WO2017183570A1 - 細胞培養用容器、及びその使用方法 - Google Patents

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郷史 田中
貴彦 戸谷
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東洋製罐グループホールディングス株式会社
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture vessel used for cell culture in order to easily and efficiently perform various operations performed in cell culture, and a method for using the same.
  • the present applicant has repeatedly studied a cell culture system capable of performing cell culture efficiently while constructing a closed system environment to reduce the risk of contamination.
  • Patent Document 1 a culture container for culturing cells, a medium storage container for storing a medium and the like, a cell injection container for injecting cells, and a cell suspension after culture
  • a cell culture kit is proposed in which a cell collection container to be collected is connected by a conduit to construct a closed system environment. According to such a cell culture kit, it is possible to carry out from cell injection to medium addition, sampling, and collection while maintaining a closed system in the kit.
  • Patent Document 1 in recovering cultured cells, the culture vessel is allowed to stand to settle the cells in the cell suspension, and then the supernatant of the cell suspension is discharged, An example is shown in which the concentrated cell suspension is transferred from the culture vessel to the cell collection vessel after being reduced.
  • cell culture usually takes a period of several days to several weeks, so that cell growth is not inhibited by the depletion of medium components or accumulation of cell metabolites,
  • the medium may be changed as necessary.
  • the cells in the cell suspension must be allowed to settle by allowing the culture vessel to stand before draining the cell suspension supernatant. It takes time to settle the cells.
  • cells may be mixed into the supernatant by the discharge operation, and the cells may be discharged together with the supernatant.
  • it is desirable to remove as much of the old medium as possible, and to add more new medium.
  • cell contamination is avoided. It will not be possible.
  • the flow path diameter of the port is usually about 1 to 10 mm, and the area of the filter is relatively small. Therefore, the trapped cells are likely to be clogged, and the old medium may be prevented from being discharged. is there. Furthermore, there is a possibility that the cells captured by the filter do not return to the culture container and die while being captured by the filter.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances. For example, when exchanging a medium, various operations performed in cell culture such as suppression of discharge of cells together with an old medium can be performed.
  • the purpose of the present invention is to provide a cell culture container used for cell culture in order to carry out simply and efficiently, and a method for using the same.
  • a cell culture container is a cell culture container used for cell culture, and includes a container main body and an injection port, and the inside of the container main body is constituted by at least one filter member.
  • the configuration is divided into a plurality of tanks.
  • FIG. 1 is explanatory drawing which shows an example of the container for cell cultures concerning this embodiment.
  • a container 1 shown in FIG. 1 includes a container body 2 and injection ports 3a and 3b.
  • the interior of the container body 2 is partitioned by a sheet-like filter member 4 into a first tank 1st on the top surface 2a side and a second tank 2nd on the bottom surface 2b side.
  • the first tank 1st and the second tank 2nd on the bottom surface 2b side are respectively provided with injection ports 3a and 3b.
  • the container body 2 is not limited in its specific form as long as it can accommodate a culture medium or a cell suspension obtained by suspending cells in a culture medium without hindrance to culture.
  • it may be a container molded into a predetermined shape by injection molding, blow molding, or the like, or may be a pouch-shaped container in which two plastic films are stacked and the periphery is sealed.
  • the injecting / extracting ports 3a and 3b are portions that serve as entrances and exits when injecting and discharging the medium and cells.
  • the injecting ports 3a and 3b are provided by attaching a tubular member through which the medium or cells can flow to the container body 2. Can do.
  • first tank 1st on the top surface 2a side and the second tank 2nd on the bottom surface 2b side have, for example, separate injection ports for sampling the culture medium and cells being cultured. You may make it prepare.
  • Each tank defined by the filter member 4 may be provided with two or more injection ports as required.
  • the container body 2 is made of a plastic film, the periphery is sealed, the top surface 2 a side has a bulging shape that bulges in a plateau shape, and the top surface 2 a is a flat surface. It is formed so that the edge is inclined and continues to the peripheral portion. Furthermore, the bottom surface 2b side also has a bulging shape that bulges in a plateau shape, and is formed so that the edge of the bottom surface 2b, which is a flat surface, is inclined and continues to the periphery.
  • the container body 2 Since the container body 2 has such a bulging shape, it is possible to suppress deformation when injecting a culture medium or cells. That is, in a flat pouch-shaped container in which two plastic films are overlapped and the periphery is sealed, the bottom surface is deformed so that the periphery rises as the container is filled with the content liquid.
  • the bulging shape of the container body 2 By designing the bulging shape of the container body 2 in consideration, it is possible to suppress the deformation of the container body 2 when injecting the culture medium or cells and to keep the bottom surface 2b of the container body 2 flat. It becomes. Therefore, in the container 1 shown in FIG. 1, the cells in the medium are uniformly settled on the bottom surface 2b of the container body 2 so that the density of the cells settled on the bottom surface 2b (the number of cells per unit area) is not biased. It is preferably used when it is required to do.
  • the container 1 shown in FIG. 1 can be manufactured as follows, for example. First, two plastic films and a sheet-like filter member 4 are prepared, and these are cut as necessary to make the sizes uniform. Then, one plastic film is a top surface side plastic film that becomes the top surface 2a side of the container body 2, and the other plastic film is a bottom surface side plastic film that becomes the bottom surface 2b side of the container body 2, and these are vacuum formed and compressed air By molding or the like, it is molded so as to swell in a plateau shape, leaving its peripheral part.
  • a sheet-like filter member 4 is inserted between the molded top surface side plastic film and bottom surface side plastic film, and these peripheral portions are overlapped.
  • the tubular ports forming the injection ports 3a and 3b are formed between the top surface side plastic film and the filter member 4 and between the bottom surface side plastic film and the filter member 4, respectively, at predetermined positions on the periphery.
  • the member is sandwiched, and in that state, the peripheral portion is sealed by thermal fusion, and the peripheral portion is trimmed as necessary. Thereby, the container 1 shown in FIG. 1 is manufactured.
  • the plastic film forming the container body 2 is a gas whose oxygen permeability measured at a test temperature of 37 ° C. is 5000 mL / (m 2 ⁇ day ⁇ atm) or more in accordance with the gas permeability test method of JIS K 7126. It is preferable that it has permeability. Moreover, it is preferable that a part or all of the plastic film has transparency so that the progress of cell culture and the state of cells can be confirmed.
  • the material used for the plastic film forming the container body 2 is not particularly limited.
  • examples thereof include thermoplastic resins such as polyethylene, polypropylene, ethylene-vinyl acetate copolymer, polyester, polyamide, silicone elastomer, polystyrene elastomer, and tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer (FEP). These may be used as a single layer or may be used by laminating the same or different materials, but preferably have a predetermined gas permeability. Furthermore, it is preferable to have a layer that functions as a sealant layer in consideration of heat-fusibility when sealing the peripheral portion.
  • thermoplastic resins such as polyethylene, polypropylene, ethylene-vinyl acetate copolymer, polyester, polyamide, silicone elastomer, polystyrene elastomer, and tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer (FEP). These may
  • the thickness of the plastic film used to form the container body 2 is 30 to 200 ⁇ m so that the container body 2 has an appropriate shape-retaining property while maintaining flexibility while maintaining the bulging shape of the container body 2 Is preferred.
  • the tubular members forming the injection ports 3a and 3b are made of a predetermined material by injection molding, extrusion molding or the like using a thermoplastic resin such as polyethylene, polypropylene, vinyl chloride, polystyrene elastomer, FEP. It can be formed into a shape.
  • a thermoplastic resin such as polyethylene, polypropylene, vinyl chloride, polystyrene elastomer, FEP. It can be formed into a shape.
  • the filter member 4 is formed using a porous body having pores that allow at least the passage of the culture medium. However, it is not suitable that the cells cannot enter and exit the pores. From such a viewpoint, it is preferable to use a mesh sheet knitted with synthetic resin fibers made of a polyolefin such as polyolefin, polyester or nylon, or a fluorine resin such as polytetrafluoroethylene.
  • the size of the pores of the filter member 4 can be appropriately selected depending on how the container 1 is used.
  • the filter member 4 is preferably subjected to a hydrophilic treatment in order to enhance the permeability of the culture medium. By applying the hydrophilic treatment, it is possible to make the cells difficult to adhere.
  • the filter member 4 should just be formed using the above-mentioned porous body at least partially. For example, when the container 1 is manufactured as described above, the filter member 4 is formed by holding the periphery of the porous body with a plastic film cut into a frame shape. It is also possible to achieve better thermal fusion with the plastic film.
  • the size of the container body 2 is not particularly limited, but is preferably, for example, 50 to 500 mm in length and 50 to 500 mm in width.
  • FIG. 2 shows an example in which the container 1 shown in FIG. 1 is used for cell culture as a culture container capable of easily and efficiently performing operations such as medium exchange.
  • the cells C to be cultured are injected into the container body 2 filled with the medium from the injection port 3b provided in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side to perform culture.
  • a filter member 4 having a pore that does not allow passage of the cell C is selected.
  • the cells C in culture can remain in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side and do not move to the first tank 1st on the top surface 2a side (see FIG. 2A). .
  • the old medium is discharged from the injection port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side (see FIG. 2 (b)).
  • the cells C being cultured can remain in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side, it can be prevented from being discharged together with the old medium, and more old medium can be discharged. It becomes possible.
  • a new medium of the same amount is injected from the injection port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side (see FIG. 2C), and the culture is continued.
  • the medium exchange during the culture period in particular, the operation of discharging the old medium can be performed easily and efficiently.
  • the container 1 in this use example is a state in which the cells C stay in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side, and the infusion port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side
  • the content liquid can be discharged.
  • the cell recovery operation exemplified in Patent Document 1 is also performed simply and efficiently without taking time to settle the cells. be able to.
  • it uses as a cell collection container of the cell culture kit of patent document 1, transfers the cell suspension collect
  • Introducing a washing and recovering mechanism into the cell culture kit of Patent Document 1 by repeating the injection and discharge of the washing liquid from the injecting and discharging port 3a provided in the first tank 1st so that the cell washing operation is performed. Can do.
  • the antibody-producing cell is cultured in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side and the produced antibody is taken out from the injection port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side.
  • a filter member 4 having a pore that does not allow passage of cells C to be cultured is selected, and the cells C are injected into one tank 2nd partitioned by the filter member 4.
  • the medium, the medium C, the washing solution, or the like is injected from the injection port 3a provided in the other tank 1st partitioned by the filter member 4 while the cells C remain in the tank 2nd. Can do.
  • FIG. 3 shows an example in which the container 1 shown in FIG. 1 is used for cell culture as an agglomerate dividing container that can easily and efficiently perform an operation of dividing the cell agglomerate Cagg into a desired size. Show.
  • the aggregate Cagg is pumped together with the culture medium from the injection port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side into the container body 2 filled with the culture medium.
  • a filter member 4 having a pore corresponding to the size of the aggregate Cagg to be divided is selected.
  • the agglomerate Cagg is sent to the second tank 2nd on the bottom surface 2b side while being divided into sizes corresponding to the pores of the filter member 4.
  • the agglomerate Cdiv divided into a desired size can be taken out from the injection port 3b provided in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side.
  • the filter member 4 having a pore corresponding to the size to be divided into cell aggregates Cagg is selected, and one tank 1st partitioned by the filter member 4 is selected.
  • the operation of dividing the cell aggregate Cagg into a desired size can be performed easily and efficiently by pumping the aggregate Cagg together with the medium.
  • the aggregate Cagg may be pumped together with the culture medium from the injection port 3b provided in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side, if necessary.
  • the interior of the container body 2 is divided into three or more tanks, and the size of the pores of the filter member 4 that partitions each tank is adjusted as appropriate, so that the aggregate Cagg is stepwise. It can also be divided. Furthermore, by providing each tank with an injection port, the agglomerates Cdiv divided into different sizes can be taken out.
  • FIG. 4 shows two types of cells having different sizes mixed in the container 1 shown in FIG. 1, for example, a cell that can easily and efficiently perform an operation of separating a single cell Cs and its aggregate Cagg.
  • the example which uses for the use of cell culture as a separation container is shown.
  • cells in which two types of cells Cs and Cagg of different sizes are mixed from the injection port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side in the container body 2 filled with the culture medium.
  • the suspension is injected (step 1).
  • the container 1 is allowed to stand and vibration is applied as necessary.
  • the filter member 4 is selected from two types of cells Cs and Cagg to be separated that have pores that allow passage of the smaller cell Cs but do not allow passage of the larger cell Cagg. .
  • the smaller cell Cs passes through the pores of the filter member 4 and settles in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side, and the larger cell Cagg becomes the first cell on the top surface 2a side. It can be made to stay in the tank 1st.
  • the smaller cell Cs settled in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side is separated from the larger cell Cagg and can be taken out from the injecting port 3b provided in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side.
  • the larger cell Cagg which is separated from the smaller cell Cs and stays in the first tank 1st on the top surface 2a side, is taken out from the injection port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side.
  • the filter member 4 As described above, in the present usage example, as the filter member 4, a filter member having pores that allow passage of at least one cell among mixed cells but not allow passage of other cells is selected. By injecting mixed cells of different sizes into one tank 1st partitioned by the filter member 4, the cells passing through the filter member 4 are taken out from the other tank 2nd partitioned by the filter member 4. The operation of separating the mixed cells having different sizes can be performed easily and efficiently.
  • the inside of the container body 2 is partitioned into three or more tanks, the size of the pores of the filter member 4 partitioning each tank is appropriately adjusted, and an injection port is provided in each tank. By providing, it is possible to separate three or more types of cells having different sizes.
  • FIG. 5 shows the container 1 shown in FIG. 1 as a co-culture container that can easily and efficiently carry out the operation of separately taking out different types of cells Ca and Cb in the same container and then separately taking them out.
  • An example for use in cell culture is shown.
  • the cell Ca is injected into the container body 2 filled with the medium from the injection port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side, and the second tank 2nd on the bottom surface 2b side.
  • the cell Cb is injected from the injection port 3b included in the cell, and the cells Ca and Cb are co-cultured.
  • a filter member 4 having a pore that does not allow passage of any of the cells Ca and Cb to be co-cultured is selected.
  • one cell Ca remains in the first tank 1st on the top surface 2a side, and the other cell Cb remains in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side, so that both are the same without mixing.
  • one cell Ca can be taken out from the injection port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side, and the other cell Cb is injected in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side. It can be taken out from the outgoing port 3b.
  • the filter member 4 one having pores that do not allow passage of any cells Ca and Cb to be co-cultured is selected, and each of the cells divided by the filter member 4 is selected.
  • the cells Ca and Cb By separately injecting different types of cells Ca and Cb into the tanks 1st and 2nd for each type, the cells Ca and Cb can be co-cultured in the same container without being mixed. The operation of separately taking out can be performed easily and efficiently.
  • three or more types of cells can be co-cultured by partitioning the inside of the container body 2 into three or more tanks and providing each tank with an injection port.
  • FIG. 6 is explanatory drawing which shows an example of the container for cell cultures concerning this embodiment.
  • a container 1 shown in FIG. 6 includes a container body 2 and an injection port 3a.
  • the interior of the container body 2 is partitioned by a sheet-like filter member 4 into a first tank 1st on the top surface 2a side and a second tank 2nd on the bottom surface 2b side.
  • the first tank 1st is provided with an injection port 3a.
  • the container 1 shown in FIG. 6 is different from the container 1 shown in FIG. 1 as an example of the first embodiment in that the second tank 2nd on the bottom surface 2b side does not include the injection port 3b.
  • Other configurations are common.
  • Such a container 1 can be manufactured in the same manner as the container 1 shown in FIG. 1 of the first embodiment. In this case, the tubular member that forms the injection port 3b may be omitted.
  • This embodiment is different from the first embodiment described above in that the second tank 2nd on the bottom surface 2b side does not include the injection port 3b, and other configurations are the same as those in the first embodiment described above. Since it is common with the form, the overlapping description is omitted. Needless to say, the specific form of the container body 2 is not limited as in the first embodiment.
  • FIG. 7 shows the use of the cell culture as a culture vessel in which the container 1 shown in FIG. 6 can be easily and efficiently operated for exchanging the medium when culturing the cells Cs forming the aggregate Cagg. An example is given.
  • the cell Cs forming the aggregate Cagg is targeted for culture, and the filter member 4 allows the passage of cells (single cell) Cs before forming the aggregate Cagg, but does not allow the passage of the aggregate Cagg. Select those that have unacceptable pores.
  • the cells (single cells) Cs to be cultured are injected into the container body 2 filled with the medium from the injection port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side, the cells Cs are filtered. It passes through the member 4 and settles in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side (see FIG. 7A). Then, as the culture proceeds, the cells Cs form an aggregate Cagg and cannot pass through the filter member 4, and thus the culture is performed in a state where the aggregate Cagg remains in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side. It can be made to progress (refer FIG.7 (b)).
  • the old medium is discharged from the injection port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side, and a new medium is injected (FIG. 7).
  • the medium can be changed while the aggregate Cagg remains in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side.
  • the cleaning liquid is repeatedly injected and discharged from the injection port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side, thereby agglomerating in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side.
  • the agglomerate Cagg can be washed while the agglomerate Cagg remains.
  • the filter member 4 when culturing the cells Cs that form the aggregate Cagg, the filter member 4 allows the passage of the cells Cs before forming the aggregate Cagg, but the aggregate Cagg. Is selected to have pores that do not allow passage, and the cells Cs are injected into the first tank 1st and then settled into the second tank 2nd, and the formed agglomerates Cagg are added to the second tank 2nd.
  • operations such as medium exchange during the culture period and washing after completion of the culture can be performed easily and efficiently.
  • the container 1 can also be utilized for storage and conveyance of the cultured cell (aggregate Cag Cagg).
  • the second tank 2nd on the bottom surface 2b side includes the injection port 3b, as in the first embodiment described above, cells cultured from the injection port 3b ( Agglomerate Cagg) can also be removed.
  • FIG. 8 is explanatory drawing which shows an example of the cell culture container which concerns on this embodiment.
  • a container 1 shown in FIG. 8 includes a container body 2 and an injection port 3a.
  • the interior of the container body 2 is partitioned by a sheet-like filter member 4 into a first tank 1st on the top surface 2a side and a second tank 2nd on the bottom surface 2b side.
  • the first tank 1st is provided with an injection port 3a, and a plurality of recesses 5 are provided on the bottom surface 2b of the container body 2.
  • the container 1 shown in FIG. 8 is different from the container 1 shown in FIG. 6 as an example of the second embodiment in that a plurality of recesses 5 are provided on the bottom surface 2b of the container main body 2.
  • the configuration is the same.
  • Such a container 1 can be manufactured in the same manner as the container 1 shown in FIG. 6 of the second embodiment, and when the bottom surface side plastic film is molded, the recess 5 Can be molded in a desired shape and arrangement.
  • the recess 5 By providing the plurality of recesses 5 on the bottom surface 2b of the container body 2, cells that settle in the medium are collected at the bottom of each recess 5, and can be efficiently cultured in a state where the cell density is increased. .
  • the recess 5 Has an opening diameter (diameter) of preferably 0.3 to 10 mm, more preferably 0.3 to 5 mm, still more preferably 0.5 to 4 mm, and particularly preferably 0.5 to 2 mm. Is preferably 0.1 mm or more.
  • the concave portion 5 is formed in a bowl shape, but may be formed in a conical shape, a truncated cone shape, or the like as necessary.
  • This embodiment is different from the above-described second embodiment in that a plurality of recesses 5 are provided on the bottom surface 2b of the container body 2, and other configurations are common to the above-described second embodiment.
  • the overlapping description is omitted.
  • the specific form of the container main body 2 is not limited like 1st and 2nd embodiment.
  • FIG. 9 shows that the container 1 shown in FIG. 8 is cultured efficiently in a state where the cell density is increased in culturing the cells Cs that form the aggregate Cagg, and operations such as medium exchange are simple and As an example of a culture vessel that can be efficiently used, an example for cell culture is shown.
  • the cell Cs forming the aggregate Cagg is targeted for culture, and the filter member 4 allows the passage of cells (single cell) Cs before forming the aggregate Cagg, but does not allow the passage of the aggregate Cagg. Select those that have unacceptable pores.
  • the cells (single cells) Cs to be cultured are injected into the container body 2 filled with the medium from the injection port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side, the cells Cs are filtered. It passes through the member 4 and settles in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side. The precipitated cells Cs are collected at the bottom of each recess 5 and can be efficiently cultured in a state where the cell density is increased. Then, as the culture proceeds, the cells Cs form an aggregate Cagg and cannot pass through the filter member 4, and thus the culture is performed in a state where the aggregate Cagg remains in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side. Can be advanced.
  • the old medium is discharged from the injection port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side, and a new medium is injected, whereby the bottom surface 2b.
  • the culture medium can be exchanged while the aggregate Cagg remains in the second tank 2nd on the side.
  • a filter member 4 is adhered to the periphery of the recess 5 of the bottom surface 2b (surface located between the adjacent recesses 5) to cover the opening of the recess 5
  • the member 4 is preferably fixed in the container body 2.
  • the cleaning liquid is repeatedly injected and discharged from the injection port 3a provided in the first tank 1st on the top surface 2a side, thereby agglomerating in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side.
  • the agglomerate Cagg can be washed while the agglomerate Cagg remains.
  • the filter member 4 when culturing the cells Cs that form the aggregate Cagg, the filter member 4 allows the passage of the cells Cs before forming the aggregate Cagg, but the aggregate Cagg. Is selected to have a pore that does not allow passage, and the cells Cs are injected into the first tank 1st and then settled into the second tank 2nd, and the precipitated cells Cs are collected at the bottom of the recess 5.
  • the filter member 4 While efficiently culturing in a state where the cell density is increased, by culturing in the state where the formed agglomerate Cagg stays in the second tank 2nd, medium exchange during the culture period, after the end of the culture Operations such as washing can be performed simply and efficiently.
  • the container 1 can also be utilized for storage and conveyance of the cultured cell (aggregate Cag Cagg).
  • the second tank 2nd on the bottom surface 2b side includes the injection port 3b, as in the first embodiment described above, cells cultured from the injection port 3b ( Agglomerate Cagg) can also be removed.
  • FIG. 10 is explanatory drawing which shows an example of the container for cell cultures concerning this embodiment.
  • a container 1 shown in FIG. 10 includes a container body 2 and injection ports 3a, 3b, and 3c. And the inside of the container main body 2 is the 2nd tank 2nd by the side of the 1st tank 1st by the side of the top
  • first tank 1st on the top surface 2a side is provided with injection ports 3a (IN) and 3a (OUT) as inflow and outlet ports.
  • second tank on the bottom surface 2b side is provided with the second tank 1st.
  • the tank 2nd is provided with injection ports 3b (IN) and 3b (OUT) serving as inflow / outflow ports.
  • the third tank 3rd is provided with an injection port 3c.
  • the container 1 shown in FIG. 10 divides the inside of the container body 2 into three tanks, each tank is provided with an injection port, and two injections are made in the first tank 1st on the top surface 2a side.
  • the outlet ports 3a (IN) and 3a (OUT) are provided, and the second tank 2nd on the bottom surface 2b side is provided with two injection ports 3b (IN) and 3b (OUT).
  • a container 1 can be manufactured as follows, for example.
  • one plastic film is a top surface side plastic film that becomes the top surface 2a side of the container body 2
  • the other plastic film is a bottom surface side plastic film that becomes the bottom surface 2b side of the container body 2, and these are vacuum formed and compressed air
  • it is molded so as to swell in a plateau shape, leaving its peripheral part.
  • two sheet-like filter members 4 are inserted between the molded top surface side plastic film and bottom surface side plastic film, and these peripheral portions are overlapped. Then, a tubular member forming injection ports 3a (IN) and 3a (OUT) is sandwiched between the top surface side plastic film and the filter member 4 at a predetermined position in the periphery thereof, and the bottom surface side plastic Between the film and the filter member 4, a tubular member that forms the injection ports 3 b (IN) and 3 b (OUT) is sandwiched between the film and the filter member 4 at a predetermined position in the periphery thereof, and two sheet-like filter members 4 are inserted.
  • pouring port 3c is pinched
  • the container 1 shown in FIG. 10 is manufactured.
  • This embodiment is different from the first embodiment described above in that the inside of the container body 2 is divided into three tanks, each tank is provided with an inlet port, and the first tank on the top surface 2a side. 1st includes two injection ports 3a (IN) and 3a (OUT), and the second tank 2nd on the bottom surface 2b side includes two injection ports 3b (IN) and 3b (OUT). Since other configurations are the same as those in the first embodiment described above, redundant description is omitted. In addition, it cannot be overemphasized that the specific form of the container main body 2 is not limited like 1st, 2nd, and 3rd embodiment.
  • FIG. 11 shows cell culture as a culture container in which the container 1 shown in FIG. 10 can be easily and efficiently operated to reproduce an environment in which cells C to be cultured grow, proliferate, and differentiate in vivo. An example for use is shown.
  • the cells C to be cultured are injected from the injection port 3c provided in the third tank 3rd, and the culture is performed.
  • the first tank 1st on the top surface 2a side and the bottom surface 2b side are used.
  • media having different component compositions are circulated. In more detail, it flowed in from each of the injection port 3a (IN) provided in the first tank 1st on the top surface 2a side and the injection port 3b (IN) provided in the second tank 2nd on the bottom surface 2b side.
  • Medium having different component compositions is mixed in the third tank 3rd and flows out from the respective injection ports 3a (OUT) and 3b (OUT).
  • a filter member 4 having a pore that does not allow passage of the cell C is selected.
  • the medium circulated in each of the first tank 1st on the top surface 2a side and the second tank 2nd on the bottom surface 2b side is used for various extracellular substrates that control cell growth, proliferation, and differentiation, and for cells. Including various signal substances that give stimuli, etc.
  • the component composition, flow rate / flow velocity are set so that the concentration gradient and direction of arrival are equivalent to the environment in the living body. Etc. are adjusted. Thereby, culture
  • the filter member 4 having a pore that does not allow passage of cells C to be cultured is selected, and each of the first tank 1st and the second tank 2nd is selected.
  • the cells C are injected into the third tank 3rd and cultured to reproduce the environment in which the cells C to be cultured grow, multiply and differentiate in vivo. The operation can be performed easily and efficiently.
  • FIG. 12 is explanatory drawing which shows an example of the cell culture container which concerns on this embodiment.
  • well plates have been widely used for cell culture. For example, when inducing differentiation from ES cells or iPS cells into neural stem cells, myocardium, pancreas, liver, cartilage, etc., cells are seeded in a well plate (for example, a 96-well plate), and aggregates in the well.
  • a method is adopted in which differentiation induction is advanced to induce differentiation.
  • This embodiment is intended to enable simple and efficient operations such as medium exchange when culturing cells using a container having a plurality of cell culture units such as a well plate. It is.
  • a container 1 shown in FIG. 12 includes a container body 2 having a plurality of recesses 6 serving as a cell culture section, and the opening of each recess 6 is covered with a sheet-like filter member 4. It has been broken.
  • the filter member 4 covering the opening of each recess 6 is attached to the container body 2 so as to be in close contact with the periphery of the recess 6 (the surface located between the openings of the adjacent recesses 6). Preferably, it adhere
  • the container body 2 is not limited in its specific form as long as cells, culture media, and the like can be accommodated in the respective recesses 6 without any difficulty in culturing.
  • the container body 2 is surrounded by the container body 2. It is preferable to provide a side wall portion 7 that rises.
  • the filter member 4 is as described in the first embodiment.
  • cells that form aggregates are to be cultured, and a filter member 4 having pores that do not allow passage of aggregates is selected.
  • the cells to be cultured are injected together with the medium into each recess 6 serving as a cell culture portion, and the culture is started. As the culture progresses, the cells injected into the recess 6 form aggregates.
  • the old medium When the culture progresses and it is time to replace the medium, the old medium is discharged from each recess 6. At this time, the filter members 4 covering the openings of the respective recesses 6 do not allow the passage of aggregates. Therefore, when exchanging the medium, only the old medium can be flowed out by simply tilting the container 1, and the pipette The old medium can be discharged from the respective recesses 6 without any operation.
  • the container body 2 is provided with a side wall portion 7 that rises so as to surround the periphery of the container body 2, the new medium flows into the respective recesses 6 simply by pouring a new medium inside the side wall portion 7. Can be. By doing in this way, a new culture medium can be inject
  • spheres formed in the process of cell culture, in particular, the passage of ES cells and iPS cells, and differentiation induction from these stem cells into neural stem cells, cardiac muscle, pancreas, liver, cartilage and the like.
  • Various operations performed during culture can be performed simply and efficiently.
  • various operations can be easily and efficiently performed for culturing antibody-producing cells such as lymphocytes and hybridomas, and floating cells such as megakaryocytes and erythrocytes.
  • the present invention can be used as a technique for efficiently culturing cells in the fields of pharmaceutical science and biochemistry.
  • container (cell culture container) 2 container main body 2a top surface 2b bottom surface 3a, 3b, 3c injection port 4 filter member 5 recessed portion 6 recessed portion 7 side wall portion 1st first tank 2nd second tank 3rd third tank

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Abstract

容器本体２と注入出用ポート３ａ，３ｂとを備える細胞培養用容器１において、容器本体２の内部をフィルタ部材４によって複数の槽１ｓｔ，２ｎｄに区画する。これにより、細胞培養に際して行われる種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うことができるようにする。

Description

細胞培養用容器、及びその使用方法
　本発明は、細胞培養に際して行われる種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うために細胞培養の用途に供される細胞培養用容器、及びその使用方法に関する。
　近年、医薬品の生産、遺伝子治療、再生医療、免疫療法などの医薬学・生化学分野において、細胞（組織、微生物、ウイルスなどを含む）を人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
　このような要求に応えるべく、本出願人は、閉鎖系の環境を構築してコンタミネーションのリスクを低減しつつ、効率的に細胞培養を行うことができる細胞培養システムについて検討を重ねてきた。
　例えば、特許文献１において、細胞を培養するための培養容器と、培地等を貯蔵しておくための培地貯蔵容器と、細胞を注入するための細胞注入容器と、培養後の細胞懸濁液を回収する細胞回収容器とを導管によって連結し、閉鎖系の環境を構築してなる細胞培養用キットを提案している。このような細胞培養用キットによれば、細胞注入から培地追加、サンプリング、回収までをキット内で閉鎖系を維持しながら行うことが可能となる。
国際公開２０１３／１１４８４５号パンフレット
　ところで、特許文献１には、培養された細胞を回収するにあたり、培養容器を静置して細胞懸濁液中の細胞を沈降させた後に、細胞懸濁液の上澄みを排出し、液量を低減させてから、濃縮された細胞懸濁液を培養容器から細胞回収容器に移送する例が示されている。
　また、細胞の培養には、通常、数日～数週間の期間を要するため、培地成分の枯渇や細胞の代謝物の蓄積によって細胞の成長が阻害されてしまわないように、培養期間中に、必要に応じて培地交換を行うことがある。培地交換を行うに際しては、細胞懸濁液の上澄みを排出することによって古い培地を取り除くとともに、それに代えて新しい培地を追加することが考えられる。
　しかしながら、このようにして細胞の回収や培地交換を行うには、細胞懸濁液の上澄みを排出するに先立って、培養容器を静置して細胞懸濁液中の細胞を沈降させておかなければならず、細胞を沈降させるまでに時間を要してしまう。一方、十分な時間をかけて細胞懸濁液中の細胞を沈降させても、排出操作によって上澄みに細胞が混入し、上澄みと一緒に細胞が排出されてしまう虞もある。特に、培地交換を行うにあたっては、古い培地ができるだけ多く取り除かれるようにして、新しい培地がより多く追加されるようにすることが望まれるが、上澄みの排出量が多くなるほど、細胞の混入が避けられなくなってしまう。
　また、培地交換を行う際に、古い培地と一緒に細胞が排出されてしまうのを防ぐには、培養容器に設けられたポートの流路にフィルタを取り付けることも考えられる。
　しかしながら、ポートの流路径は、通常、１～１０ｍｍ程度であり、フィルタの面積も比較的小さくなるため、捕捉された細胞によってフィルタに目詰まりが生じ易く、古い培地の排出を妨げてしまう虞がある。さらに、フィルタに捕捉された細胞が培養容器内に戻らずに、フィルタに捕捉されたまま死滅してしまう虞もある。
　本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、例えば、培地交換を行う際に、古い培地と一緒に細胞が排出されてしまうのを抑制できるなど、細胞培養に際して行われる種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うために細胞培養の用途に供される細胞培養用容器、及びその使用方法の提供を目的とする。
　本発明に係る細胞培養用容器は、細胞培養の用途に供される細胞培養用容器であって、容器本体と注入出用ポートとを備え、前記容器本体の内部が、少なくとも一つのフィルタ部材によって複数の槽に区画されている構成としてある。
　本発明によれば、細胞培養に際して行われる種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
本発明の第一実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。 本発明の第一実施形態に係る細胞培養用容器の使用例を示す説明図である。 本発明の第一実施形態に係る細胞培養用容器の他の使用例を示す説明図である。 本発明の第一実施形態に係る細胞培養用容器の他の使用例を示す説明図である。 本発明の第一実施形態に係る細胞培養用容器の他の使用例を示す説明図である。 本発明の第二実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。 本発明の第二実施形態に係る細胞培養用容器の使用例を示す説明図である。 本発明の第三実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。 本発明の第三実施形態に係る細胞培養用容器の使用例を示す説明図である。 本発明の第四実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。 本発明の第四実施形態に係る細胞培養用容器の使用例を示す説明図である。 本発明の第五実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
　以下、本発明の好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
［第一実施形態］
　まず、本発明の第一実施形態について説明する。
　なお、図１は、本実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
　本実施形態の一例として図１に示す容器１は、容器本体２と注入出用ポート３ａ，３ｂとを備えている。そして、容器本体２の内部は、シート状のフィルタ部材４によって、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄとに区画されており、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄのそれぞれに、注入出用ポート３ａ，３ｂが備えられている。
　容器本体２は、培地又は培地中に細胞を懸濁させた細胞懸濁液を、培養に支障なく収容できれば、その具体的な形態は限定されない。例えば、射出成形、ブロー成形などにより所定の形状に成形された容器としてもよく、二枚のプラスチックフィルムを重ねて周辺部をシールしたパウチ状の容器としてもよい。
　注入出用ポート３ａ，３ｂは、培地や細胞を注入、排出などする際の出入り口となる部位であり、例えば、培地や細胞などが流通可能な管状の部材を容器本体２に取り付けることによって備えることができる。
　また、特に図示しないが、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄには、例えば、培養中の培地や細胞をサンプリングなどするための注入出用ポートを別途備えるようにしてもよい。
　フィルタ部材４によって区画されたそれぞれの槽は、必要に応じて、二以上の注入出用ポートを備えることができる。
　図１に示す一例において、容器本体２は、プラスチックフィルムからなり、周辺部がシールされ、その天面２ａ側が台地状に膨出した膨出形状を有し、平坦面とされた天面２ａの縁が傾斜して周辺部に連なるように形成されている。さらに、底面２ｂ側も台地状に膨出した膨出形状を有しており、平坦面とされた底面２ｂの縁が傾斜して周辺部に連なるように形成されている。
　容器本体２が、このような膨出形状を有することで、培地や細胞を注入する際の変形を抑制することができる。
　すなわち、二枚のプラスチックフィルムを重ねて周辺部をシールしただけの平パウチ状の容器では、容器内が内容液で満たされていくにつれて周辺部が持ち上がるように底面が変形するが、注入量を考慮して容器本体２の膨出形状を設計することで、培地や細胞を注入する際の容器本体２の変形を抑制して、容器本体２の底面２ｂを平坦面のままとすることが可能となる。
　したがって、図１に示す容器１は、容器本体２の底面２ｂに培地中の細胞を均一に沈降させ、底面２ｂに沈降した細胞の密度（単位面積あたりの細胞数）に偏りが生じないようにすることが求められる場合に好適に用いられる。
　図１に示す容器１は、例えば、次のようにして製造することができる。
　まず、二枚のプラスチックフィルムとシート状のフィルタ部材４とを用意し、これらを必要に応じて裁断して、その大きさを揃える。そして、一方のプラスチックフィルムを容器本体２の天面２ａ側となる天面側プラスチックフィルムとし、他方のプラスチックフィルムを容器本体２の底面２ｂ側となる底面側プラスチックフィルムとして、これらを真空成形、圧空成形などにより、その周辺部を残して台地状に膨出するように成形する。
　次に、成形された天面側プラスチックフィルムと底面側プラスチックフィルムとの間に、シート状のフィルタ部材４を挿入して、これらの周辺部を重ね合せる。そして、天面側プラスチックフィルムとフィルタ部材４との間と、底面側プラスチックフィルムとフィルタ部材４との間に、それぞれ周辺部の所定の位置において、注入出用ポート３ａ，３ｂを形成する管状の部材を挟み込み、その状態で周辺部を熱融着によりシールし、必要に応じて周辺部をトリミングする。これにより、図１に示す容器１が製造される。
　容器本体２を形成するプラスチックフィルムは、ＪＩＳ　Ｋ　７１２６のガス透過度試験方法に準拠して、試験温度３７℃で測定した酸素の透過度が、５０００ｍＬ／（ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）以上のガス透過性を有するものであるのが好ましい。
　また、当該プラスチックフィルムは、細胞培養の進行状況や細胞の状態などを確認できるように、一部又は全部が透明性を有しているのが好ましい。
　容器本体２を形成するプラスチックフィルムに用いる材料としては、特に限定されない。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン－酢酸ビニル共重合体、ポリエステル、ポリアミド、シリコーン系エラストマー、ポリスチレン系エラストマー、テトラフルオロエチレン－ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）などの熱可塑性樹脂が挙げられる。これらは単層で用いても、同種又は異種の材料を積層して用いてもよいが、所定のガス透過性を有しているのが好ましい。さらに、周辺部をシールする際の熱融着性を考慮すると、シーラント層として機能する層を有しているのが好ましい。
　また、可撓性を有しながらも、容器本体２の膨出形状が保たれる適度の形状保持性を有するように、容器本体２を形成するのに用いるプラスチックフィルムの厚みは、３０～２００μｍであるのが好ましい。
　また、注入出用ポート３ａ，３ｂを形成する管状の部材は、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン系エラストマー、ＦＥＰなどの熱可塑性樹脂を用いて、射出成形、押出成形などにより、所定の形状に成形することができる。
　また、フィルタ部材４は、少なくとも培地の通過を許容する細孔を有する多孔質体を用いて形成されるが、細胞が細孔に入り込んで抜け出せなくなってしまうようなものは不適である。このような観点から、ポリオレフィン、ポリエステル、ナイロン等のポリアミド、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂等からなる合成樹脂繊維を編んだメッシュシートなどを用いて形成するのが好ましい。
　フィルタ部材４の細孔の大きさは、容器１の使用態様によって適宜選択することができる。フィルタ部材４には、培地の通過性を高めるために親水処理が施されているのが好ましく、親水処理を施すことで、細胞が接着し難くすることもできる。
　また、フィルタ部材４は、容器１の使用態様によって要求される機能が損なわれない限り、少なくとも一部が上記したような多孔質体を用いて形成されていればよい。例えば、前述したようにして容器１を製造するに際し、上記多孔質体の周囲を枠状に裁断されたプラスチックフィルムで保持するなどしてフィルタ部材４を形成することで、天面側及び底面側プラスチックフィルムとの熱融着がより良好になされるようにすることもできる。
　また、容器本体２の大きさは特に限定されないが、例えば、縦５０～５００ｍｍ、横５０～５００ｍｍとするのが好ましい。
　次に、本実施形態の一例として図１に示す容器１の使用例について説明する。
［第一実施形態の使用例１］
　図２は、図１に示す容器１を、培地交換などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる培養容器として細胞培養の用途に供する例を示している。
　本使用例では、培地で満たされた容器本体２内に、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂから、培養対象の細胞Ｃを注入して培養を行う。このとき、培養対象の細胞Ｃの大きさを考慮して、フィルタ部材４として、かかる細胞Ｃの通過を許容しない細孔を有するものを選択する。これにより、培養中の細胞Ｃは、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに留まり、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔには移動しないようにすることができる（図２（ａ）参照）。
　培養期間中に培地交換を行う際には、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、古い培地を排出する（図２（ｂ）参照）。このとき、培養中の細胞Ｃを、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに留まらせることができるため、古い培地と一緒に排出されないようにすることができ、古い培地をより多く排出させることが可能になる。古い培地を排出した後は、それと同量の新しい培地を天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから注入し（図２（ｃ）参照）、培養を継続する。
　このように、本使用例にあっては、培養期間中の培地交換、特に、古い培地の排出操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
　また、本使用例における容器１は、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに細胞Ｃを留まらせた状態で、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、容器内の内容液を排出することができる。このため、例えば、特許文献１の細胞培養用キットの培養容器として使用すれば、特許文献１が例示する細胞の回収操作も、細胞の沈降に時間をかけずに、簡便、かつ、効率良く行うことができる。さらに、特許文献１の細胞培養用キットの細胞回収容器として使用し、培養容器から回収された細胞懸濁液を底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに移送して、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、洗浄液の注入、排出を繰り替えして細胞の洗浄操作が行われるようにすることで、特許文献１の細胞培養用キットに洗浄回収機構を導入することができる。
　また、抗体産生細胞を底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄで培養し、産生された抗体を天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから取り出すというように、抗体産生容器としての応用も可能である。
　このように、本使用例では、フィルタ部材４として、培養対象の細胞Ｃの通過を許容しない細孔を有するものを選択して、フィルタ部材４によって区画された一方の槽２ｎｄに細胞Ｃを注入して培養を行うことで、当該槽２ｎｄに細胞Ｃを留まらせた状態で、フィルタ部材４によって区画された他方の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、培地や洗浄液などを注入出することができる。
　したがって、図１に示す容器１を使用するに際しては、必要に応じて、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔで細胞培養を行い、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂから、培地や洗浄液などの注入出がなされるようにしてもよい。
［第一実施形態の使用例２］
　図３は、図１に示す容器１を、細胞の凝集塊Ｃａｇｇを所望の大きさに分割する操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる凝集塊分割容器として細胞培養の用途に供する例を示している。
　本使用例では、培地で満たされた容器本体２内に、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、凝集塊Ｃａｇｇを培地とともに圧送する。このとき、フィルタ部材４として、凝集塊Ｃａｇｇを分割したい大きさに応じた細孔を有するものを選択する。これにより、凝集塊Ｃａｇｇは、フィルタ部材４を通過する際に、フィルタ部材４の細孔に応じた大きさに分割されながら、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに送られていく。
　所望の大きさに分割された凝集塊Ｃｄｉｖは、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂから取り出すことができる。
　このように、本使用例にあっては、フィルタ部材４として、細胞の凝集塊Ｃａｇｇを分割したい大きさに応じた細孔を有するものを選択し、フィルタ部材４によって区画された一方の槽１ｓｔに、凝集塊Ｃａｇｇを培地とともに圧送することで、細胞の凝集塊Ｃａｇｇを所望の大きさに分割する操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
　したがって、図１に示す容器１を使用するに際しては、必要に応じて、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂから、凝集塊Ｃａｇｇを培地とともに圧送するようにしてもよい。
　また、特に図示しないが、容器本体２の内部を三槽以上に区画しておき、各槽を区画するフィルタ部材４の細孔の大きさを適宜調整することで、凝集塊Ｃａｇｇを段階的に分割することもできる。さらに、各槽に注入出用ポートを備えるようにすることで、異なる大きさに分割された凝集塊Ｃｄｉｖを、それぞれ取り出すようにすることもできる。
［第一実施形態の使用例３］
　図４は、図１に示す容器１を、混在する大きさの異なる二種類の細胞、例えば、シングルセルＣｓとその凝集塊Ｃａｇｇとを分離する操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる細胞分離容器として細胞培養の用途に供する例を示している。
　本使用例では、培地で満たされた容器本体２内に、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、大きさの異なる二種類の細胞Ｃｓ，Ｃａｇｇが混在した細胞懸濁液を注入する（ｓｔｅｐ１）。注入後は、容器１を静置し、必要に応じて振動を与える。このとき、フィルタ部材４として、分離したい二種類の細胞Ｃｓ，Ｃａｇｇのうち、小さい方の細胞Ｃｓの通過を許容するが、大きい方の細胞Ｃａｇｇの通過を許容しない細孔を有するものを選択する。これにより、小さい方の細胞Ｃｓは、フィルタ部材４の細孔を通過して、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに沈降していき、大きい方の細胞Ｃａｇｇは、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔに留まるようにすることができる。
　底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに沈降した小さい方の細胞Ｃｓは、大きい方の細胞Ｃａｇｇと分離されて、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂから取り出すことができる（ｓｔｅｐ２）。一方、小さい方の細胞Ｃｓと分離されて天面２ａ側の第一の槽１ｓｔに留まる大きい方の細胞Ｃａｇｇは、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから取り出すことができる（ｓｔｅｐ３）。
　このように、本使用例にあっては、フィルタ部材４として、混在する細胞のうち少なくとも一の細胞の通過を許容するが、それ以外の細胞の通過を許容しない細孔を有するものを選択し、フィルタ部材４によって区画された一方の槽１ｓｔに、混在する大きさの異なる細胞を注入して、フィルタ部材４によって区画された他方の槽２ｎｄから、フィルタ部材４を通過した細胞を取り出すことで、混在する大きさの異なる細胞を分離する操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
　したがって、特に図示しないが、容器本体２の内部を三槽以上に区画しておき、各槽を区画するフィルタ部材４の細孔の大きさを適宜調整するとともに、各槽に注入出用ポートを備えるようにすることで、大きさの異なる三種類以上の細胞を分離することもできる。
［第一実施形態の使用例４］
　図５は、図１に示す容器１を、異なる種類の細胞Ｃａ，Ｃｂを同一容器内で共培養した後に、これらを別々に取り出す操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる共培養容器として細胞培養の用途に供する例を示している。
　本使用例では、培地で満たされた容器本体２内に、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから細胞Ｃａを注入するとともに、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂから細胞Ｃｂを注入して、細胞Ｃａと細胞Ｃｂとを共培養する。このとき、フィルタ部材４として、共培養されるいずれの細胞Ｃａ，Ｃｂも通過を許容しない細孔を有するものを選択する。これにより、一方の細胞Ｃａは天面２ａ側の第一の槽１ｓｔに、他方の細胞Ｃｂは底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに、それぞれが留まった状態で、両者が混ざり合うことなく同一容器内で共培養することができる。
　培養終了後には、一方の細胞Ｃａは天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから取り出すことができ、他方の細胞Ｃｂは底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂから取り出すことができる。
　このように、本使用例にあっては、フィルタ部材４として、共培養されるいずれの細胞Ｃａ，Ｃｂも通過を許容しない細孔を有するものを選択し、フィルタ部材４によって区画されたそれぞれの槽１ｓｔ，２ｎｄに、異なる種類の細胞Ｃａ，Ｃｂを種類ごとに別々に注入することで、当該細胞Ｃａ，Ｃｂが混ざり合うことなく同一容器内で共培養することができ、培養終了後に、これらを別々に取り出す操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
　したがって、特に図示しないが、容器本体２の内部を三槽以上に区画しておき、各槽に注入出用ポートを備えるようにすることで、三種類以上の細胞を共培養することもできる。
［第二実施形態］
　次に、本発明の第二実施形態について説明する。
　なお、図６は、本実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
　本実施形態の一例として図６に示す容器１は、容器本体２と注入出用ポート３ａとを備えている。そして、容器本体２の内部は、シート状のフィルタ部材４によって、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄとに区画されており、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔに、注入出用ポート３ａが備えられている。
　図６に示す容器１は、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが注入出用ポート３ｂを備えていない点で、第一実施形態の一例として図１に示した容器１と異なっているが、その以外の構成は共通している。このような容器１は、第一実施形態の図１に示した容器１と同様にして製造することができ、その際、注入出用ポート３ｂを形成する管状の部材を省略すればよい。
　本実施形態が、前述した第一実施形態と異なるのは、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが注入出用ポート３ｂを備えていない点にあり、これ以外の構成は、前述した第一実施形態と共通するため、重複する説明は省略する。
　なお、第一実施形態と同様に、容器本体２の具体的な形態が限定されないことはいいうまでもない。
　次に、本実施形態の一例として図６に示す容器１の使用例について説明する。
［第二実施形態の使用例］
　図７は、図６に示す容器１を、凝集塊Ｃａｇｇを形成する細胞Ｃｓを培養するにあたり、その培地交換などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる培養容器として細胞培養の用途に供する例を示している。
　本使用例では、凝集塊Ｃａｇｇを形成する細胞Ｃｓを培養対象とし、フィルタ部材４として、凝集塊Ｃａｇｇを形成する前の細胞（シングルセル）Ｃｓの通過は許容するが、凝集塊Ｃａｇｇの通過は許容しない細孔を有するものを選択する。
　これにより、培地で満たされた容器本体２内に、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、培養対象の細胞（シングルセル）Ｃｓを注入すると、細胞Ｃｓはフィルタ部材４を通過して、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに沈降していく（図７（ａ）参照）。そして、培養が進行すると、細胞Ｃｓは凝集塊Ｃａｇｇを形成し、フィルタ部材４を通過できなくなり、これによって、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに凝集塊Ｃａｇｇを留まらせた状態で、培養を進行させることができる（図７（ｂ）参照）。
　したがって、培養期間中に培地交換を行う際には、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、古い培地を排出するとともに、新しい培地を注入することにより（図７（ｃ）参照）、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに凝集塊Ｃａｇｇを留まらせたまま、培地交換を行うことができる。さらに、培養終了後には、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、洗浄液の注入、排出を繰り替えして行うことにより、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに凝集塊Ｃａｇｇを留まらせたまま、凝集塊Ｃａｇｇを洗浄することもできる。
　このように、本使用例にあっては、凝集塊Ｃａｇｇを形成する細胞Ｃｓを培養するにあたり、フィルタ部材４として、凝集塊Ｃａｇｇを形成する前の細胞Ｃｓの通過は許容するが、凝集塊Ｃａｇｇの通過は許容しない細孔を有するものを選択し、細胞Ｃｓを第一の槽１ｓｔに注入し、次いで、第二の槽２ｎｄに沈降させて、形成された凝集塊Ｃａｇｇを第二の槽２ｎｄに留まらせた状態で培養することで、培養期間中の培地交換や、培養終了後の洗浄などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
　そして、洗浄後は、容器本体２内に保存液などを注入することで、容器１を培養された細胞（凝集塊Ｃａｇｇ）の保管、搬送に利用することもできる。
　なお、特に図示しないが、前述した第一実施形態と同様に、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが注入出用ポート３ｂを備えるようにすれば、注入出用ポート３ｂから培養された細胞（凝集塊Ｃａｇｇ）を取り出すこともできる。
［第三実施形態］
　次に、本発明の第三実施形態について説明する。
　なお、図８は、本実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
　本実施形態の一例として図８に示す容器１は、容器本体２と注入出用ポート３ａとを備えている。そして、容器本体２の内部は、シート状のフィルタ部材４によって、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄとに区画されており、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔに、注入出用ポート３ａが備えられているとともに、容器本体２の底面２ｂには、複数の凹部５が設けられている
　図８に示す容器１は、容器本体２の底面２ｂに、複数の凹部５が設けられている点で、第二実施形態の一例として図６に示した容器１と異なっているが、その以外の構成は共通している。このような容器１は、第二実施形態の図６に示した容器１と同様にして製造することができ、底面側プラスチックフィルムを成形するに際して、金型などを適宜調整することで、凹部５を所望の形状、配列で成形することができる。
　容器本体２の底面２ｂに複数の凹部５を設けることで、培地中を沈降する細胞が、それぞれの凹部５の底部に集められ、細胞密度が高められた状態で、効率良く培養することができる。それぞれの凹部５の底部に集められた細胞が、容器本体２内を移動することなく、一つの凹部５に留まって、細胞密度が高められた状態が維持されるようにするために、凹部５は、その開口径（直径）が０．３～１０ｍｍであるのが好ましく、より好ましくは０．３～５ｍｍ、さらに好ましくは０．５～４ｍｍ、特に好ましくは０．５～２ｍｍであり、深さが０．１ｍｍ以上であるのが好ましい。
　また、図示する例では、凹部５を椀状に形成しているが、必要に応じて、円錐状、円錐台状などに形成することもできる。
　本実施形態が、前述した第二実施形態と異なるのは、容器本体２の底面２ｂに複数の凹部５を設けた点にあり、これ以外の構成は、前述した第二実施形態と共通するため、重複する説明は省略する。
　なお、第一及び第二実施形態と同様に、容器本体２の具体的な形態が限定されないことはいいうまでもない。
　次に、本実施形態の一例として図８に示す容器１の使用例について説明する。
［第三実施形態の使用例］
　図９は、図８に示す容器１を、凝集塊Ｃａｇｇを形成する細胞Ｃｓを培養するにあたり、細胞密度が高められた状態で効率良く培養するとともに、その培地交換などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる培養容器として細胞培養の用途に供する例を示している。
　本使用例では、凝集塊Ｃａｇｇを形成する細胞Ｃｓを培養対象とし、フィルタ部材４として、凝集塊Ｃａｇｇを形成する前の細胞（シングルセル）Ｃｓの通過は許容するが、凝集塊Ｃａｇｇの通過は許容しない細孔を有するものを選択する。
　これにより、培地で満たされた容器本体２内に、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、培養対象の細胞（シングルセル）Ｃｓを注入すると、細胞Ｃｓはフィルタ部材４を通過して、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに沈降していく。沈降した細胞Ｃｓは、それぞれの凹部５の底部に集められ、細胞密度が高められた状態で効率良く培養することができる。そして、培養が進行すると、細胞Ｃｓは凝集塊Ｃａｇｇを形成し、フィルタ部材４を通過できなくなり、これによって、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに凝集塊Ｃａｇｇを留まらせた状態で、培養を進行させることができる。
　したがって、培養期間中に培地交換を行う際には、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、古い培地を排出するとともに、新しい培地を注入することにより、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに凝集塊Ｃａｇｇを留まらせたまま、培地交換を行うことができる。このとき、特に図示しないが、例えば、底面２ｂの凹部５の周囲（隣接する凹部５の間に位置する面）にフィルタ部材４を接着するなどして、凹部５の開口部を覆うようにフィルタ部材４を容器本体２内に固定しておくのが好ましい。このようにすることで、凹部５の底部に集められた細胞（凝集塊Ｃａｇｇ）の移動を抑止して、より確実に一つの凹部５に留まらせておくことができる。さらに、培養終了後には、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、洗浄液の注入、排出を繰り替えして行うことにより、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに凝集塊Ｃａｇｇを留まらせたまま、凝集塊Ｃａｇｇを洗浄することができる。
　このように、本使用例にあっては、凝集塊Ｃａｇｇを形成する細胞Ｃｓを培養するにあたり、フィルタ部材４として、凝集塊Ｃａｇｇを形成する前の細胞Ｃｓの通過は許容するが、凝集塊Ｃａｇｇの通過は許容しない細孔を有するものを選択し、細胞Ｃｓを第一の槽１ｓｔに注入し、次いで、第二の槽２ｎｄに沈降させて、沈降した細胞Ｃｓを凹部５の底部に集めて、細胞密度が高められた状態で効率良く培養しつつ、形成された凝集塊Ｃａｇｇを第二の槽２ｎｄに留まらせた状態で培養することで、培養期間中の培地交換や、培養終了後の洗浄などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
　そして、洗浄後は、容器本体２内に保存液などを注入することで、容器１を培養された細胞（凝集塊Ｃａｇｇ）の保管、搬送に利用することもできる。
　なお、特に図示しないが、前述した第一実施形態と同様に、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが注入出用ポート３ｂを備えるようにすれば、注入出用ポート３ｂから培養された細胞（凝集塊Ｃａｇｇ）を取り出すこともできる。
［第四実施形態］
　次に、本発明の第四実施形態について説明する。
　なお、図１０は、本実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
　本実施形態の一例として図１０に示す容器１は、容器本体２と注入出用ポート３ａ，３ｂ，３ｃとを備えている。そして、容器本体２の内部は、二つのシート状のフィルタ部材４によって、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄと、これらの間に位置する第三の槽３ｒｄとに区画されている。
　また、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔには、その流入出口となる注入出用ポート３ａ（ＩＮ），３ａ（ＯＵＴ）が備えられており、これと同様に、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄには、その流入出口となる注入出用ポート３ｂ（ＩＮ），３ｂ（ＯＵＴ）が備えられている。さらに、第三の槽３ｒｄには、注入出用ポート３ｃが備えられている。
　図１０に示す容器１は、容器本体２の内部を三つの槽に区画し、それぞれの槽に注入出用ポートが備えられているとともに、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔに二つの注入出用ポート３ａ（ＩＮ），３ａ（ＯＵＴ）が備えられ、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに二つの注入出用ポート３ｂ（ＩＮ），３ｂ（ＯＵＴ）が備えられている点で、第一実施形態の一例として図１に示した容器１と異なっているが、その以外の構成は共通している。このような容器１は、例えば、次のようにして製造することができる。
　まず、二枚のプラスチックフィルムと二枚のシート状のフィルタ部材４とを用意し、これらを必要に応じて裁断して、その大きさを揃える。そして、一方のプラスチックフィルムを容器本体２の天面２ａ側となる天面側プラスチックフィルムとし、他方のプラスチックフィルムを容器本体２の底面２ｂ側となる底面側プラスチックフィルムとして、これらを真空成形、圧空成形などにより、その周辺部を残して台地状に膨出するように成形する。
　次に、成形された天面側プラスチックフィルムと底面側プラスチックフィルムとの間に、二枚のシート状のフィルタ部材４を挿入して、これらの周辺部を重ね合せる。そして、天面側プラスチックフィルムとフィルタ部材４との間に、その周辺部の所定の位置において、注入出用ポート３ａ（ＩＮ），３ａ（ＯＵＴ）を形成する管状の部材を挟み込み、底面側プラスチックフィルムとフィルタ部材４との間に、その周辺部の所定の位置において、注入出用ポート３ｂ（ＩＮ），３ｂ（ＯＵＴ）を形成する管状の部材を挟み込み、二枚のシート状のフィルタ部材４の間に、その周辺部の所定の位置において、注入出用ポート３ｃを形成する管状の部材を挟み込み、その状態で周辺部を熱融着によりシールし、必要に応じて周辺部をトリミングする。これにより、図１０に示す容器１が製造される。
　本実施形態が、前述した第一実施形態と異なるのは、容器本体２の内部が三つの槽に区画され、それぞれの槽が注入出用ポートを備えるとともに、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが二つの注入出用ポート３ａ（ＩＮ），３ａ（ＯＵＴ）を備え、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが二つの注入出用ポート３ｂ（ＩＮ），３ｂ（ＯＵＴ）を備えている点にあり、これ以外の構成は、前述した第一実施形態と共通するため、重複する説明は省略する。
　なお、第一、第二、及び第三実施形態と同様に、容器本体２の具体的な形態が限定されないことはいうまでもない。
　次に、本実施形態の一例として図１０に示す容器１の使用例について説明する。
［第四実施形態の使用例］
　図１１は、図１０に示す容器１を、培養対象の細胞Ｃが、生体内で成長、増殖、分化する環境を再現する操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる培養容器として細胞培養の用途に供する例を示している。
　本使用例では、第三の槽３ｒｄが備える注入出用ポート３ｃから培養対象の細胞Ｃを注入して培養を行うが、その際、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄとのそれぞれには、成分組成の異なる培地を流通させる。より詳しくは、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａ（ＩＮ）と、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂ（ＩＮ）のそれぞれから流入した成分組成の異なる培地が、第三の槽３ｒｄで混ざり合いながら、それぞれの注入出用ポート３ａ（ＯＵＴ），３ｂ（ＯＵＴ）から流出するようにする。
　このとき、培養対象の細胞Ｃの大きさを考慮して、フィルタ部材４として、かかる細胞Ｃの通過を許容しない細孔を有するものを選択する。そして、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄのそれぞれに流通させる培地は、細胞の成長、増殖、分化を制御する種々の細胞外基質や、細胞に刺激を与える種々のシグナル物質などを含み、これらが第三の槽３ｒｄで混ざり合ったときに、その濃度勾配や到達方向などが生体内の環境と同等となるように、成分組成や流量・流速などが調整される。これにより、第三の槽３ｒｄに生体内の環境を再現しつつ、細胞Ｃを第三の槽３ｒｄに留まらせた状態で培養を行うことができる。
　このように、本使用例にあっては、フィルタ部材４として、培養対象の細胞Ｃの通過を許容しない細孔を有するものを選択し、第一の槽１ｓｔと第二の槽２ｎｄとのそれぞれに、成分組成の異なる培地を流通させながら、第三の槽３ｒｄに細胞Ｃを注入して培養を行うことで、培養対象の細胞Ｃが、生体内で成長、増殖、分化する環境を再現する操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
［第五実施形態］
　次に、本発明の第五実施形態について説明する。
　なお、図１２は、本実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
　従来、細胞培養に際しては、ウェルプレートが広く用いられている。例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から、神経幹細胞や、心筋、膵臓、肝臓、軟骨などへの分化誘導の際には、ウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）に細胞を播種し、ウェル内で凝集塊を形成させて分化誘導を進めるという方法が採られるのが一般的である。
　しかしながら、ウェルプレートを用いて細胞を培養するに際しては、それぞれのウェルに対して培地交換を行わなければならない。このため、培養中の細胞が混入しないように気をつけながら古い培地をピペットで吸い上げて排出し、次いで、新しい培地をピペットで注入するというように、煩雑なピペット操作をウェルの数だけ何回も繰り返す必要がある。
　本実施形態は、ウェルプレートのように、複数の細胞培養部を有する容器を用いて細胞を培養するに際し、培地交換などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができるようにするためのものである。
　本実施形態の一例として図１２に示す容器１は、細胞培養部となる複数の凹部６を有する容器本体２を備えており、それぞれの凹部６の開口部が、シート状のフィルタ部材４によって覆われている。それぞれの凹部６の開口部を覆うフィルタ部材４は、凹部６の周囲（隣接する凹部６の開口部の間に位置する面）に密着するように、容器本体２に取り付ける。好ましくは、容器本体２に剥離可能に接着する。
　本実施形態において、容器本体２は、細胞や培地などを、それぞれの凹部６に培養に支障なく収容できれば、その具体的な形態は限定されないが、容器本体２には、その周りを取り囲むようにして立ち上る側壁部７を設けておくのが好ましい。
　また、フィルタ部材４については、前述した第一実施形態で説明した通りである。本実施形態では、凝集塊を形成する細胞を培養対象とし、フィルタ部材４として、凝集塊の通過は許容しない細孔を有するものを選択する。
　このような容器１を用いて培養対象の細胞を培養するには、細胞培養部となるそれぞれの凹部６に、培養対象の細胞を培地とともに注入して培養を開始する。そして、培養が進行するにつれて、凹部６に注入された細胞は凝集塊を形成する。
　培養が進行して培地を交換する時期になったら、それぞれの凹部６から古い培地を排出する。このとき、それぞれの凹部６の開口部を覆うフィルタ部材４は、凝集塊の通過を許容しないので、培地交換を行うに際しては、容器１を傾けるだけで古い培地のみを流出させることができ、ピペット操作を伴わずに、それぞれの凹部６から古い培地を排出することができる。
　また、容器本体２に、その周りを取り囲むようにして立ち上る側壁部７を設けておけば、側壁部７の内側に新しい培地を注ぐだけで、それぞれの凹部６に新しい培地が流入していくようにすることができる。このようにすることで、ピペット操作を伴わずに、それぞれの凹部６に新しい培地を注入することができる。
　そして、培養終了後には、フィルタ部材４を容器本体２から取り外して、凹部６の開口部を開放することで、凝集塊を崩さずに取り出すことが可能となる。
　なお、培養終了後には、培地交換を行うのと同様にして、それぞれの凹部６に洗浄液を注入、排出させることで、凝集塊を洗浄することもできる。
　このように、本実施形態によれば、凝集塊を形成する細胞を培養するに際し、その培養期間中の培地交換などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
　以上、本発明について、好ましい実施形態を示して説明したが、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることはいうまでもない。
　本発明によれば、細胞培養、特に、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の継代、及びそれら幹細胞から、神経幹細胞や、心筋、膵臓、肝臓、軟骨などへの分化誘導の過程で形成させるスフェア（凝集塊）培養に際して行われる種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。また、リンパ球やハイブリドーマなどの抗体産生細胞、巨核球や赤血球等の浮遊細胞の培養に関しても、種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
　この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先権の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。
　本発明は、医薬学・生化学分野において、細胞を効率良く培養する技術として利用できる。
　１　　　　　容器（細胞培養用容器）
　２　　　　　容器本体
　２ａ　　　　　天面
　２ｂ　　　　　底面
　３ａ，３ｂ，３ｃ　　　　　注入出用ポート
　４　　　　　フィルタ部材
　５　　　　　凹部
　６　　　　　凹部
　７　　　　　側壁部
　１ｓｔ　　　　　第一の槽
　２ｎｄ　　　　　第二の槽
　３ｒｄ　　　　　第三の槽

Claims (14)

  1. 　細胞培養の用途に供される細胞培養用容器であって、
    　容器本体と注入出用ポートとを備え、
    　前記容器本体の内部が、少なくとも一つのフィルタ部材によって複数の槽に区画されていることを特徴とする細胞培養用容器。
  2. 　前記容器本体の内部が、前記容器本体の天面側の第一の槽と、前記容器本体の底面側の第二の槽とに区画され、
    　前記天面側の第一の槽と前記底面側の第二の槽の少なくとも一方に、前記注入出用ポートを少なくとも一つ備える請求項１に記載の細胞培養用容器。
  3. 　前記容器本体の底面に、複数の凹部が設けられた請求項１又は２に記載の細胞培養用容器。
  4. 　前記容器本体の内部が、前記容器本体の天面側の第一の槽と、前記容器本体の底面側の第二の槽と、前記天面側の第一の槽と前記底面側の第二の槽との間に位置する第三の槽とに区画され、
    　前記天面側の第一の槽と前記底面側の第二の槽に、前記注入出用ポートを少なくとも二つ備え、
    　前記第三の槽に、記注入出用ポートを少なくとも一つ備える請求項１に記載の細胞培養用容器。
  5. 　細胞培養の用途に供される細胞培養用容器であって、
    　細胞培養部となる複数の凹部を有する容器本体を備え、前記凹部のそれぞれの開口部がフィルタ部材によって覆われていることを特徴とする細胞培養用容器。
  6. 　前記容器本体に、前記容器本体の周りを取り囲んで立ち上る側壁部が設けられている請求項５に記載の細胞培養用容器。
  7. 　前記フィルタ部材が、合成樹脂繊維を編んだメッシュシートである請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞培養用容器。
  8. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞培養用容器を用いて培地交換しながら細胞を培養する当該容器の使用方法であって、
    　前記フィルタ部材として、培養対象の細胞の通過を許容しない細孔を有するフィルタ部材を選択し、
    　前記フィルタ部材によって区画された一方の槽に、前記細胞を注入して培養を行い、
    　前記フィルタ部材によって区画された他方の槽が備える前記注入出用ポートから、培地を注入出して培地交換を行うことを特徴とする細胞培養用容器の使用方法。
  9. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞培養用容器を用いて細胞の洗浄を行う当該容器の使用方法であって、
    　前記フィルタ部材として、培養対象の細胞の通過を許容しない細孔を有するフィルタ部材を選択し、
    　前記フィルタ部材によって区画された一方の槽に、前記細胞を注入して培養を行い、
    　前記フィルタ部材によって区画された他方の槽が備える前記注入出用ポートから、洗浄液を注入出して培養された細胞の洗浄を行うことを特徴とする細胞培養用容器の使用方法。
  10. 　請求項１又は２に記載の細胞培養用容器を用いて細胞の凝集塊を分割する当該容器の使用方法であって、
    　前記フィルタ部材として、細胞の凝集塊を分割したい大きさに応じた細孔を有するフィルタ部材を選択し、
    　前記フィルタ部材によって区画された一方の槽に、前記凝集塊を培地とともに圧送して前記凝集塊を分割することを特徴とする細胞培養用容器の使用方法。
  11. 　請求項１又は２に記載の細胞培養用容器を用いて混在する大きさの異なる細胞を分離する当該容器の使用方法であって、
    　前記フィルタ部材として、混在する細胞のうち少なくとも一の細胞の通過を許容するが、それ以外の細胞の通過を許容しない細孔を有するフィルタ部材を選択し、
    　前記フィルタ部材によって区画された一方の槽に、混在する大きさの異なる細胞を注入して、
    　前記フィルタ部材によって区画された他方の槽から、前記フィルタ部材を通過した細胞を取り出すことを特徴とする細胞培養用容器の使用方法。
  12. 　請求項１又は２に記載の細胞培養用容器を用いて異なる種類の細胞を共培養する当該容器の使用方法であって、
    　前記フィルタ部材として、共培養されるいずれの細胞も通過を許容しない細孔を有するフィルタ部材を選択し、
    　前記フィルタ部材によって区画されたそれぞれの槽に、前記細胞を種類ごとに別々に注入して共培養することを特徴とする細胞培養用容器の使用方法。
  13. 　請求項２又は３に記載の細胞培養用容器を用いて凝集塊を形成する細胞を培養する当該容器の使用方法であって、
    　前記フィルタ部材として、凝集塊を形成する前の細胞の通過は許容するが、凝集塊の通過は許容しない細孔を有するフィルタ部材を選択し、
    　前記細胞を、前記第一の槽に注入し、次いで、前記第二の槽に沈降させて、形成された凝集塊を前記第二の槽に留まらせた状態で培養することを特徴とする細胞培養用容器の使用方法。
  14. 　請求項４に記載の細胞培養用容器を用いて細胞を培養する当該容器の使用方法であって、
    　前記フィルタ部材として、培養対象の細胞の通過を許容しない細孔を有するフィルタ部材を選択し、
    　前記第一の槽と前記第二の槽とのそれぞれに、成分組成の異なる培地を流通させながら、前記第三の槽に前記細胞を注入して培養を行うことを特徴とする細胞培養用容器の使用方法。
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