JP6169869B2

JP6169869B2 - 細胞培養容器

Info

Publication number: JP6169869B2
Application number: JP2013059700A
Authority: JP
Inventors: 聖真田中; 健一森井; 裕美河原; 弓削　類; 類弓削
Original assignee: Space Bio Laboratories Co Ltd
Current assignee: Space Bio Laboratories Co Ltd
Priority date: 2013-03-22
Filing date: 2013-03-22
Publication date: 2017-07-26
Anticipated expiration: 2033-03-22
Also published as: JP2014183752A; WO2014148507A1

Description

本発明は、体性幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の細胞を効率的に培養できる細胞培養容器に関する。

従来、体性幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の細胞を培養する場合には、滅菌された樹脂製の細胞培養容器が用いられる（例えば、特許文献１参照）。より具体的には、細胞の培養は、細胞培養容器に培養する細胞と共に液体の培地を充填し、この細胞及び培地が充填された細胞培養容器を所定の環境下に静置して行われる。

特開平１０−１７９１３７号公報

ところで、細胞は、多くの場合、細胞培養容器の内面に接着して増殖する。特許文献１で提案されたような細胞培養容器を用いて細胞を培養した場合、細胞は、細胞培養容器の底面に接着して増殖していく。
そして、増殖させた細胞を採取する場合には、まず、細胞培養容器にトリプシン等の細胞剥離剤を添加して細胞を細胞培養容器から剥離させる。次いで、細胞培養容器から剥離された細胞を培地と共にピペット等を用いて遠心分離用の容器（チューブ）に移した後、遠心分離を行って細胞を沈降させる。これにより、細胞が採取される。

このように、従来の手法では、培養した細胞を採取するために、ピペット等を用いて細胞を他の容器に移す手順が必要であった。また、細胞培養容器の底面によってしか細胞を増殖させられなかった。

従って、本発明は、より効率的に細胞を培養できる細胞培養容器を提供することを目的とする。

本発明は、一端側に開口部が形成された筒状の容器本体と、前記容器本体の開口部に着脱可能に取り付けられるキャップと、前記キャップに設けられ、液密性を有し、かつ、気体の流通を許容するガス透過領域と、前記容器本体の内部に配置され、表面に培養細胞が接着可能なフィルム体と、を備え、前記フィルム体は、該フィルム体の表面が前記容器本体の長手方向に沿うように配置される細胞培養容器に関する。

また、前記容器本体は、該容器本体の一端側に配置される円筒部と、前記円筒部の先端側に配置され、基端側から先端側に向かって縮径する縮径部と、を備えることが好ましい。

また、前記フィルム体は、所定間隔をあけて互いに平行に延びる複数の折線によりひだ状に折り畳まれると共に、該複数の折線が前記容器本体の長手方向に沿って配置されることが好ましい。

また、前記フィルム体は、筒状に丸めた状態で前記容器本体の内部に収容されることが好ましい。

また、前記複数の折線が、該細胞培養容器を遠心する際に重力がかかる方向と平行であることが好ましい。

また、隣り合って配置される２つの前記折線の間の長さは、前記円筒部の半径以下であることが好ましい。

また、前記フィルム体は、ポリエチレンテレフタレートフィルムにより構成されることが好ましい。

また、前記フィルム体の表面には、電荷処理が施されていることが好ましい。

本発明の細胞培養容器によれば、より効率的に細胞を培養できる。

本発明の第１実施形態に係る細胞培養容器を示す斜視図である。第１実施形態の細胞培養容器を示す正面図である。第１実施形態の細胞培養容器を示す分解斜視図である。図１のＡ−Ａ線断面図である。フィルム体を展開した状態を示す図である。図２のＢ−Ｂ線断面図である。第１実施形態の細胞培養容器により細胞を培養している状態を模式的に示す図である。第１実施形態の細胞培養容器により培養した細胞を集めている状態を模式的に示した図である。本発明の第２実施形態に係る細胞培養容器を示す斜視図である。第２実施形態の細胞培養容器を示す分解斜視図である。第２実施形態の細胞培養容器の断面図であり、図６に対応する図である。模擬微小重力装置を示す図である。細胞培養容器の変形例を示す分解斜視図である。細胞培養容器の他の変形例を示す断面図であり、図６に対応する図である。

以下、本発明の細胞培養容器の好ましい各実施形態について、図面を参照しながら説明する。
まず、第１実施形態に係る細胞培養容器につき、図１〜図６を参照しながら説明する。
第１実施形態の細胞培養容器１は、図１〜図３に示すように、容器本体１０と、この容器本体１０に着脱可能に取り付けられるキャップ２０と、容器本体１０の内部に収容されるフィルム体３０と、を備える。

容器本体１０は、図３及び図４に示すように、一端側に開口部１１が形成され、他端側が閉止された筒状に形成される。この容器本体１０は、円筒部１２と、縮径部１３と、を備える。
円筒部１２は、容器本体１０の一端側、即ち、開口部１１が形成された側に配置される。この円筒部１２の開口部１１側の端部近傍の外周面には、ねじ山１２１が形成される。
縮径部１３は、円筒部１２における開口部１１が形成された側と反対側（先端側）の端部に配置される。この縮径部１３は、基端側から先端側に向かって縮径した円錐形状に形成される。

以上の容器本体１０は、透明性を有する、合成樹脂、又はガラスにより構成される。容器本体１０の材質としては、上述の透明性、及び細胞の接着良好性の観点から、通常はポリスチレンにより構成されることが一般的であるが、遠心時の強度改善のため、ＰＰ（ポリプロピレン）、或いはＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）で構成されてもよい。
また、容器本体１０の内面には、細胞の接着性を向上させるために、プラズマ放電等の電荷処理が施されていることが好ましい。

容器本体１０は、遠心分離器に使用可能な遠心分離管と同様の形状及び大きさ（例えば、容量５０ｍｌの遠心分離管（コニカルチューブ）と同形同大）に形成される。

キャップ２０は、キャップ本体２１と、このキャップ本体２１に設けられたガス透過領域２２と、Ｏリング２３（図４参照）と、を備える。
キャップ本体２１は、容器本体１０の外周面に被嵌される筒状の被嵌部２１１と、この被嵌部２１１の一端側を塞ぐ端面部２１２と、を備える。被嵌部２１１の内面には、容器本体１０（円筒部１２）に形成されたねじ山１２１に対応する形状のねじ溝２１３が形成される。

ガス透過領域２２は、液密性を有し、かつ、気体の流通を許容する領域である。このガス透過領域２２は、キャップ本体２１の端面部２１２に設けられる。ガス透過領域２２は、端面部２１２に形成された複数の貫通孔２２１と、キャップ本体２１における端面部２１２の内面側に配置されたガス透過膜２２２と、により構成される。
ガス透過膜２２２は、液体を通さずに、二酸化炭素や酸素等の気体の流通を許容する。ガス透過膜２２２としては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレン、シリコーン樹脂、ポリ４−メチルペンテン−１、ポリイソプレン、ポリブタジエン、エチレン酢酸ビニル共重合体及びポリスチレン等のフィルムを、厚さ１００μｍ程度の膜状に構成したものが挙げられる。

Ｏリング２３は、キャップ本体２１の内面側に配置される。このＯリング２３は、容器本体１０にキャップ２０を取り付けた場合に、キャップ２０と容器本体１０との間の液密性を維持する。

フィルム体３０は、ポリエチレンテレフタレートフィルム（以下、ＰＥＴフィルムともいう）により構成される。第１実施形態では、フィルム体３０は、図５に示すように、矩形形状のＰＥＴフィルムが、所定間隔をあけて互いに平行に形成された複数の折線３１において交互に折り返されて、ひだ状に折り畳まれて構成されている。そして、折り畳まれたフィルム体３０は、図１及び図３に示すように、折線３１が容器本体１０の長手方向に沿うように容器本体１０の内部に収容される。即ち、フィルム体３０の表面は、容器本体１０の長手方向に沿うように配置される。

フィルム体３０の表面（両面）には、細胞の接着性を向上させるために、プラズマ放電等の電荷処理が施されていることが好ましい。このフィルム体３０の表面の電荷処理は、折線３１が形成される前の状態のＰＥＴフィルムに施される。これにより、フィルム体３０への電荷処理を容易かつ均一に施せる。
フィルム体３０の厚さは、折り畳み性を良好に保つ観点から、好ましくは３０μｍ〜１５０μｍ、より好ましくは５０μｍ〜１００μｍである。
また、電荷処理を施したフィルム体３０の表面における水の接触角は、細胞の接着性を向上させる観点から、室温（２５℃）において、５０度〜７０度であることが好ましい。

以上の細胞培養容器１は、以下のようにして用いられる。
まず、滅菌された状態の細胞培養容器１のキャップ２０を取り外し、フィルム体３０が収容された容器本体１０に液体培地を充填し、次いで、細胞を播種する。その後、液体培地が充填され、細胞が播種された容器本体１０にキャップ２０を取り付ける。
次いで、細胞培養容器１を、図７に示すように、フィルム体３０の表面の少なくとも一部が水平方向にほぼ沿うように容器本体１０を寝かせた状態でインキュベータに収容して細胞を培養する。
これにより、寝かせた状態の容器本体１０の下部に位置する内面及びフィルム体３０に細胞が接着し、増殖する。

尚、細胞培養容器１により培養される細胞としては、体性幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、間葉系幹細胞、神経幹細胞、血管内皮幹細胞、造血系幹細胞、肝幹細胞等の幹細胞の他に、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、心筋細胞、神経細胞、腱細胞、脂肪細胞、膵細胞、肝細胞、腎細胞、毛母細胞、血球細胞等の分化した細胞又はその前駆細胞が挙げられる。

また、液体培地としては、通常、細胞培養に用いられるようなものを、特に制限なく用いることができる。具体的には、アルファα−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ基本培地等が挙げられる。

尚、これらの液体培地には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖等の化学成分に加えて、細胞増殖効果を高めるため、血清や細胞増殖因子（サイトカイン）のような生体成分を含有させてもよい。ただし、血清や細胞増殖因子等の生体成分を加えることにより、ＢＳＥ等に感染する可能性や、細胞が癌化する可能性があるため、これらの生体成分を用いないことが好ましい。

次に、培養して増殖させた細胞を回収する手順につき説明する。
培養した細胞を回収する場合には、まず、細胞培養容器１に充填された液体培地を除去し、その後、容器本体１０にトリプシン等の細胞剥離剤を添加して、容器本体１０及びフィルム体３０に接着した細胞を剥離させる。次いで、細胞培養容器１を、そのまま遠心分離器に設置して遠心分離（例えば、１０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ）を行う。

これにより、剥離された細胞は、図８に示すように、容器本体１０の縮径部１３に集められる。ここで、第１実施形態では、フィルム体３０の表面が容器本体１０の長手方向に沿うように配置されている。これにより、遠心分離を行う場合において、フィルム体３０の表面を遠心分離による分離方向に沿わせられるので、培養した細胞を容易に分離して筒状の容器本体１０の縮径部１３に集められる。また、ひだ状に折り畳まれたフィルム体３０は、縮径部１３により下方への移動が制限される。これにより、フィルム体３０が容器本体１０の先端側に移動することを防ぎつつ、細胞を縮径部１３に集められる。

以上説明した第１実施形態の細胞培養容器１によれば、以下のような効果を奏する。

（１）容器本体１０を筒状に構成し、この容器本体１０の内部にフィルム体３０を配置した。これにより、細胞培養容器１を、フィルム体３０の表面の少なくとも一部が水平方向に沿うように容器本体１０を寝かせた状態で使用することで、容器本体１０の内面に加え、フィルム体３０の表面にも細胞を接着させられる。また、培養した細胞を回収する場合には、容器本体１０及びフィルム体３０の表面で培養した細胞を剥離させた後、この細胞培養容器１を遠心分離する。そこで、容器本体１０の内部にフィルム体３０を、このフィルム体３０の表面が容器本体１０の長手方向に沿うように配置した。これにより、遠心分離を行う場合において、フィルム体３０の表面を遠心分離による分離方向（重力がかかる方向）に沿わせられるので、培養した細胞を容易に分離して筒状の容器本体１０の底部に集められる。よって、細胞が接着できる領域の面積を増加させられ、かつ、培養した細胞を容易に集められるので、細胞培養の効率をより向上させられる。また、培養した細胞を別の容器に移すことなく回収できるので、細胞回収時にコンタミネーションを起こしにくくできる。

（２）容器本体１０を、円筒部１２と縮径部１３とを含んで構成した。これにより、細胞を培養した後の細胞培養容器１を遠心分離した場合に、フィルム体３０が容器本体１０の先端側に移動することを防ぎつつ、細胞を縮径部１３に集められる。よって、遠心分離した細胞を回収しやすくできるので、細胞培養容器１を用いた細胞培養の効率をより向上させられる。

（３）フィルム体３０を、複数の折線３１においてひだ状に折り畳むと共に、この折線３１が容器本体１０の長手方向に沿うように容器本体１０に収容した。これにより、容器本体１０に収容するフィルム体３０の表面積を増加させられるので、細胞が接着できる領域の面積をより増加させられる。また、折線３１を容器本体１０の長手方向に沿うように配置したので、遠心分離を行った場合における細胞の分離性をより高められる。

（４）細胞培養容器１は、細胞の接着性、及び加工の容易性等の観点から、主としてポリスチレンにより製造される。しかしながら、ポリスチレンによりフィルム体を構成した場合、このフィルム体を折り畳むとフィルム体が割れやすく、フィルム体をひだ状に加工することが困難であった。そこで、フィルム体３０を、ポリエチレンテレフタレートフィルムにより構成した。これにより、フィルム体３０を折り畳んだ場合におけるフィルム体３０の割れの発生を防げる。よって、フィルム体３０の加工の容易性を向上させられるので、細胞培養に適した形状のフィルム体３０を容易に製造できる。

（５）フィルム体３０の表面に電荷処理を施した。これにより、フィルム体３０の表面に官能基を付与でき、フィルム体３０の親水性を高められる。よって、フィルム体３０の表面に対する細胞の接着性をより向上させられる。

次に、本発明の細胞培養容器の第２実施形態につき、図９〜図１１を参照しながら説明する。
第２実施形態の細胞培養容器１は、容器本体１０の内部におけるフィルム体３０の配置において第１実施形態と異なる。尚、第２実施形態以降の説明にあたって、同一構成要件については同一符号を付し、その説明を省略もしくは簡略化する。

第２実施形態では、フィルム体３０は、図９〜図１１に示すように、ひだ状に折り畳まれた状態で、折線３１の延びる方向が高さ方向となるように筒状に丸められて容器本体１０に収容される。
第２実施形態では、ひだの高さＨ、つまり、隣り合って配置される２つの折線３１の間の長さは、円筒部１２の半径ｒ以下であり、より好ましくは、円筒部１２の半径ｒの７０％〜９０％である。

第２実施形態の細胞培養容器１は、微小重力環境において特に好適に用いられる。微小重力環境とは、地上に比して極めて重力の小さい環境をいい、例えば、宇宙ステーションにおける環境（１０^−３Ｇ）や、重力分散型の模擬微小重力装置（例えば、特開２００３−９８５２号公報参照）を用いて実現できる環境をいう。或いは、重力の影響を減少するという点から、上記の細胞培養容器は３次元培養システムであるＲｏｔａｒｙＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＳｙｓｔｅｍ（ＲＣＣＳ；シンセコン社）にも、好適に使用できる。

微小重力環境、或いはＲＣＣＳのような単軸の回転培養容器で実現できる重力の影響を減少する環境においては、細胞は、重力の影響を小さくすることができる。そのため、細胞は、水平面の上面のみではなく、細胞培養容器１の内部におけるすべての面に接着して増殖できる。そのため、第２実施形態の細胞培養容器１を微量重力環境やＲＣＣＳにおいて使用することで、ひだ状に折り畳まれたフィルム体３０の表面の全面において細胞を増殖させられる。これにより、細胞培養容器１における細胞培養の効率を大きく向上させられる。

尚、重力分散型の模擬微小重力装置１００は、図１２に示すように、複数、或いは単一の細胞培養容器１を収容可能な容器収容部１１０と、この容器収容部１１０を第１の軸１２５を回転軸として回転可能に支持する第１支持部１２０と、容器収容部１１０を第１の軸１２５に直交する第２の軸１３５を回転軸として回転可能に支持する第２支持部１３０と、容器収容部１１０の回転を制御する制御部（図示せず）と、を備える。そして、模擬微小重力装置１００は、容器収容部１１０を、直交する２つの軸１２５，１３５を中心として回転させることで、容器収容部１１０にかかる重力を分散させて、模擬的に微小重力環境を実現する。

以上説明した第２実施形態の細胞培養容器１によれば、上述した（１）〜（５）の効果を奏する他、以下のような効果を奏する。

（６）フィルム体３０を筒状に丸めた状態で容器本体１０に収容した。これにより、ひだ状に折り畳んだフィルム体３０を、より表面積を多くした状態で容器本体１０に収容できる。また、容器本体１０の内部において、フィルム体３０を均等に配置できるので、細胞培養容器１に充填された培地の流動性の偏りを生じにくくできる。よって、細胞培養の効率を更に向上させられる。

（７）隣り合って配置される２つの折線３１の間の長さを円筒部１２の半径以下にした。これにより、フィルム体３０に形成されるひだの高さを円筒部１２の半径以下にできるので、フィルム体３０を筒状に丸めた場合に、ひだ同士が過剰に重なり合うことを防げる。よって、フィルム体３０同士が過剰に重なりあうことにより、細胞の接着及び増殖が妨げられることを防げる。

以上、本発明の細胞培養容器１の好ましい各実施形態につき説明したが、本発明は、上述の実施形態に制限されるものではなく、適宜変更が可能である。

例えば、容器本体１０の内部におけるフィルム体３０の配置は、第１実施形態及び第２実施形態の配置に限らない。即ち、図１３に示すように、容器本体１０の内径よりも小さい板状のＰＥＴフィルム３２を、厚さ方向に所定間隔をあけて複数枚層状に配置する共に、これら複数枚のＰＥＴフィルム３２を容器本体１０の内径と略等しい円板状の支持板３３により一体化させてフィルム体３０を構成してもよい。また、図１４に示すように、ＰＥＴフィルムを渦巻き状に丸めた状態で容器本体１０に収容してフィルム体３０を構成してもよい。

また、第１実施形態及び第２実施形態では、フィルム体３０をＰＥＴフィルムにより構成したが、これに限らない。即ち、フィルム体を、ポリスチレンフィルム、ポリプロピレンフィルム等の他の合成樹脂フィルムにより構成してもよい。

１細胞培養容器
１０容器本体
１１開口部
１２円筒部
１３縮径部
２０キャップ
２２ガス透過領域
３０フィルム体
３１折線

Claims

一端側に開口部が形成された筒状の容器本体と、
前記容器本体の開口部に着脱可能に取り付けられるキャップと、
前記キャップに設けられ、液密性を有し、かつ、気体の流通を許容するガス透過領域と、
前記容器本体の内部に配置され、表面に培養細胞が接着可能なフィルム体と、を備え、
前記容器本体は、
該容器本体の一端側に配置され縮径部分を有さない円筒部と、
前記円筒部の先端側に配置され、基端側から先端側に向かって縮径する縮径部と、を備え、
前記フィルム体は、所定間隔をあけて互いに平行に延びる複数の折線によりひだ状に折り畳まれると共に、該複数の折線が前記容器本体の長手方向に沿って配置された状態で、該フィルム体の表面が前記容器本体の長手方向に沿うように配置される細胞培養容器。
前記複数の折線が、該細胞培養容器を遠心する際に重力がかかる方向と平行である請求項１に記載の細胞培養容器。
前記フィルム体は、筒状に丸めた状態で前記容器本体の内部に収容される請求項１又は２に記載の細胞培養容器。
隣り合って配置される２つの前記折線の間の長さは、前記円筒部の半径以下である請求項３に記載の細胞培養容器。
前記フィルム体は、ポリエチレンテレフタレートフィルムにより構成される請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養容器。
前記フィルム体の表面には、電荷処理が施されている請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養容器。