（特許文献２）。

また、上述した層流を利用したものではなく、細胞を濃縮して、サイズごとに分離する方法がある。これは、所定の方向に延長される主流路と、主流路の途中において、幅などが異なる分岐流路を複数有する流路構造を用いる方法である。主流路の一端から粒子を含む流体を連続的に導入した際、分岐点において、主流路の下流への流量と分岐流路への流量の比を主流路と分岐流路のスケールによって調節することで、ある一定サイズ以上の大きさを持つ粒子は、分岐点において分岐流路へ導入されないことを利用して、粒子の分離を行うことができる（特許文献３）。

特開２００８−２４９６７９号公報 特開２００５−２０５３８７号公報 特開２００７−０２１４６５号公報

しかし、特許文献１の方法は、細胞のダメージは小さいものの、機械的にウェルプレートを動かすために１０Ｃｅｌｌｓ／ｓ程度の速度が限界である。したがって、多数の細胞を選別収集して、再生医療などに用いるためには、分離の効率が悪く、相当の時間を要するという問題がある。

これに対し、特許文献２、３の方法では、１０００Ｃｅｌｌｓ／ｓ程度の速度で、細胞を分離することが可能である。また、細胞含有溶液の流れを利用して、細胞のサイズによる分離を行うため、細胞をレーザ光などによって計測する必要がない。したがって、装置がコンパクトであり、複数種類の細胞の分離も容易である。

一方、被検者から採取した癌細胞や、ｉＰＳ細胞などの培養された細胞には、複数の細胞が塊状になったものがある。例えば、２０〜３０個の細胞が球状に集合した塊状細胞（スフェロイド）や、細胞が長手方向に成長した棒状の塊状細胞（ダクト）などがある。このような塊状細胞は、例えば１００μｍ以上の大きさのものが含まれる。

しかし、細胞分離法として、このような塊状細胞を分離することが考慮されているものは存在しなかった。例えば、このような塊状細胞を含む細胞含有溶液から、数百μｍの塊状細胞と、１０〜３０μｍ程度の単独の種々の細胞を、一つの装置（プレート）で、サイズごとに容易に分離することはできなかった。このため、まず、大きな塊状細胞を所定の装置で分離した後、別の装置で残りの細胞をサイズごとに分離する必要があった。

本発明は、このような問題に鑑みてなされたもので、塊状細胞を含む細胞溶液から、同一の装置によって、塊状細胞と、その他の種々の細胞を容易に分離することが可能な細胞分離方法等を提供することを目的とする。

前述した目的を達するために第１の発明は、細胞を複数のサイズに分離して回収する細胞分離方法であって、塊状細胞を含む細胞含有溶液を、溶液保持部から第１細胞分離部へ流し、前記第１細胞分離部で、少なくとも塊状細胞を分離し、前記第１細胞分離部を通過した前記細胞含有溶液を溶液貯留部に貯留した後、搬送液導入部から導入された搬送液とともに、前記溶液貯留部から第２細胞分離部に前記細胞含有溶液を送り、前記第２細胞分離部で、サイズによって細胞を分離して、分離された細胞を回収部でそれぞれ回収することを特徴とする細胞分離方法である。

前記溶液貯留部に接続される解放部と、前記第１細胞分離部と、前記溶液貯留部との間に設けられる第１弁と、前記解放部と前記溶液貯留部との間に設けられる第２弁と、前記第２細胞分離部と前記回収部の間に設けられる第３弁と、をさらに具備する細胞分離装置を用い、前記第１弁および前記第２弁を開き、前記第３弁を閉じた状態で、前記細胞含有溶液を前記溶液保持部から前記第１細胞分離部に送り、前記第１細胞分離部で、少なくとも塊状細胞を分離し、前記溶液貯留部に前記細胞含有溶液が貯留された後、前記第１弁および前記第２弁を閉じ、前記第３弁を開いた状態で、前記搬送液導入部から導入された搬送液とともに、前記溶液貯留部から前記第２細胞分離部に前記細胞含有溶液を送ってもよい。

前記第１細胞分離部または前記第２細胞分離部の少なくとも一方は、前記細胞含有溶液を、導入側流路よりも広い流路に層流で導入して、その際に細胞のサイズに応じて流路内の細胞の流れる位置が異なることを利用して細胞をサイズによって分離してもよい。

前記第１細胞分離部または前記第２細胞分離部の少なくとも一方は、前記細胞含有溶液を主流路に導入し、前記主流路に接続される複数の副流路から細胞を除く溶液を排出して、前記細胞含有溶液内の細胞濃度を高め、細胞濃度の高い前記細胞含有溶液を、前記主流路に略垂直に形成された分離流路に流し、サイズによって細胞を前記主流路から分離してもよい。

前記第１細胞分離部はフィルターであり、前記フィルターによって、１００μｍ以上の塊状細胞を回収することが望ましい。

前記溶液保持部には、第１圧送部が接続され、前記溶液貯留部には、第２圧送部が接続され、前記解放部には、第３圧送部が接続され、前記第１弁および前記第２弁を開き、前記第３弁を閉じた状態で、前記第１圧送部を稼働して、前記細胞含有溶液を前記溶液保持部から前記第１細胞分離部に送り、前記第１弁および前記第２弁を閉じ、前記第３弁を開いた状態で、前記第２圧送部および前記第３圧送部を稼働して、前記搬送液導入部から導入された搬送液とともに、前記細胞含有溶液を前記溶液貯留部から前記第２細胞分離部に送ってもよい。

第１の発明によれば、第１細胞分離部と第２細胞分離部を有するため、塊状細胞を第１細胞分離部で分離回収し、単体の細胞を、サイズに応じて第２細胞分離部で分離回収することができる。この際、中間に溶液貯留部を設け、第１位細胞分離部で分離を終えた細胞含有溶液を一旦貯留し、弁を切り替えた後、第２細胞分離部に細胞含有溶液を送ることができる。このように、溶液貯留部への溶液の貯留と弁の切り替えによって、塊状細胞から単体の細胞まで、きわめて大きなサイズ分布の各細胞を、サイズに応じて一つの装置で分離回収することができる。

また、細胞含有溶液を、導入側流路よりも広い流路に層流で導入して、その際に細胞のサイズに応じて流路内の細胞の流れる位置が異なることを利用することで、サイズによって細胞を容易に分離することができる。

また、細胞含有溶液を主流路に導入し、細胞のサイズよりも狭い複数の副流路から溶液を排出して、細胞含有溶液内の細胞濃度を高め、細胞濃度の高い細胞含有溶液を、分離流路に流すことで、サイズによって細胞を容易に分離することができる。上記のようにすることで、細胞濃度を高めて、細胞を濃縮することと、細胞を分離することを連続して行うことができる。

また、塊状細胞は、その大きさに応じたフィルターによって、分離回収することができる。フィルターを用いることで、従来の方法では分離の困難であった１００μｍ以上の大きさの細胞も分離回収することができる。

また、溶液保持部、溶液貯留部、解放部のそれぞれに圧送部を接続し、これらの稼働と弁を切り替えることで、細胞含有溶液を確実に各部に送ることができる。

第２の発明は、細胞含有溶液を保持する溶液保持部と、前記溶液保持部から前記細胞含有溶液が送られる第１細胞分離部と、前記第１細胞分離部を通過した前記細胞含有溶液を貯留する溶液貯留部と、前記溶液貯留部から前記細胞含有溶液が送られる第２細胞分離部と、前記第２細胞分離部で分離された前記細胞含有溶液を回収する回収部と、前記溶液貯留部に接続される解放部と、前記溶液貯留部と前記第２細胞分離部とをつなぐ流路に接続される搬送液導入部と、前記第１細胞分離部と、前記溶液貯留部との間に設けられる第１弁と、前記解放部と前記溶液貯留部との間に設けられる第２弁と、前記第２細胞分離部と前記回収部の間に設けられる第３弁と、を具備し、前記第１弁および前記第２弁を開き、前記第３弁を閉じた状態で、前記細胞含有溶液を前記溶液保持部から前記第１細胞分離部に送ることで、前記第１細胞分離部で、少なくとも塊状細胞が分離され、前記溶液貯留部に前記細胞含有溶液が貯留された後、前記第１弁および前記第２弁を閉じ、前記第３弁を開いた状態で、前記搬送液導入部から導入された搬送液とともに、前記細胞含有溶液を前記溶液貯留部から前記第２細胞分離部に送ることで、前記第２細胞分離部で、少なくともサイズによって細胞が分離され、分離された細胞が前記回収部でそれぞれ回収されることを特徴とする細胞分離装置である。

少なくとも、前記溶液保持部と、前記第１細胞分離部と、前記溶液貯留部と、前記第２細胞分離部と、前記回収部と、前記溶液保持部と前記第１細胞分離部とをつなぐ流路と、前記第１細胞分離部と前記溶液貯留部とをつなぐ流路と、前記溶液貯留部と前記第２細胞分離部とをつなぐ流路と、前記第２細胞分離部と前記回収部とをつなぐ流路には親水性処理が施されており、前記溶液貯留部と解放部とをつなぐ流路には、親水性処理が施されていないことが望ましい。

第２の発明によれば、特に従来困難であった１００μｍ以上の塊状細胞を含む細胞含有溶液から、同一装置によって、サイズに応じた細胞を分離回収することができる。

また、所望の部位に親水性処理を施すことで、細胞含有溶液を流すことが容易である。この際、解放部へ続く流路に親水性処理を施さないことで、解放部への細胞含有溶液の漏れを防止することができる。

本発明によれば、塊状細胞を含む細胞溶液から、同一の装置によって、細胞を容易に分離することが可能な細胞分離方法等を提供することができる。

細胞分離装置１を示す平面図。 細胞分離装置１を示す断面図で、図１のＡ−Ａ線断面図。 第１細胞分離部１０ａにより細胞を分離している状態の細胞分離装置１を示す図で、（ａ）は平面図、（ｂ）は部分断面図。 （ａ）、（ｂ）は第１細胞分離部１０ａにより細胞を分離している状態の細胞分離装置１を示す部分断面図。 第２細胞分離部１０ｂにより細胞を分離している状態の細胞分離装置１を示す図で、（ａ）は平面図、（ｂ）は部分断面図。 第２細胞分離部１０ｂの構造を示す図で、（ａ）は細胞分離部１５の部分拡大図、（ｂ）は細胞分離部１５ａの部分拡大図。 細胞分離装置１ａを示す平面図。

以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態について説明する。図１は細胞分離装置１を示す平面概略図であり、図２は、図１のＡ−Ａ線断面図である。細胞分離装置１は、主に溶液保持部５、溶液貯留部９、第１細胞分離部１０ａ、第２細胞分離部１０ｂ、解放部１１、搬送液導入部１３、回収部１７、弁１９ａ、１９ｂ、１９ｃ等が、基板３上に形成される。

溶液保持部５は、塊状細胞を含む細胞含有溶液が保持される部位である。溶液保持部５は、流路２１を介して細胞分離部７ａ、７ｂと接続される。細胞分離部７ａ、７ｂは、例えば塊状の大きな細胞を分離する部位である。図２に示すように、溶液保持部５と細胞分離部７ａは、流路２１によって下部で連通する。また、細胞分離部７ａの上部と細胞分離部７ｂの下部は、流路２１によって連通する。

細胞分離部７ａ、７ｂを合わせて第１細胞分離部１０ａとする。なお、図示した例では、第１細胞分離部１０ａが、細胞分離部７ａ、７ｂの二段階で構成される例について示すが、一段または三段階以上で構成してもよい。細胞分離部７ａ、７ｂの詳細は後述する。

細胞分離部７ｂは、流路２１を介して溶液貯留部９と接続される。例えば、細胞分離部７ｂの上部と溶液貯留部９の下部が、流路２１によって連通する。溶液貯留部９は、第１細胞分離部１０ａで細胞が分離された後の細胞含有溶液を一旦貯留する部位である。細胞分離部７ｂと溶液貯留部は、それぞれ上部同士、下部同士で連結されていても良い。

溶液貯留部９には、エア流路を介して解放部１１と接続される。例えば、溶液貯留部９の上部と解放部１１の上部または下部が連通する。解放部１１は、大気に解放された部位である。

溶液貯留部９には、流路２１を介して、細胞分離部１５が接続される。また、溶液貯留部９と細胞分離部１５とをつなぐ流路２１には、さらに搬送液導入部１３が接続される。搬送液導入部１３は、細胞分離部１５に対して、細胞含有溶液に搬送液を層流で合流させる部位である。すなわち、溶液貯留部９から流れる細胞含有溶液と、搬送液導入部１３から流れる搬送液が、流路２１で合流し、細胞分離部１５に導入する。

細胞分離部１５は、第２細胞分離部１０ｂとなる。細胞分離部１５では、細胞のサイズに応じて、細胞を分離する。分離された細胞は、流路２１を介して接続された回収部１７でそれぞれ回収される。なお、図示した例は、第２細胞分離部１０ｂにおいて、三水準で細胞を分離する例について示すが、二水準または、四水準以上で構成してもよい。第２細胞分離部１０ｂの詳細は後述する。

細胞分離部７ｂと溶液貯留部９とを接続する流路には、第１弁である弁１９ａが設けられる。また、溶液貯留部９と細胞分離部１５とを接続する流路２１と、搬送液導入部１３とを接続する流路には、第２弁である弁１９ｂが設けられる。また、細胞分離部１５と回収部１７とを接続するそれぞれの流路２１上には、第３弁である弁１９ｃが設けられる。弁１９ａ、１９ｂ、１９ｃの構造は特に限定されないが、例えばボールバルブやダイアフラム弁などの構造を適用することができる。但し、弁１９ａ、１９ｂ、１９ｃが解放した状態での弁内流路面積（形状）と、弁前後の流路面積（形状）とが変わらないことが望ましい。

なお、各流路のサイズは、そこを流れる細胞含有溶液に含まれる最大細胞径に応じて決定される。例えば、第１細胞分離部１０ａの流路２１は、流す細胞の最大径よりは大きくする必要があるので数百μｍ〜１ｍｍ程度である。また、第２細胞分離部１０ｂ以降では、１００μｍ以下であるが、径の小さな細胞を回収する流路の場合は、数十μｍ程度である。

次に、基板３の製造方法について説明する。基板３の素材は特に限定されないが、例えば樹脂やガラスを用いることができる。基板３上の各部および流路は、例えば、エッチングにより形成してもよく、または、印刷によって、流路等以外の部位を肉盛りして形成してもよい。また、複数の素材を積層してもよい。これらの加工は、印刷法としては、３Ｄプリンターを利用したり、削りだし法としては、光造形技術などを利用して行うことができる。

また、細胞含有溶液または搬送液が流れる部位には、親水性処理が施されることが望ましい。具体的には、溶液保持部５、第１細胞分離部１０ａ、溶液貯留部９、第２細胞分離部１０ｂ、回収部１７には親水性処理が施される。また、溶液保持部５と第１細胞分離部１０ａとをつなぐ流路２１、第１細胞分離部１０ａと溶液貯留部９とをつなぐ流路２１、溶液貯留部９と第２細胞分離部１０ｂとをつなぐ流路２１、第２細胞分離部１０ｂと回収部１７とをつなぐ流路２１には親水性処理が施される。

このような親水性処理としては、例えば、日本油脂株式会社製のＭＰＣ系ポリマーをコートすることができる。ＭＰＣ系ポリマーは、極性部位が代表的なリン脂質であるホスホリルコリン基であり、生体膜表面と同様のホスホリルコリン基が存在することから、単なる親水性でなく、優れた生体適合性を有する。したがって、ＭＰＣ系ポリマーで被覆することが望ましい。

なお、親水処理方法としては、この他に樹脂の表面改質を行う方法もある。この方法としては、ＵＶ照射、コロナ放電、プラズマ処理、プライマー処理などの表面改質方法が知られており、これらの方法を用いることもできる。

なお、解放部１１および解放部１１へ接続される流路には、親水性処理を施す必要がない。解放部１１には、細胞含有溶液または搬送液を流すことがないためである。

次に、細胞分離装置１を用いた細胞分離方法について説明する。図３（ａ）は、細胞分離装置１を示す平面図、図３（ｂ）は第１細胞分離部１０ａ近傍の部分断面図である。まず、あらかじめ調整された細胞含有溶液を、溶液保持部５に充填する。細胞含有溶液は、塊状細胞を含む。なお、溶液は、生理食塩水でもよく、細胞の培養液であってもよい。

この際、弁１９ａを開き、弁１９ｂ、１９ｃは閉じておく。なお、以下の図においては、閉じられている状態の弁を黒塗りで示し、開いている状態の弁を白抜きで示す。

所定量の細胞含有溶液を溶液保持部５に充填した後、溶液保持部５内の細胞含有溶液に圧力を付与すると（図３（ｂ）の矢印Ｆ）、細胞含有溶液が細胞分離部７ａに送られる（図３（ａ）の矢印Ｂ）。細胞分離部７ａに送られた細胞含有溶液は、細胞分離部７ａ内に配置されたフィルター２３を通過して（図３（ｂ）の矢印Ｇ）、細胞分離部７ｂへ送られる（図３（ａ）の矢印Ｃ）。なお、フィルター２３の向きは、図示した例には限られない。

例えば、図４（ａ）に示すように、フィルター２３を鉛直方向に向けて配置してもよい。この場合、図４（ｂ）に示すように、上部を密閉してもよい。

また、図３（ｂ）に示す例では、溶液保持部５と細胞分離部７ａは、下部で連通し、細胞分離部７ａの上部と細胞分離部７ｂの下部が、流路２１によって連通する。また、細胞分離部７ｂの上部と溶液貯留部９の下部が流路２１で接続され、溶液貯留部９と細胞分離部１５はそれぞれの下部で流路２１を介して接続される。また、溶液貯留部９と細胞分離部１５とをつなぐ流路２１には、さらに搬送液導入部１３がそれぞれの下部を結んで接続されるが、これらの各部における接続は、上述のように、それぞれの上部と下部、または下部同士を接続する組み合わせに限られず、この際に、空気の巻き込みを防止するように溶液を連続させて連通させることができれば、それぞれ上部同士を接続することも可能である。

例えば、図４（ｂ）に示すように、溶液保持部５と細胞分離部７ａの間と、細胞分離部７ａと細胞分離部７ｂとの間は、それぞれ、上部同士を連通する流路２１で接続されてもよい。図４（ｂ）のように、上部を密閉していると空気を巻き込むことがない。

細胞分離部７ａでは、例えば、３００μｍ以上のサイズの細胞（塊状細胞）がフィルター２３によって分離回収される。例えば、３００μｍ以上の径のスフェロイドや、長さが３００μｍ以上のダクトが分離回収される。

細胞分離部７ｂに送られた細胞含有溶液は、細胞分離部７ｂ内に配置されたフィルター２３を通過して（図３（ｂ）の矢印Ｈ）、溶液貯留部９へ送られる（図３（ａ）の矢印Ｄ）。細胞分離部７ｂでは、例えば、１００μｍ以上（１００〜３００μｍ）のサイズの細胞（塊状細胞）がフィルター２３によって分離回収される。

このようにして、例えば１００μｍ以上のサイズの細胞（塊状細胞）を分離回収した後の細胞含有溶液は、溶液貯留部９に貯留される（図３（ｂ）の矢印Ｉ）。なお、弁１９ｂ、１９ｃが閉じられているため、細胞含有溶液が搬送液導入部１３や細胞分離部１５へ流れることはない。

また、溶液保持部５から細胞含有溶液を送り始めてから、溶液貯留部９に細胞含有溶液が貯留されるまでは、各部に充填されていた気体は、解放部１１から外部に開放される（図３（ａ）の矢印Ｅ）。したがって、背圧の影響を受けることなく、溶液保持部５から細胞含有溶液を送ることができる。また、溶液貯留部９内の細胞含有溶液へ空気が巻き込まれることを防止することができる。

また、前述したように、細胞含有溶液が接する部位には、親水性処理が施されているため、細胞含有溶液が流れやすい。また、解放部１１へ接続される流路には、親水性処理が施されていないため、気体とともに溶液の一部が解放部１１へ流れ出すことを抑制することができる。

所定量の細胞含有溶液が溶液貯留部９に貯留すると、次に、図５に示すように、弁１９ａを閉じ、弁１９ｂ、１９ｃを解放する。次に、解放部１１から圧力を加えることで（図５（ａ）の矢印Ｊ）、溶液貯留部９内の細胞含有溶液が細胞分離部１５へつながる流路２１へ送り出される（図５（ａ）の矢印Ｌ）。この際、同時に、搬送液導入部１３からも、あらかじめ内部に充填された搬送液を細胞分離部１５へつながる流路２１へ送り出す（図５（ａ）の矢印Ｋ）。したがって、細胞含有溶液と搬送液は合流して細胞分離部１５へ送られる（図６（ａ）の矢印Ｍ）。

図６（ａ）は、細胞分離部１５の拡大図である。細胞含有溶液が流れる細胞含有溶液導入流路２１ｂと、搬送液が流れる搬送液導入流路２１ａが合流部２１ｃで合流する。

細胞含有溶液には、例えば、サイズの異なる細胞２５ａ、２５ｂが含まれる。まず、細胞含有溶液および搬送液を、合流部２１ｃに連続的に供給する。なお、合流部２１ｃの幅は、細胞２５ａ、２５ｂが流れることが可能な幅であることは言うまでもない。この時、合流部２１ｃでは、それぞれの流体が安定な層流を保ちながら流れる。すなわち、細胞含有溶液および搬送液は、互いに混ざり合わずに境界を維持して流れる。細胞含有溶液および搬送液の流量を調節することで、合流部２１ｃにおける細胞含有溶液の幅を、分離対象とする最小の細胞のサイズよりも小さくなるようにすることができる。すなわち、合流部２１ｃの幅内において、細胞含有溶液が流れる幅を、細胞２５ａ、２５ｂの大きさよりも小さくなるようにすることができる。これにより、分離対象とする全ての細胞は、細胞含有溶液の流れに引きずられ、合流部２１ｃにおける片方の壁面（細胞含有溶液が流れる側）に沿って流れるようになる。

分離部２１ｄは、合流部２１ｃに対して流路幅が広くなる。このため、合流部２１ｃと分離部２１ｄの境界において、流線は点線に示されているように広がる。合流部２１ｃにおける流れと垂直な方向における細胞の位置は、細胞の大きさによってそれぞれ異なるため、合流部２１ｃと分離部２１ｄの境界において、大きい細胞２５ｂの運動ベクトルと小さい細胞２５ａの運動ベクトルの方向に差が生じる。このため、分離部２１ｄおいて、細胞の大きさごとに分離される。このような分離方法は、前述した特許文献２に記載されている。

このようにして、細胞２５ａが流れる位置（図６（ａ）の矢印Ｓ）と、細胞２５ｂが流れる位置（図６（ａ）の矢印Ｒ）を分離して回収することで、それぞれのサイズの細胞を分離回収することができる。

なお、図６（ａ）では、簡略化のため、大小の２水準の細胞２５ａ、２５ｂが分離された状態を示したが、分離部２１ｄの流路に垂直な方向の細胞の流れる位置が細胞のサイズによって異なることを利用すれば、３水準以上の細胞サイズに分離することも可能である。なお、図１〜図５において、回収部１７は３水準に細胞を分離した例を示す。例えば、３０μｍ〜１００μｍの細胞と、２０μｍ〜３０μｍの細胞と、２０μｍ未満の細胞とを分離することができる。

なお、細胞分離装置１の各流路において、レーザ光等によって細胞の個数を計数することで、分離されたそれぞれの細胞のサイズと個数の分布を知ることもできる。また、各弁１９ａ、１９ｂ、１９ｃは、各流路上に設けたが、それぞれ搬送液導入部１３、回収部１７の上部に設けて、大気解放できるようにしてもよい。

また、上述した例では、溶液保持部５および解放部１１等から、各溶液を圧送する場合について説明したが、本発明はこれに限られない。例えば、溶液保持部５から細胞含有溶液を送り出す際に、解放部１１から負圧により吸引してもよい。同様に、溶液貯留部９から細胞含有溶液を送り出す際に、各回収部１７から負圧により吸引してもよい。

また、サイズによって細胞を複数の水準に分離する方法としては、細胞分離部１５に示した構造でなくてもよい。例えば、図６（ｂ）に示すように、細胞分離部１５ａのような構造としてもよい。

細胞分離部１５ａは、中央に主流路２１ｅが設けられ、主流路２１ｅに略垂直に、複数の副流路２１ｆが接続される。主流路２１ｅに細胞含有溶液を連続的に流すと（図６（ｂ）の矢印Ｔ方向）、細胞含有溶液は、副流路２１ｆとの分岐点において副流路２１ｆへ流れる（図６（ｂ）の矢印Ｕ方向）。この際、主流路２１ｅの下流への細胞含有溶液の流量と副流路２１ｆへの流量の比を、主流路２１ｅと副流路２１ｆの寸法を適当に調整することで、所定以上の大きさの細胞は副流路２１ｆへは流れずに、主流路２１ｅを直進するようにすることができる。
すなわち、このようにすることで、副流路２１ｆには溶液のみが流れるため、主流路２１ｅの下流に行くにつれて細胞含有溶液中の細胞の濃度を高めることが可能となる。これにより、主流路を流れる細胞含有溶液中の細胞の濃縮が可能になる。

また、主流路２１ｅの下流側には、複数の分離流路２１ｇ、２１ｈが主流路２１ｅに対して略垂直に接続される。この分離流路２１ｇ、２１ｈの幅や深さなどを適当に設計することで、それぞれの分離流路２１ｇ、２１ｈへ流れる流量が設計される。逆に、主流路２１ｅの下流への流量と分離流路２１ｇへの流量の比を、主流路２１ｅと分離流路２１ｇの寸法を適当に調整することで、分離流路２１ｇへは所定以下の大きさの細胞は流れるが、所定値を超える大きさの細胞を主流路２１ｅを直進するようにすることができる。例えば、分離流路２１ｇには、細胞２５ａよりも小さな細胞のみが流れ、それより大きな細胞が直進するように設計することで、分離流路２１ｇから細胞２５ａを回収することができる（図６（ｂ）の矢印Ｖ方向）。同様にして、細胞２５ｂを分離流路２１ｈから回収することができる（図６（ｂ）の矢印Ｗ方向）。このような細胞の濃縮分離方法は、前述した特許文献３に記載されている。

なお、図６（ｂ）では、簡略化のため、大小の２水準の細胞２５ａ、２５ｂが分離された状態を示したが、分離流路を適切に設計すれば、３水準以上の細胞サイズに分離することも可能である。

このように、本発明では、第２細胞分離部１０ｂでの細胞の分離方法は、特に限定されず、公知のいずれの方法も適用することができる。また、前述した例では、第１細胞分離部１０ａでは、フィルター２３を用いた細胞の分離方法を示したが、図６（ａ）、図６（ｂ）の構成を、第１細胞分離部１０ａに対して適用することもできる。この場合、例えば、塊状細胞のみを第１細胞分離部１０ａで分離し、第２細胞分離部１０ｂでは、単体の細胞のサイズによって分離するように、各部の条件を設定すればよい。

以上、本実施の形態の細胞分離装置１によれば、サイズによって、細胞を分離回収することができる。特に、第１細胞分離部１０ａでは、従来考慮されていなかった塊状細胞を分離し、その後、第２細胞分離部１０ｂでは、細胞の単体のサイズによって分離することができる。このため、このため、例えば数μｍ〜数百μｍのサイズ分布を有する細胞含有溶液から、一つの装置で所望のサイズの細胞を分離回収することができる。

また、第１細胞分離部１０ａ、第２細胞分離部１０ｂそれぞれの分離操作は、弁１９ａ、１９ｂ、１９ｃの操作のみで行われるため、迅速かつ容易に細胞の分離作業を行うことができる。また、これらの分離作業が同一の基板３上で行われるため、各細胞分離部での分離作業間で、溶液の移送や処理を行う必要もない。

また、細胞の分離には、ウェルプレートを機械的に移動させる必要がなく、細胞の分離を高速で行うことができる。例えば、３ｍｌ程度の細胞含有溶液（２００万個〜４００万個の細胞または塊状細胞が存在する）を溶液保持部５に導入すると、３０〜４０分程度で分離を終えることができる。また、細胞の分離の際に、高電圧が付与されることもないため、細胞が損傷を受けたり、塊状細胞が分解されることもない。

また、細胞含有溶液や搬送液が接する部位には、親水性処理が施されるため、各溶液を容易に各部に流すことができる。また、解放部１１への接続部にのみ、親水性処理を行わないことで、溶液の一部が解放部１１へ漏れだすことを抑制することができる。

次に、第２の実施の形態について説明する。図７は、第２の実施の形態にかかる細胞分離装置１ａを示す概略平面図である。なお、以下の説明において、細胞分離装置１と同一の機能を奏する構成については、図１等と同様の符号を付し、重複した説明を省略する。

細胞分離装置１ａは、細胞分離装置１とほぼ同様の構成であるが、ポンプ２７ａ、２７ｂ、２７ｃが設けられる点で異なる。なお、図７では、ポンプ２７ａ、２７ｂ、２７ｃを基板３上に示すが、基板３とは別に配置されても良いことは言うまでもない。

溶液保持部５には、第１圧送部であるポンプ２７ａが接続される。また、溶液貯留部９に接続する解放部１１には、解放部１１の代わりに第２圧送部であるポンプ２７ｂが流路２１を介して溶液貯留部９に接続される。また、搬送液導入部１３には、第３圧送部であるポンプ２７ｃが接続される。なお、細胞分離装置１ａでは、ポンプ２７と溶液貯留部９を結ぶ流路の途中に分岐を設けて、弁１９ｄを設ける。

まず、あらかじめ調整された、塊状細胞を含む細胞含有溶液を溶液保持部５に充填する。この際、弁１９ａ、１９ｄを開き、弁１９ｂ、１９ｃは閉じておく。この状態で、ポンプ２７ａを稼働することで、溶液保持部５内の細胞含有溶液が、第１細胞分離部１０ａに圧送される。このようにして、第１細胞分離部１０ａで、例えば１００μｍ以上のサイズの細胞（塊状細胞）を分離回収した後の細胞含有溶液は、溶液貯留部９に貯留される。

なお、弁１９ｂ、１９ｃが閉じられているため、細胞含有溶液が搬送液導入部１３や細胞分離部１５へ流れることはない。また、弁１９ｄが解放しているため、各部に充填されていた気体は、解放部１１（弁１９ｄ）から外部に開放される。したがって、背圧の影響を受けることなく、溶液保持部５から細胞含有溶液を送ることができる。また、溶液貯留部９内の細胞含有溶液へ空気が巻き込まれることを防止することができる。

所定量の細胞含有溶液が溶液貯留部９に貯留すると、次に、弁１９ａ、１９ｄを閉じ、弁１９ｂ、１９ｃを解放する。次に、ポンプ２７ｂを稼働することで、溶液貯留部９内の細胞含有溶液が細胞分離部１５へつながる流路２１へ送り出される。同時に、ポンプ２７ｃを稼働することで、搬送液導入部１３からも、あらかじめ内部に充填された搬送液が細胞分離部１５へつながる流路２１へ送り出される。このようにして、細胞含有溶液と搬送液を合流して細胞分離部１５へ圧送することができる。

第２細胞分離部１０ｂ以後の細胞の回収方法は、前述した方法と同様である。

第２の実施形態にかかる細胞分離装置１ａによれば、細胞分離装置１と同様の効果を得ることができる。また、各部にポンプ２７ａ、２７ｂ、２７ｃを接続して、これらを適宜稼働させることで、溶液を確実に圧送することができる。

以上、添付図を参照しながら、本発明の実施の形態を説明したが、本発明の技術的範囲は、前述した実施の形態に左右されない。当業者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。

１、１ａ………細胞分離装置
３………基板
５………溶液保持部
７ａ、７ｂ………細胞分離部
９………溶液貯留部
１０ａ………第１細胞分離部
１０ｂ………第２細胞分離部
１１………解放部
１３………搬送液導入部
１５、１５ａ………細胞分離部
１７………回収部
１９ａ、１９ｂ、１９ｃ………弁
２１………流路
２１ａ………搬送液導入流路
２１ｂ………細胞含有溶液導入流路
２１ｃ………合流部
２１ｄ………分離部
２１ｅ………主流路
２１ｆ………副流路
２１ｇ………分離流路
２１ｈ………分離流路
２３………フィルター
２５ａ、２５ｂ……細胞
２７ａ、２７ｂ、２７ｃ………ポンプ

Claims (8)

1. 細胞を複数のサイズに分離して回収する細胞分離方法であって、
   塊状細胞を含む細胞含有溶液を、溶液保持部から第１細胞分離部へ流し、前記第１細胞分離部で、少なくとも塊状細胞を分離し、
   前記第１細胞分離部を通過した前記細胞含有溶液を溶液貯留部に貯留した後、搬送液導入部から導入された搬送液とともに、前記溶液貯留部から第２細胞分離部に前記細胞含有溶液を送り、前記第２細胞分離部で、サイズによって細胞を分離して、分離された細胞を回収部でそれぞれ回収することを特徴とする細胞分離方法。
2. 前記溶液貯留部に接続される解放部と、
   前記第１細胞分離部と、前記溶液貯留部との間に設けられる第１弁と、
   前記解放部と前記溶液貯留部との間に設けられる第２弁と、
   前記第２細胞分離部と前記回収部の間に設けられる第３弁と、
   をさらに具備する細胞分離装置を用い、
   前記第１弁および前記第２弁を開き、前記第３弁を閉じた状態で、前記細胞含有溶液を前記溶液保持部から前記第１細胞分離部に送り、
   前記溶液貯留部に前記細胞含有溶液が貯留された後、前記第１弁および前記第２弁を閉じ、前記第３弁を開いた状態で、前記搬送液導入部から導入された搬送液とともに、前記溶液貯留部から前記第２細胞分離部に前記細胞含有溶液を送ることを特徴とする請求項１記載の細胞分離方法。
3. 前記第１細胞分離部または前記第２細胞分離部の少なくとも一方は、前記細胞含有溶液を、導入側流路よりも広い流路に層流で導入して、その際に細胞のサイズに応じて流路内の細胞の流れる位置が異なることを利用して細胞をサイズによって分離することを特徴とする請求項１または請求項２記載の細胞分離方法。
4. 前記第１細胞分離部または前記第２細胞分離部の少なくとも一方は、前記細胞含有溶液を主流路に導入し、前記主流路に接続される複数の副流路から細胞を除く溶液を排出して、前記細胞含有溶液内の細胞濃度を高め、
   細胞濃度の高い前記細胞含有溶液を、前記主流路に略垂直に形成された分離流路に流し、サイズによって細胞を前記主流路から分離することを特徴とする請求項１または請求項２記載の細胞分離方法。
5. 前記第１細胞分離部はフィルターであり、前記フィルターによって、１００μｍ以上の塊状細胞を回収することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の細胞分離方法。
6. 前記溶液保持部には、第１圧送部が接続され、
   前記溶液貯留部には、第２圧送部が接続され、
   前記解放部には、第３圧送部が接続され、
   前記第１弁および前記第２弁を開き、前記第３弁を閉じた状態で、前記第１圧送部を稼働して、前記細胞含有溶液を前記溶液保持部から前記第１細胞分離部に送り、
   前記第１弁および前記第２弁を閉じ、前記第３弁を開いた状態で、前記第２圧送部および前記第３圧送部を稼働して、前記搬送液導入部から導入された搬送液とともに、前記細胞含有溶液を前記溶液貯留部から前記第２細胞分離部に送ることを特徴とする請求項２記載の細胞分離方法。
7. 細胞含有溶液を保持する溶液保持部と、
   前記溶液保持部から前記細胞含有溶液が送られる第１細胞分離部と、
   前記第１細胞分離部を通過した前記細胞含有溶液を貯留する溶液貯留部と、
   前記溶液貯留部から前記細胞含有溶液が送られる第２細胞分離部と、
   前記第２細胞分離部で分離された前記細胞含有溶液を回収する回収部と、
   前記溶液貯留部に接続される解放部と、
   前記溶液貯留部と前記第２細胞分離部とをつなぐ流路に接続される搬送液導入部と、
   前記第１細胞分離部と、前記溶液貯留部との間に設けられる第１弁と、
   前記解放部と前記溶液貯留部との間に設けられる第２弁と、
   前記第２細胞分離部と前記回収部の間に設けられる第３弁と、
   を具備し、
   前記第１弁および前記第２弁を開き、前記第３弁を閉じた状態で、前記細胞含有溶液を前記溶液保持部から前記第１細胞分離部に送ることで、前記第１細胞分離部で、少なくとも塊状細胞が分離され、
   前記溶液貯留部に前記細胞含有溶液が貯留された後、前記第１弁および前記第２弁を閉じ、前記第３弁を開いた状態で、前記搬送液導入部から導入された搬送液とともに、前記細胞含有溶液を前記溶液貯留部から前記第２細胞分離部に送ることで、前記第２細胞分離部で、少なくともサイズによって細胞が分離され、分離された細胞が前記回収部でそれぞれ回収されることを特徴とする細胞分離装置。
8. 少なくとも、
   前記溶液保持部と、
   前記第１細胞分離部と、
   前記溶液貯留部と、
   前記第２細胞分離部と、
   前記回収部と、
   前記溶液保持部と前記第１細胞分離部とをつなぐ流路と、
   前記第１細胞分離部と前記溶液貯留部とをつなぐ流路と、
   前記溶液貯留部と前記第２細胞分離部とをつなぐ流路と、
   前記第２細胞分離部と前記回収部とをつなぐ流路には親水性処理が施されており、
   前記溶液貯留部と前記解放部とをつなぐ流路には、親水性処理が施されていないことを特徴とする請求項７記載の細胞分離装置。

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