JP5088756B2 - 細胞培養において気泡の形成を減少させるための装置および方法 - Google Patents

Description

関連出願の説明

本出願は、ここに引用する「細胞培養において気泡の形成を減少させるための装置および方法」と題する、２００７年２月２６日に出願された米国特許出願第１１／７１０８１５号の恩恵を主張する。

本発明は、一般に、細胞培養における気泡(bubbles)や泡(foam)の形成を減少させるための装置に関し、より詳しくは、培地と空気との混合を最小にするように細胞培地を細胞培養容器に向け、それによって、細胞培養容器内部の気泡や泡の形成を最小にするための装置に関する。

細胞の生体外(in vitro)培養により、薬物学、生理学および毒物学における研究に必要な材料が提供される。薬物スクリーニング技法における最近の進歩により、製薬会社は、治療標的に対する膨大な化合物を迅速にスクリーニングすることができる。これらの大規模スクリーニング技法では、生体外で増殖され維持された多数の細胞を必要とする。これらの多数の細胞を維持するには、大容積の細胞培地および試薬並びに多数かつ多種類の研究室用細胞培養容器および実験装置が必要である。この活動は、労働集約的でもある。

細胞は、ローラーボトル、細胞培養皿およびプレート、マルチウェルプレート、マイクロタイタプレート、通常のフラスコおよび多層細胞増殖フラスコおよび容器を含む専用の細胞培養容器内で増殖させられる。細胞の培養に適切な環境を形成するための例示のフラスコは、普通の実験フラスコである。培養中の細胞は、適切な維持培地中に浸されたフラスコ底面に付着し、増殖する。

細胞系のハイスループット用途の出現により、細胞増殖のための表面積が増加し、かつ必要な気体交換を提供する細胞培養容器が開発されてきた。これらのシステムでは、普通のフラスコ、ローラーボトル、細胞培養皿を含む従来の細胞培養容器、並びに多層フラスコ、多層細胞培養皿、バイオリアクタなどを含む多層細胞増殖容器も用いられ、これらの容器は、増殖密度および分化要因を含む細胞培養パラメータを向上させるように設計された専用の表面を備えていることもある。

その上、細胞系のハイスループット用途は自動化されてきた。自動化により、手動操作により行われたように、細胞培養容器の操作が可能になる。さらに、細胞増殖の多数の層を有するフラスコ容器は、１つの底壁上で細胞の増殖を可能にする一般に知られているフラスコよりも、細胞収量を多く生成できる。これらの多層容器により、多数の細胞を増殖させられるが、それらの容器には、毎日の使用において特別な課題がある。

ある高密度細胞培養容器において、フラスコまたは容器内の各細胞培養層は、細胞および細胞培地の流れを容器に向けるための多数のポートを有する。細胞および細胞培地の流れをこれらの高密度容器に出し入れするように向けるためのこれらのシステムでは、細胞培地および空気が混ざり、気泡や泡を発生させる位置が生じてしまう。

これらの容器中に細胞増殖に必要な量より多く細胞培地を導入することが、これらの容器内部の泡の形成を減少させる方法の１つである。しかしながら、細胞増殖培地は極めて高くつくことがあり、過剰の細胞増殖培地を使用することは望ましくない。

培地を細胞培養容器中に、容器内の気泡や泡の形成を減少させるような様式で向けるための装置を提供できる細胞培養容器が必要とされている。そのような装置を備えた高密度細胞培養容器も必要とされている。気泡の形成を減少させ、細胞培養容器を適切に機能させるのに必要な細胞培地の量を減少させる、高密度細胞培養容器が必要とされている。その上、通常ロボット式操作を用いるハイスループット・アッセイ用途の動作に使用するのに適したそのような装置が必要とされている。

本発明の実施の形態によれば、細胞培養における気泡および泡を減少させるための装置および方法が開示される。特に、培地の空気との混合を最小にし、それによって、多層細胞培養容器内の気泡や泡の形成を最小にするように細胞培地を多層細胞培養容器に向けるためのマニホールドを有する装置が開示されている。この装置を使用する方法も開示される。

本発明のある実施の形態によれば、マニホールドが開示される。このマニホールドは、細胞培養容器を通る液体の流入および気体の流出を方向付け、分離する。ある実施の形態において、マニホールドは、首／肩構造を形成するように肩構造に取り付けられた首付き開口部を有し、ここで、首／肩構造はバリヤプレートに取り付けられ、首／肩構造は、バリヤプレートを貫通する孔である開口（貫通孔）を包含し、これらの孔は、マニホールドの首に導入される液体を、首／肩構造の片側を通り、開口を通って細胞培養容器中に流動させる一方で、液体の流入により置き換えられる空気を、開口を通って、首／肩構造の反対側のバリヤプレートを通り、首／肩構造を通り、首付き開口部を通って出すことによって、細胞培養容器から逃すことができる。

その上、本発明の細胞増殖装置を使用して細胞を培養する方法は、本発明の細胞増殖装置を提供し、細胞増殖装置中に細胞および／または培地を傾いた充填位置で導入し、内容積を満たし、開口部を閉じ、この装置を水平の細胞増殖位置に位置付けるまたは傾け、次いで、装置を培養する各工程を有してなる。

別の実施の形態において、細胞培養容器を通る液体の流入および気体の流出を方向付けるためのマニホールドが開示される。このマニホールドは、開口部と内面を備えた首付き開口部、流入肩部と流出肩部、および細胞培養容器に取り付けられるように構築され配置されたバリヤプレートを有する。この流入肩部と流出肩部は、バリヤプレートおよび首に取り付けられ、流入肩部と流出肩部の各々は内面を有する。首の内面は、流入肩部と流出肩部の内面に隣接し、それと連続している。流入肩部と流出肩部の各々は、首付き開口部中に導入される液体が、首付き開口部を通って流入肩部に入り、流入開口を通って細胞培養容器中に流入し、細胞培養容器中に入る液体により置き換えられる気体が、流出肩部の開口を通って細胞培養容器から、流出肩部に出て、首付き開口部を通って排出されるように、バリヤプレートを通る少なくとも１つの開口を有する。

ある実施の形態において、マニホールドは、細胞培養容器と一体になっており、または別の実施の形態において、マニホールドは、細胞培養容器に取外し可能に取り付けられる。もしくは、別の実施の形態において、マニホールドは、超音波溶接、レーザ溶接、溶剤結合または接着剤の塗布によって、細胞培養容器に取り付けられる。別の実施の形態において、流入肩部および流出肩部は、超音波溶接、レーザ溶接、溶剤結合または接着剤の塗布によって、バリヤプレートに取り付けられる。ある実施の形態において、細胞培養容器は、フラスコまたは多層フラスコである。別の実施の形態において、肩開口部は、多層フラスコ内の細胞培地用空間と整合するように構築され配置される。

さらに別の実施の形態において、本発明は、１つの細胞培養容器に取り付けられるように構築され配置されたマニホールドを有する細胞培養容器内の気泡の形成を減少させるための装置である。この細胞培養容器は、培養中の細胞を収容するように構築され配置された内部空間を有する。このマニホールドは、バリヤプレート、首、第１の肩部および第２の肩部を有する。第１の肩部および第２の肩部は、内面を有する。首は、頂部開口、内面および隔壁を有する。この隔壁は、首の内面と連続しており、首を、各々が内面を有する２つの液体不透過性首部分に分割する。各首部分の内面は、隣接する肩部の内面と連続している。両方の肩部はバリヤプレートに連結されており、各肩部は、細胞培養容器の内部空間へとバリヤプレートを通る少なくとも１つの開口を有する。液体が、頂部開口部を通って首に導入されるときに、液体は、１つの首部分を通って隣接する肩部に流入し、少なくとも１つの開口を通って細胞培養容器の内部空間に流入する。

さらなる実施の形態において、多層細胞培養容器は、液体の流入および気体の流出を細胞培養容器を通るように方向付けるためのマニホールドを有し、ここで、マニホールドは、バリヤプレート、流入肩部、流出肩部および首を有し、流入肩部と流出肩部は内面を有している。首は、頂部開口部、内面および首の内面と連続した隔壁を有し、この隔壁は、首を２つの液体不透過性首部分、液体流入首部分および気体流出首部分を有し、各首部分は内面を有している。液体流入首部分の内面は、流入肩部の内面に隣接し、それと連続しており、気体流出首部分の内面は、流出肩部の内面に隣接し、それと連続している。流入肩部と流出肩部は、バリヤプレートに連結されている。各肩部は、多層細胞培養容器の内部空間へバリヤプレートを通る少なくとも１つの肩開口部を有し、この少なくとも１つの肩開口部は、多層細胞培養容器内の少なくとも１つの細胞培地収容空間と整合されている。

ある実施の形態において、液体が頂部開口部を通して液体流入首部分中に導入されたときに、液体は、液体流入首部分を通って隣接する流入肩部中に、少なくとも１つの肩開口部を通って、多層細胞培養容器の細胞培地収容空間中に流入し、多層細胞培養容器の細胞培地収容空間に入る液体により置き換えられた気体が、少なくとも１つの肩開口部を通って流出肩部へと、気体流出首部分を通って、多層細胞培養容器から流出する。

本発明は、添付の図面と共に読んだときに、以下の詳細な説明から最もよく理解される。様々な特徴部分は、必ずしも一定の比率で描かれていないことを強調しておく。実際に、それらの寸法は、議論を明白にするために、任意の増加または減少されているであろう。
本発明の多層フラスコおよびマニホールドのある実施の形態の外観を示す斜視図 本発明の多層フラスコおよびマニホールドのある実施の形態の部分切取斜視図 本発明のマニホールドのフラスコ表面のある実施の形態の斜視図 肩部および首構造が取り除かれた、本発明のマニホールドのある実施の形態の内面の斜視図 本発明のマニホールドの斜視図 本発明のある実施の形態の断面斜視図 液体の流入および気体の流出を示す本発明のある実施の形態の断面図 液体の流入および気体の流出を示す本発明のある実施の形態の断面図

以下の詳細な説明において、制限ではなく説明の目的で、本発明の完全な理解を与えるために、特定の詳細を開示した例示の実施の形態が述べられる。しかしながら、本発明は、ここに開示された特定の詳細から逸脱した他の実施の形態で実施してもよいことが当業者には明らかであろう。他の例において、本発明の説明を分かりにくくしないように、よく知られた方法および装置の詳細な説明は省かれている。

細胞培養は、次第に、培養器の空間を最小にし、かつ細胞培養増殖表面を最大にする、積み重ねられた省空間高密度容器内で増殖されてきた。細胞培養容器がますます効率的になり、それらの内部の空間がますます制限されるにつれて、これらの容器の実際的な使用は、少量の液体をこれらの容器に出し入れするように動かす必要性のために複雑になってきた。液体の細胞培養容器の出入りの移動に関する問題の１つは、細胞培養容器内の気泡や泡の生成である。タンパク質の豊富な培地が空気または気体と混合されると、気泡や泡が形成する傾向にある。これらの気泡は、特に、高密度の細胞培養容器の小さな領域から、除去するのが極めて難しいことがある。気泡は、細胞増殖を妨げ、細胞増殖を一貫性のないものにし、制御された実験環境にオペレータ・エラーを導入し得る。気泡や泡が細胞培養容器の小さな空間内に一旦存在したら、それらを除去することは、極めて難しくなり得る。しつこい気泡を除去する試みではなく、高価な高密度細胞培養容器を捨てる必要があるかもしれない。

あるマルチレベル細胞培養容器において、各細胞培養層に多数のポートが存在し、細胞および細胞培地が細胞培養環境に出入りする流れが可能になる。これらの小さな空間には細胞および液体培地が充填されるので、この環境から置き換えられる空気は、細胞培養環境を去らなければならない。置き換えられる空気が、流入する培地の通路を通って、密閉された細胞培養環境を去る場合、流入する液体培地が流出する空気と混ざり、気泡や泡が生じてしまう。

本発明のマニホールドの１つの実施の形態により使用できるフラスコ装置の外観斜視図が図１に示されている。フラスコ１００は、上板１１０、底部トレイ１２０、側壁１１２、および端壁１１４により画成された外側筐体１０１を備えている。図２の切取斜視図から明らかに分かるように、フラスコ１００内には、個々の細胞増殖チャンバ１１１が配置されている。個々の細胞増殖チャンバ１１１の各々は、一般に透明な底面１１３および一般に透明な上面１１５により画成される。面１１３および１１５は、側壁１１２および端壁１１４に沿って、筐体１０１に取り付けられる。各チャンバ１１１内の少なくとも１つの底面１１３が、気体透過性かつ液体不透過性材料であり、細胞増殖表面１１７を提供できることが好ましい。各上面１１５は、好ましくは剛性であり、一般に気体不透過性である、細胞増殖チャンバ１１１を支持する材料（好ましくは透明な）である。この実施の形態において、支持体１１９により、気体透過性膜１１３を、筐体１０１に漏れ防止シール様式でしっかりと取り付けることができる。気管(tracheal)空間１１８が各細胞増殖チャンバ１１１間に形成される。チャンバ１１１の対向する上面１１５は、細胞増殖チャンバ１１１に対する上部壁および気管空間１１８の底部を画成する。したがって、気管空間１１８は、第１の細胞増殖チャンバの気体透過性かつ液体不透過性表面１１３および第２の増殖チャンバ１１１の対向表面１１５を含む。支持体１１９は、一体の筐体１０１内の気管空間１１８と交互に増殖チャンバ１１１を形成するのに、表面１１３および１１５を一体に組み込む構造配置をさらに提供する。したがって、各細胞増殖チャンバ１１１は、垂直に連続した方向に気管空間１１８と交互になっている。細胞増殖チャンバ１１１への接近性は、筐体１０１内の首付き開口部１２１により達成される。

図１は、マニホールド１０４により細胞増殖チャンバ１１１に連結された首付き開口部１２１を有する本発明の実施の形態を示している。マニホールド１０４は、フラスコ含有物の操作のための入口である。マニホールド１０４は、肩部分１０５と連続した首付き開口部１２１を有する。首部分および肩部分は、首／肩部分である。首／肩部分は、細胞培養容器に取り付けられたバリヤプレート１０６に取り付けられ、細胞培養容器の端壁１１４を形成する。この実施の形態において、首付き開口部１２１は隔壁１２２を有する。首付き開口部は、蓋（図示せず）により覆われて差し支えなく、漏れのないようにフラスコに培地１２７を完全に充填できる。蓋はあってもなくてもよい。ある場合、蓋は、細胞培養システムの内部と外部の空間の間で気体の交換を可能にするフィルタを備えていてもよい。

本発明の１つの実施の形態において、個々の細胞増殖チャンバ１１１により、多数の細胞増殖チャンバ１１１がフラスコ１００の筐体１０１と一体であり、細胞の増殖ための培地を完全に充填できるように、気体透過性膜１１３上で細胞増殖できる。フラスコ１００を通る一連の気管空間１１８により、フラスコ内の個々の細胞増殖チャンバ１１１内の培地１２７中で、気体透過性表面１１３上で増殖している細胞１１７と、外部環境との間の気体連絡が提供される。気管空間１１８により、細胞増殖チャンバ１１１内に配置された培地の気体透過性表面１１３を通しての酸素投与が可能になる。さらに、気管空間１１８は、任意の空気間隙または空間の形態をとってもよく、液体が入ることはできない。その結果、気管空間１１８と交互に多数の増殖チャンバ１１１を有する剛性細胞培養装置であるフラスコ１００は、大容積の細胞１１７への等量の気体分布の利点を生じるように協働して構成される。

図２は、本発明の実施の形態の部分切取斜視図である。図２は、フラスコ１００の内部を形成する、気管空間１１８および個々の細胞増殖チャンバ１１１の交互の層を示している。個々の細胞増殖チャンバ１１１は、細胞培養容器の側壁および端壁に対して液体不透過性の様式で取り付けられた液体不透過性かつ気体透過性の膜１１３により画成される。細胞増殖培地１２７は、複数の膜１１３間に収容されており、細胞は、これらの膜１１３の液体表面上で増殖する。この実施の形態において、細胞増殖チャンバ１１１は、個々の細胞増殖チャンバ１１１を形成するように側壁１１２に液体不透過性の様式で取り付けられた二層の気体透過性膜により形成されてもよい。気管空間１１８は、気体透過性膜の間の層を形成し、気体透過性膜１１３が空気を細胞増殖培地１２７中に交換できるようにするエアポケットを形成する。この実施の形態において、気管空間は、個々の細胞増殖チャンバ１１１を形成する気体透過性膜１１３の層を分離し、支持する支持体１１９により支持される。本発明のマニホールドの実施の形態に適合する多層フラスコのこの実施の形態の利点は、この装置が１８０°回転されたときに、反対表面上で細胞を増殖させることのできる向上した能力である。それゆえ、この装置が回転されたときに、細胞は、代わりの気体透過性膜１１３上で培養することができる。この装置の中間に気体透過性膜だけが層状になっている場合、したがって、細胞増殖は、この気体透過性膜１１３の両面で可能になる。

気体透過性かつ液体不透過性の膜１１３は、当該技術分野で公知の１種類以上の膜から製造されてもよい。膜は、一般に、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリオレフィン、エチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ボルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）または適合するフルオロポリマー、シリコーンゴムまたはコポリマー、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）またはこれらの材料の組合せを含んでよい適切な材料から製造される。細胞増殖のための適合性および製造が許す限り、様々な高分子材料を利用してよい。公知の能力のために、ポリスチレンが、膜の好ましい材料（様々な厚さでも細胞増殖が可能であろうが、約０．００３インチ（約０．７５ｍｍ）の厚さ）であろう。それゆえ、膜は任意の厚さであってもよいが、約２５および２５０マイクロメートルの間が好ましく、約２５および１２５マイクロメートルの間が理想的である。

膜１１３により、個々の細胞増殖チャンバ１１１および気管空間１１８の間で気体の交換が自由に行われる。好ましい実施の形態は、製造、取扱い、および装置の操作にとってさらに耐久性である膜１１３を含んでよい。

図２は、ある実施の形態における、個々の細胞増殖チャンバ１１１を示している。図２に示された実施の形態の個々の細胞増殖チャンバ１１１の内部は、多層細胞培養容器の首付き開口部１２１と自由には連絡していない。バリヤプレート１０６は、多層フラスコの首付き開口部１２１から個々の細胞増殖チャンバ１１１の首側端部１２４を分離する。本発明の実施の形態の多層フラスコの首付き開口部１２１および本発明の実施の形態の個々の細胞増殖チャンバ１１１の間の連絡は、個々の細胞増殖チャンバ１１１の各端部での開口１０９を通して行われる。

気体透過性膜１１３は、以下に限られないが、接着または溶剤結合、ヒートシールまたは溶接、圧着、超音波容積、レーザ溶接、および／または部品間にシールを生成するために一般に用いられる任意の他の方法を含む多くの方法により、支持体１１９および側壁１１２に付着しも差し支えない。膜が、支持体１１９の面と同一平面でそこに融着され、よって、装置の内面の一体部分となるように、膜領域の周りに気密シールを形成するために、膜１１３の周囲にレーザ溶接することが好ましい。気体透過性膜１１３が一旦、側壁と端壁に接着されたら、上板１１０および底部トレイ１２０を接合してもよい。底部トレイ１２０および上板１１０は、射出成形してもよい。細胞培養容器１００内の細胞１１７の培養のための膜１１３の位置決めを容易にするために、様々なサイズと形状の支持体１１９を含めてもよい。

本発明の装置１００は、当業者によく知られた多数の許容される製造方法により製造されてもよい。ある方法の実施の形態において、装置１００は、一群の別々の射出成形された部品から組み立てられる。成形に適しており、実験製造に一般に用いられるどのようなポリマー（ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリル、またはポリエステルなど）を用いてもよいが、ポリスチレンが好ましい。必要ではないが、光学的透明さのために、２ｍｍ以下の厚さに維持することが都合よい。別々の部品は、以下に限られないが、接着または溶剤結合、ヒートシールまたは溶接、圧着、超音波溶接、レーザ溶接および／または装置の内面１２８の一体部分となるように、部品の間にシールを生成するのに一般に用いられる任意の他の方法を含む多数の方法により組み立ててもよい。上板１１０および底部トレイ１２０は、レーザ溶接などにより、整合し、接合してもよい。蓋が提供される場合、それは、ネジ蓋、スナップ嵌め蓋、隔壁を有する蓋、気孔を有する蓋、一体フィルタまたはガス交換のための他の素子を有する蓋もしくは当該技術分野で公知の任意の蓋であってもよい。ある実施の形態において、蓋は、端壁１１４上のマニホールド１０４を通じて装置１００の内容物へのアクセスを防ぐために、首付き開口部上に取外し可能に配置することができる。

ある実施の形態において、部品は、互いに保持され、継ぎ目に沿って接着、超音波溶接、またはレーザ溶接される。部分または完全自動化アセンブリシステムにおいて、レーザ溶接装置が用いられることが好ましい。上板およびトレイは、適切に整合されている間に、接合部の外周に沿って、レーザ溶接が行われる。

都合よくは、細胞の付着および増殖を向上させるために、膜層を含む装置１００の内面を、細胞増殖を可能にするように処理してもよい。その処理は、プラズマ放電、コロナ放電、ガスプラズマ放電、イオン衝撃、電離放射線、および高強度紫外線を含む、当該技術分野で公知の多数の方法により行ってよい。

代わりの実施の形態において、個々の細胞増殖チャンバは、片側に、側壁１１２に液体不透過性の様式で取り付けられた気体透過性膜１１３の層により、その反対側に、剛性層である上面により、結合され、個々の細胞増殖チャンバ１１１に、また全体としての多層フラスコにより剛性の要素を提供してもよい。例えば、個々の細胞増殖チャンバ１１１は、上側で剛性層１１５により、その縁で側部により、下側で気体透過性膜により、結合されている。この個々の細胞増殖チャンバ１１１は、別のそのような個々の細胞増殖チャンバ１１１の頂部に積み重ねることができ、ここで、ある個々の細胞増殖チャンバ１１１の剛性層１１５の上部が、隣接する個々の細胞増殖チャンバの気体透過性膜１１３の下にある気管空間を画成する支持構造を形成する。この実施の形態において、個々の細胞増殖チャンバは、より大きい多層細胞培養容器に組み立てることができる。これらの個々の層は、互いにスナップ嵌めしても、または当該技術分野で公知の任意の取付け方法を用いて互いに他の様式で取り付けても差し支えない。

本発明のフラスコの別の実施の形態において、個々の細胞増殖チャンバ１１１内の細胞増殖培地は混ざらない。何故ならば、個々の細胞増殖チャンバ１１１が互いから離れており、フラスコユニットの容易な組立と分解のためのモジュラユニットであって差し支えないからである。

図３は、本発明のマニホールド３０４のフラスコ表面３０３のある実施の形態の斜視図である。マニホールド３０４は図５に示されている。完全に組み立てられたときに、多層細胞培養容器の層は、マニホールド３０４のバリヤプレート３０６のフラスコ表面３０３に液体不透過性の様式で取り付けられ、細胞培養容器１００（図１を参照）の上板１１０、底部トレイ１２０および側壁１１２は、マニホールド３０４の上端３１０、底端３１１および側部３１２に液体不透過性の様式で取り付けられる。

図３は、マニホールドのフラスコ表面３０３を示しており、この表面は、多層細胞培養容器の端壁を形成し、開口３０９を有する。開口３０９は、細胞培養容器の首端部または端壁（１１４、図１参照）を形成し、または本発明のマニホールド３０４（図５参照）の底部層も形成するバリヤプレート３０６を通る孔である。本発明のある実施の形態において、培地および細胞が、バリヤプレート３０６を通る開口３０９を通してのみ、各層の細胞増殖チャンバ１１１（図２参照）に流入できる。マニホールド３０４のフラスコ表面が図３に示されており、バリヤプレートの上面（首および肩構造が取り除かれている）が図４に示されており、首および肩構造を有するマニホールドが図５に示されている。図３に示されているバリヤプレート３０６が、細胞培養容器の端壁に取り付けられているか、またはそれを形成している場合、開口３０９は、マニホールドの内部空間（図５参照）が開口３０９を通して個々の細胞増殖チャンバと繋がるように、層状の細胞増殖チャンバと整合されている。バリヤプレートが端壁を形成するので、細胞培養容器が組み立てられたときに、バリヤプレートは、各層状の細胞増殖チャンバの内容物が、開口３０９を除いて、その層状の細胞増殖チャンバへの流入とそこからの流出、および細胞培養容器の端部での首付き開口部への流入を防ぐ。液体の細胞培地は、これらの開口３０９を通ってのみ細胞培養容器に流入しそこから流出することができる。マニホールド３０４の底部層であり、細胞培養容器の端壁も形成するバリヤプレートは、液体の細胞培養容器中への流路、および置き換えられる空気の細胞培養容器から出る流路を形成する。

バリヤプレート３０６は、フラスコの端壁であって、この端壁を通る流入開口および流出開口を有し、細胞増殖チャンバの各層と整合されている端壁であってよい。もしくは、代わりの実施の形態において、バリヤプレート３０６は、開放端の多層細胞培養容器に取り付けられていてよく、ここで、バリヤプレートは、細胞培養容器の端部で流入開口および流出開口を形成するように、開放端の多層細胞培養容器に嵌合し、またはスナップ嵌めされ、液体および気体の流入と流出を所定の流動回路に制限するように機能する。ある実施の形態において、開放端の多層細胞培養容器は、個々の細胞培養ユニットを互いに積み重ね、次いで、図５に示すようなマニホールドを個々の開放端の細胞培養層の積層体に取り付けることによって、組み立ててもよい。もしくは、代わりの実施の形態において、バリヤプレートは、別個の部材ではなくてもよく、各々が流入開口および流出開口を有する、多数の別個の細胞増殖チャンバが、多数の層から形成された組立細胞培養容器を形成するように互いに積み重ねられたときに、形成されてもよく、ここで、首付き開口部を介しての個々の細胞増殖チャンバへの液体アクセスは、所定の流動回路に制限される。さらに別の代わりの実施の形態において、マニホールドは、ガスケットまたは圧縮嵌め（タッパーウェア（登録商標）のように）で細胞培養容器に取外し可能に取り付けてもよい。

図３は、本発明のマニホールド３０４のバリヤプレート３０６のフラスコ表面３０３が開口３０９を有することを示している。バリヤプレート３０６の片側またはその反対側の開口の一群は、一組の開口である。これらの開口３０９は、細胞培養容器の個々の細胞増殖チャンバと接合され、本発明の実施の形態の個々の細胞増殖チャンバ（１１１、図２を参照）に出入りする唯一のアクセスを形成する。細胞および細胞培地は、これらの開口を通じて、多層細胞培養容器に供給し、そこから取り出すことができる。動作において、一組の開口が流入開口として機能し、他の組の開口が流出開口として機能するが、これの組の開口は同一であってもよく、流入開口および流出開口の差は、単に、液体の容器への導入時での細胞培養容器の方向であってもよい。

本発明のマニホールド５０４の実施の形態が図５に示されている。マニホールド５０４は、細胞培養容器を通る液体の流入および気体の流出を方向付け、分離するように機能する。マニホールド５０４は、流入肩部５０５および流出肩部５０５に取り付けられたバリヤプレート５０６を有する。これらの肩部５０５は、首付き開口部５２１と連続している。肩部および首付き開口部は一緒になって、首／肩部分５０７を形成する。

図６は、本発明のある実施の形態の断面斜視図である。図６は、本発明のマニホールド６０４の実施の形態の首付き開口部６２１の内面６２２が、肩部６０５の内面６０７と連続していることを示している。ある実施の形態において、本発明のマニホールドは、取付具６１０により多層細胞培養容器に取り付けてもよい。これは、スナップフックなどの取外し可能な取付具であっても、または溶接継ぎ目などの永久的取付具であってもよい。肩／首部分（５０７、図５参照）は、別個の成形部品として形成され、継ぎ目に沿った接着、超音波溶接、またはレーザ溶接を含む任意の手段によって、バリヤプレート６０６に取り付けられてもよい。レーザ溶接装置が、部分または完全自動化アセンブリシステムに利用され、肩／首構造５０７およびバリヤプレート６０６が適切に整合されている間に、レーザ溶接が、接合部の外周に沿って行われることが好ましい。

図４は、肩／首構造（図５参照）が取り除かれた本発明のマニホールドの実施の形態の内面の斜視図である。図４はバリヤプレート４０６を示しており、このプレートは、バリヤプレート４０６を通る開口４０９を含み、本発明の実施の形態の多層細胞培養容器の個々の細胞増殖チャンバ（図１および２における１１１参照）へのアクセスを形成する。図４に示したように、本発明のマニホールドの実施の形態は、首付き開口部（図５参照）および細胞培養容器の個々の細胞増殖チャンバ（図１および２参照）へのアクセスの間にバリヤプレートを配置する。首付き開口部（図１の１２１、図５の５２１および図６の６２１）は、フラスコ１００（図１および５を参照）のための開口部を形成する。細胞培地および細胞をフラスコ中に導入し、首付き開口部１２１を通してフラスコから取り出してもよい。フラスコ１００の首付き開口部１２１は、フラスコの内容物が溢れるのを防ぐために、首付き開口部１２１に取外し可能に取り付けられる蓋（図示せず）により取外し可能であってよい。

図４は、本発明のある実施の形態が隔壁４２３を有してもよいことも示している。図５に示されるように、この実施の形態において、隔壁５２３は、首付き開口部の片側をこの首付き開口部のその反対側から分離し、また下にあるバリヤプレート５０６、内側にある隔壁５２３および上側５１５の肩部５０５およびマニホールド５０４の外縁５１６により境界が形成されるマニホールド内の内部空間も分離する液体不透過性バリヤである。図４は、隔壁の実施の形態を示している。隔壁は、マニホールドのバリヤプレートの一体部品として製造されてもよく、または継ぎ目に沿った接着、超音波溶接、またはレーザ溶接を含む任意の手段によって、首付き開口部およびバリヤプレートに取り付けられる別個の部材として製造されてもよい。

本発明のある実施の形態において、隔壁５２３が存在する場合、首付き開口部の内面は２つの内部空間に隔てられる。図７および８は隔壁５２３の位置を示している。首付き開口部５２１の内面５２２は、肩部の内面６０７に隣接し、連続しており、この肩部の内面は、肩部の内部空間７０７を画成している。肩部の内部空間７０７は、この肩部の内部空間７０７から個々の細胞増殖チャンバ１１１に通じる開口を収容している。図７は本発明の装置のある実施の形態の充填方法を示している。図７は、本発明の実施の形態中への細胞および細胞培地の流れを示している。液体培地および細胞は、首付き開口部５２１の「液体入口」側で本発明の実施の形態に流入する。液体培地および細胞は、隔壁５２３によって、本発明のフラスコの片側に向けられる。そにように向けられた液体培地および細胞は、肩部の内部空間７０７を通り、開口１０９を通り、個々の細胞増殖チャンバ１１１中に流入する。液体がフラスコ中に導入されるときに、細胞培養容器の向きに応じて、本発明の実施の形態のフラスコの片側にある首部の内部空間および肩部の内部空間は、液体の入口または空気の出口いずれかのコースを提供するであろう。すなわち、本発明のある実施の形態において、マニホールドのいずれかの肩部は、液体培地の本発明の装置中とそこからの流入と流出の向きに応じて、「流入肩部」または「流出肩部」であり得る。

このようにして細胞培地を細胞培養容器中に導入することによって、液体培地の導入の際に個々の細胞増殖層から置き換えられる空気または気体は、本発明のフラスコの実施の形態の外側に位置する開口を通して逃げ、この装置の首付き開口部５２１の「空気流出」側を通って細胞培養容器から出ることができる。このようにして細胞培地を細胞培養システムを通して方向付けることによって、細胞培地は、所定の流入経路を通って細胞培養容器に進入し、置き換えられた空気または気体が、進入する細胞培地および排出される空気または気体が同じ流れを通らないように所定の流出経路を通ってこの細胞培養システムから排出され、細胞培地が空気と混ざる機会が制限され、細胞培養容器内の気泡や泡の形成が制限される。

図８は、本発明の実施の形態を用いた方法を示す、本発明の実施の形態の断面図である。ある実施の形態において、本発明の装置は、本発明のフラスコから液体培地を除去するために使用される。液体培地および細胞は、首付き開口部５２１の「液体流出」側を通って、個々の細胞増殖チャンバから流出できる。空気は、本発明の装置の実施の形態中にこの装置の「空気流入」側を通って流入できる。液体培地および細胞は、隔壁５２３によって、流入する空気から隔てられる。このように方向付けられた液体培地および細胞は、個々の細胞増殖チャンバから、開口１０９を通り、肩部の内部空間７０７を通り、首付き開口部５１２から流出する。このように細胞培養システムから細胞培地を出すように向けることによって、細胞培地および空気は混ざらず、細胞培養容器内の気泡や泡の形成が減少する。

その上、本発明のある実施の形態において、バリヤプレートがマルチウェルプレート内の細胞培養の各層の端壁を形成するので、細胞培養の全ての層で共有されている細胞培地を収容する、首区域などの区域を完全に充填する必要はないであろう。したがって、多層細胞培養容器に関連して本発明のマニホールドの実施の形態を使用すると、利用する細胞培地が少なくなるであろう。

本発明のある実施の形態において、肩／首部分は、肩／首部分内の液体の流動を制御するように形成されていてよい。例えば、肩区域は、マニホールドの各端部で個々の細胞培養層に開いたままになっている開口を取り囲むように広がる前に、略管形状に形成されていてよい。

首付き開口部、流入肩部および流入開口の流入側、並びに首付き開口部、流出肩部および二組目の開口の流出側は、相互に交換可能であることが当業者には理解されよう。すなわち、細胞培養システム中に液体を導入する時間で細胞培養容器の向きに応じて、どの肩部およびどの組の開口が、第１の肩部および第１組の開口であっても差し支えなく、どの肩部およびどの組の開口が、第２の肩部および第２組の開口であっても差し支えない。代わりの実施の形態において、ある特徴構造により、このシステム内の液体の導入のため、もしくは空気または気体の排気のためのより好ましい通路を形成してもよい。例えば、ある実施の形態において、細胞培養システムの一方の側または他方の側に液体をより容易に導入できるようにするために、首付き開口部内に隔壁を形成しても、隔壁を方向付けてもよい。代わりの実施の形態において、隔壁は、細胞培養容器中に導入するために細胞培地を収容するのに用いられるピペットまたは他の器具の先端をよりよく収容するように湾曲していてもよい。もしくは、隔壁は、本発明のある実施の形態において、首付き開口部の流入側が首付き開口部の内容積の約４／５を構成する一方で、首付き開口部の容積の残りの１／５が流出側として働き、細胞培養容器の空気の流出する通路が形成されるように、首付き開口部内で中心から外れて配置されていてもよい。

細胞培養システム中への細胞培地の導入は、一方の肩部が上にあり、他方の肩部が下にあり、それによって、細胞培地を、第１組の開口を通して第１の肩部中に導入するのに重力を用い、細胞および細胞培地の細胞培養容器中への制御流動および気体または空気の個々の細胞増殖チャンバからの第２組の開口を通り、第２の肩部を通り、首付き開口部から流出する制御排出を補助するように、細胞培養フラスコを傾けることにより行ってもよい。

代わりの実施の形態において、隔壁は、本発明のマニホールドの首付き開口部内に存在してもいなくてもよい。隔壁が存在しない場合、細胞培養システムの片側への細胞培地の導入は、装置を傾け、細胞培地を、下側の肩部を通して個々の細胞増殖チャンバ中に向けるために重力を使用することにより行ってもよい。首付き開口部内の隔壁の形状および向きは、本発明の細胞培養システムの有用性を最適化するために様々であって差し支えなく、これらの変種が、開示された本発明の範囲内にあることが当業者には明らかであろう。

本発明のある実施の形態によるフラスコおよびマニホールド装置１００は、許容される細胞増殖法にしたがって利用される。細胞は、首付き開口部１２１を介して、開口１０９９を通して装置１００に導入される。細胞１１７と共に、培地１２７が、細胞が培地中に浸されるように導入される。細胞培地をここに記載したどのような議論も、細胞を含有する細胞培地を含むことが当業者には理解されるであろう。この装置は、細胞含有培地が細胞増殖表面１１３を覆うように配置される。気体透過性膜１１３は、気管空間１１８と協働して、細胞増殖表面１１３に均一な気体分布を提供するので、装置１００に、培地を完全に充填することができることが都合よい。このことにより、さらに、フラスコ内部と外部環境との間の気体の交換および流動が確実になる。次いで、この装置を恒温槽内に配置するが、多数の細胞培養が同時に行われるように類似の容器と共に積み重ねてもよい。この装置は、底部トレイ１２０が水平位置（または細胞培養用途に応じて垂直位置）をとるように配置される。

細胞増殖は、装置１００の一般に透明な内面と外面を通じて、顕微鏡または目視検査により、その時々にモニタしてもよい。外部筐体内に可変倍率を有する光学レンズを用いた場合、細胞増殖のより容易な可触性およびより大きい視認性が視覚化できる。光学レンズにより、個々の細胞増殖チャンバ内に異質気体または気泡が存在しないことが確認される。

その上、細胞増殖プロセス中、使い尽くされた培地を取り出し、新たな培地を注入する必要が生じるであろう。これは、フラスコを傾け、使い尽くされた培地を首付き開口部を通じてフラスコから注ぎ出すことにより行っても差し支えない。新たな培地は、上述したのと同じプロセスによって、同じフラスコ中に導入することができる。細胞が、一旦、収穫の準備ができたら、首付き開口部を通じて、トリプシンなどの化学添加剤を装置に加える。トリプシンには、細胞を装置の表面から開放する効果がある。次いで、細胞を、細胞含有培地をフラスコから注ぎ出すことによって、フラスコから取り出すことができる。

フラスコの実施の形態が図面に示されているが、本発明の指向性流動マニホールドは、当業者に公知のどのタイプの細胞培養容器に組み込んでも差し支えない。これらのよく知られた代わりの細胞培養容器としては、バイオリアクタ、ローラボトルおよび積層装置が挙げられる。

本発明の装置／容器の他の実施の形態は、連続して積み重ねられたフラスコの間に空間を与える隆起角部、支柱、棚部、隔離部(stand-offs)または任意の他の特徴構造を含んでもよい。異質の気体／気泡から離れた細胞の増殖を促進するために、任意のサイズまたは寸法を有する隔離部を、装置の外面に成形しても、任意の角度で一体成形してもよい。隔離部はさらに、積み重ねられた容器の横方向の安定性を確実にする。マニホールドはさらに、異質の気体または気泡を多数の気体収集区域内に捕捉するために、突出部の様々な配置を含めることもできる。

その上、本発明の細胞増殖装置を用いた細胞培養方法は、本発明の細胞増殖装置を提供し、細胞および／または培地を細胞増殖装置中に傾けた充填位置で導入し、内容積を充填し、開口を閉じ、装置を水平の細胞増殖位置に位置決めしまたは傾け、装置をインキュベートする各工程を有してなる。

この装置としては、液体および空気の内容積中へとそこからの、指向性流入および流出から恩恵を受ける、任意の一体構造、容器、デバイスまたはフラスコが挙げられる。本発明をこのように記載してきたが、本発明の開示の恩恵を受けた当業者により、本発明を様々な様式で変えてもよいことが明白である。そのような変更は、本発明の精神および範囲から逸脱したものとはみなされず、当業者にとって明白であろうそのような改変は、以下の特許請求の範囲およびその法的同等物の範囲内に含まれることが意図されている。

１００ フラスコまたは装置
１０６，３０６，５０６ バリヤプレート
１０９，３０９，４０９ 開口
１１０ 上板
１１１ 細胞増殖チャンバ
１１２ 側壁
１１３ 気体透過性膜または底面
１１４ 端壁
１１７ 細胞
１１８ 気管空間
１２０ 底部トレイ
１２１，５２１，６２１ 首付き開口部
１２２，４２３，５２３ 隔壁
１２７ 細胞培地
３０４，５０４，６０４ マニホールド

Claims (5)

1. 細胞培養容器を通して液体の流入および気体の流出を方向付けるためのマニホールドであって、
   開口および内面を有する首付き開口部、
   流入肩部と流出肩部、および
   細胞培養容器に取り付けられるように構成され配置されたバリヤプレート、
   を備え、
   前記流入肩部と流出肩部が、前記バリヤプレートおよび前記首に取り付けられ、
   前記流入肩部と流出肩部の各々が内面を有し、
   前記首の内面が、前記流入肩部および前記流出肩部の内面に隣接し、かつ連続しており、
   前記バリヤプレートが前記流入肩部および前記流出肩部のそれぞれに連通する貫通孔を有し、
   それによって、前記首付き開口部に導入される液体が、該首付き開口部を通って前記流入肩部に入り、該バリヤプレートの前記流入肩部側の前記貫通孔を通って前記細胞培養容器に流入し、かつ該細胞培養容器に進入する前記液体により置き換えられる気体が、該細胞培養容器から、前記流出肩部側の前記貫通孔を通って該流出肩部に至り、前記首付き開口部を通って流出することを特徴とするマニホールド。
2. 前記首付き開口部が、さらに該開口部を前記流入肩部側と前記流出肩部側とに分離する隔壁を備えることを特徴とする請求項１記載のマニホールド。
3. 前記マニホールドが前記細胞培養容器と一体になっていることを特徴とする請求項１または２記載のマニホールド。
4. 前記マニホールドが前記細胞培養容器に取外し可能に取り付けられることを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載のマニホールド。
5. 前記培養容器が多層フラスコであることを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載のマニホールド。

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