JP2020202784A - 多層培養容器 - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞を培養層から剥離する際に、細胞が剥離液に浸漬する時間にばらつきが生じることを抑制することができる多層培養容器を提供する。【解決手段】多層培養容器1は、境界面10によって、底板2と平行な方向において、内部空間を一方側の培養空間11と他方側のバッファ空間12とに分けられている。また、多層培養容器1は、培養空間11において底板2と平行な方向に沿って延び、培養空間11を複数の培養層21に分ける少なくとも1つの中間板5と、境界面10において、底板2及び少なくとも1つの中間板5のそれぞれから天板3側に延びる壁部13と、バッファ空間12とそれぞれの培養層21とを連通させる連通部14と、天板3のバッファ空間12に面する位置に形成された給排液口6と、を備えている。【選択図】図1
Description
本発明は、複数の培養層で細胞を培養可能な多層培養容器に関する。
細胞培養の方法にはいくつかの種類があるが、最も一般的な方法として、培養容器に細胞を接着させた状態で培養が行われる静置培養がある。具体的には、シャーレや培養フラスコなどの培養容器の底面に細胞を密着させ、培養容器の底面と側面とによって形成された培養層に培地を加え、所定の環境条件下において細胞培養が行われる。そして、培養が進行するにつれて、細胞は培養容器の底面に沿って増殖する。また、近年では、大量の細胞に対して静置培養を行うために、細胞が接着可能な複数の接着面を有し、複数の培養層が形成された多層培養容器が開発されている(図6を参照)。
静置培養において、増殖した細胞を新しい培養容器に移し替える継代や、培養が終了した細胞の回収を行う際には、剥離液によって細胞を接着面から剥離させる必要がある。特に、多層培養容器に対して細胞の剥離を行う場合、大量の剥離液が必要になるとともに、所定の手順によって、供給した剥離液を容器内部の各培養層に行き渡らせる必要がある。例えば、従来の多層培養容器201は、図6に示すように、底板202と天板203と側壁204とからなる直方体形状の筐体と、筐体の内部空間を複数の培養層221に分ける複数の中間板205と、多層培養容器201に液体の供給及び排出を行う給排液部206と、内部の気体を排出する排気口207とを有する。給排液部206は、天板203側が開口しており、天板203側から底板202側にかけて複数の中間板205を貫通する円筒形状であって、円筒側面には複数の培養層221のそれぞれと連通する複数の連通部214が形成されている。また、図6に示すように、給排液部206の開口部分は、天板203の角に配置されており、排気口207は、給排液部206の配置位置と隣り合う角に配置されている。従来の多層培養容器201に対して、剥離液30を供給し、細胞を剥離させる手順について、図7を参照にしつつ、以下に説明する。なお、図7における斜線部分は、剥離液30が存在している領域である。
まず、図7(a)に示すように、多層培養容器201を、給排液部206が下、排気口207が上となり、且つ、底板202が水平な載置面に対して垂直となるように置き(以下、第1姿勢)、多層培養容器201の内部の培地を給排液部206から排出する。続いて、多層培養容器201が第1姿勢の状態で、給排液部206から多層培養容器201の内部に所定量の剥離液30を供給する。剥離液30の供給後、図7(b)に示すように、底板202が載置面に対して垂直を保ったまま、給排液部206及び排気口207が上になるように、多層培養容器201を置き直す(以下、第2姿勢)。これにより、剥離液30が連通部214を介して各培養層221に略均等に流れ込む。次に、図7(c)に示すように、底板202が載置面と接触し、給排液部206及び排気口207が上になるように多層培養容器201を置き直す(第3姿勢)。これにより、剥離液30が底板202及び複数の中間板205に沿って均一に広がり、底板202及び複数の中間板205に接着している細胞全体が剥離液30に浸漬する。そして、多層培養容器201を第3姿勢のまま所定時間放置することにより、細胞は底板202及び複数の中間板205から剥離する。最後に、図7(d)に示すように、多層培養容器201を再び第1姿勢として、底板202及び複数の中間板205から剥離された細胞を給排液部206から排出する。
以上の手順によって、従来の多層培養容器201において、底板202及び複数の中間板205から剥離した細胞を回収することが可能となる。しかし、図7(a)に示すように、多層培養容器201を第1姿勢にし、剥離液30を多層培養容器201に供給している間、剥離液30は各培養層221に流れ込んでいる。このため、多層培養容器201が第1姿勢のときに、下に位置する側壁204付近の底板202及び中間板205に接着している細胞は、剥離液30を供給する間中ずっと剥離液30に浸漬する。一方で、多層培養容器201が第1姿勢のときに、上に位置する側壁204付近底板202及び中間板205に接着している細胞は、剥離液30を供給している間、剥離液30に浸漬することはない。容器内部に大量の剥離液を供給するには時間を要するため、従来の多層培養容器201では、場所によって細胞が剥離液に浸漬する時間にばらつきが生じてしまう。細胞の剥離液に浸漬する時間が長過ぎると、細胞を傷め、浸漬する時間が短過ぎると、細胞を培養層から剥離できない。
そこで、本発明の目的は、細胞を培養層から剥離する際に、細胞が剥離液に浸漬する時間にばらつきが生じることを抑制することができる多層培養容器を提供することである。
本発明に係る多層培養容器は、複数の培養層で細胞を培養可能な多層培養容器であって、底板と、前記底板と対向する天板と、前記底板と前記天板とを繋ぐ複数の側壁と、を含む筐体と、前記筐体の内部空間を、前記底板と平行な方向において、一方側の培養空間と他方側のバッファ空間とに分ける境界部と、少なくとも前記培養空間において前記底板と平行な方向に沿って延び、前記培養空間を前記複数の培養層に分ける少なくとも1つの中間板と、前記境界部において、前記底板及び前記少なくとも1つの中間板のそれぞれから前記天板側に延びる複数の壁部と、前記複数の培養層のそれぞれを前記バッファ空間と連通させる、前記境界部に形成された複数の連通部と、前記筐体のうち前記バッファ空間に面する位置に形成された給排液口と、を備えることを特徴とする。
このような多層培養容器を用いれば、次のような手順で剥離液を各培養層に供給することができる。まず、他方側の側壁が下になるように、すなわち、バッファ空間が下になるように、多層培養容器を置く。続けて、給排液口から剥離液をバッファ空間に供給する。剥離液の供給後、他方側の側壁につながる何れかの側壁が下になるように、すなわち、底板及び中間板が水平方向に沿って並ぶように、多層培養容器を置き直す。すると、バッファ空間の内部の剥離液の一部が、複数の連通部を介して各培養層に略均等に流れ込む。次に、一方側の側壁が下になるように、すなわち、培養空間が下になるように、多層培養容器を置き直す。すると、バッファ空間内の剥離液の全てが、複数の連通部を介して各培養層に略均等に流れ込む。最後に、底板が下になるように多層培養容器を置けば、各培養層の剥離液が底板又は中間板に沿って均一に広がる。
このような手順によれば、剥離液を給排液口から供給している間は、剥離液はバッファ空間に流れ込み、各培養層に流れ込むことはない。また、剥離液の供給後、多層培養容器を2回置き直す際には、各培養層の一部領域にのみ剥離液が存在する状況となるが、このような置きなおし作業は短時間で済ませることができる。このため、場所によって、細胞の剥離液への浸漬時間が異なることによる影響は小さい。つまり、本発明によれば、剥離液の供給時に、剥離液を一時的に貯留するバッファ空間を設けることで、細胞が剥離液に浸漬する時間にばらつきが生じることを抑制することができる。
また、上記多層培養容器は、前記底板に設けられた前記壁部の上端から前記他方側の側壁に向かって、前記天板側に傾斜しながら延びる傾斜板が設けられていることが好ましい。
バッファ空間に貯留された剥離液は、その後、連通部を介して各培養層に流入する。このとき、底板に設けられた壁部がある場合、バッファ空間において壁部と底板と他方側の側面とに囲まれた部分に、剥離液の一部が残存してしまう。そこで、上記構成では、底板に設けられた壁部の上端から他方側の側壁に向かって、天板側に延びる傾斜板を設けている。これにより、バッファ空間に残存する剥離液は、底板を下にしたときに、傾斜板を伝って底板と中間板との間の培養層に流れ込むため、バッファ空間に残存する剥離液を減らすことができ、剥離液を無駄なく使用することができる。
また、上記多層培養容器において、前記少なくとも1つの中間板は、前記培養空間において前記境界部まで延びていることが好ましい。
従来の多層培養容器では、中間板によって各培養層同士が完全に隔てられている。このため、各培養層に剥離液を供給するためには、中間板を貫通する円筒形状であって、円筒側面に各培養層と連通する複数の連通部が形成されている給排液部を設ける必要があった。一方で、上記構成では、中間板は、一方側の培養空間において境界部まで延びており、他方側のバッファ空間には延びていない。つまり、バッファ空間は、中間板によって隔てられていない。そして、バッファ空間に供給された剥離液は、境界部に形成された連通部を介して各培養層に流れ込むことが可能である。したがって、上記構成によれば、各培養層に剥離液を供給するためには、筐体のバッファ空間に面する位置に、単に開口(給排液口)を形成すればよく、中間板を貫通する円筒形状の給排液部を形成する必要のある従来の多層培養容器と比べて、容易に製造することができる。
また、上記多層培養容器において、前記少なくとも1つの中間板は、前記培養空間及び前記バッファ空間の両方において前記底板と平行な方向に沿って延びることで、前記バッファ空間が複数のバッファ層に分けられており、前記バッファ空間において前記中間板を貫通する貫通孔がさらに形成されていることが好ましい。
上記構成では、他方側の側壁まで延びた中間板によって、バッファ空間が、各培養層に対応する複数のバッファ層に分けられている。また、中間板に貫通孔が形成されていることによって、それぞれのバッファ層同士の間で、液体又は気体が連通可能となる。このため、剥離液をバッファ空間に供給後、他方側の側壁につながる何れかの側壁が下になるように多層培養容器を置き直すと、剥離液の一部が各培養層に略均等に流れ込むとともに、剥離液の残りの一部は各バッファ層に略均等に分けられて、貯留された状態となる。この状態から、培養空間が下になるように多層培養容器を置き直すと、各バッファ層に略均等に貯留された剥離液の残りの一部が、連通部を介して各培養層に流れ込む。よって、剥離液の全てを、より均等に各培養層に供給することができる。
細胞を培養層から剥離する際に、細胞が剥離液に浸漬する時間にばらつきが生じることを抑制することができる多層培養容器を提供する。
以下、本発明の好適な実施の形態について、図面を参照しつつ説明する。
本実施形態に係る多層培養容器1は、複数の培養層で細胞を培養することが可能な直方体形状の培養容器である。多層培養容器1は、図1に示すように、底板2と、底板2と対向する天板3と、底板2と天板3とを繋ぐ4つの側壁4と、3つの中間板5と、給排液口6と、排気口7と、を含む。また、多層培養容器1の内部空間は、底板2と平行な方向(図1の左右方向)において、境界面(境界部)10よりも一方側(図1の左側)の培養空間11と、境界面10よりも他方側(図1の右側)のバッファ空間12とに分けられる。
底板2及び天板3は長方形形状の平板であり、底板2と天板3とは互いに対向している。また、底板2と天板3とは、4つの側壁4によって繋がっている。側壁4は、一方側の側壁4aと、他方側の側壁4bと、側壁4aと4bとにつながる側壁4c及び4dとからなる。
中間板5は、培養空間11において、底板2と平行な方向に沿って延び、側壁4a、4c及び4dの内面と接している。また、3つの中間板5は、底板2と垂直な方向に沿って並んでいる。そして、底板2及び中間板5には、細胞が接着可能である。境界面10において、底板2及び3つの中間板5のそれぞれから天板3側に延びる壁部13が形成されている。そして、底板2と、中間板5と、側壁4a、4c及び4dと、壁部13とに囲まれた領域、2つの中間板5と、側壁4a、4c及び4dと、壁部13とに囲まれた領域、及び、中間板5と、天板3と、側壁4a、4c及び4dと、壁部13とに囲まれた領域が、それぞれ培養層21となる。すなわち、本実施形態の多層培養容器1においては、4つの培養層21が形成される。
また、それぞれの壁部13の上端の全体と、中間板5又は天板3との間には、それぞれの培養層21とバッファ空間12とを連通させる連通部14が形成されている。さらに、図2に示すように、底板2に形成された壁部13の上端から他方側の側壁4bに向かって、天板3側に傾斜しながら延びる傾斜板15が設けられている。
給排液口6は、多層培養容器1に液体の供給及び排出を行う開口部分であって、図1に示すように、天板3のバッファ空間12に面する位置に形成されている。また、給排液口6は、例えば、円筒状に突出しており、蓋の取り付け及び取外しによって開閉が可能である。
排気口7は、多層培養容器1の内部の気体の排出を行う開口部分であって、天板3の培養空間11に面する位置に形成されている。また、排気口7は、例えば、円筒状に突出しており、蓋の取り付け及び取外しによって開閉が可能である。また、給排液口6は、側壁4cから4dに向かう方向において、排気口7よりも側壁4c側に形成されている。
続いて、以下に、本実施形態に係る多層培養容器1に対して、剥離液30を供給し、細胞を剥離させる手順について図3を参照しつつ説明する。なお、図7に示す、従来の多層培養容器の姿勢と同様の姿勢については、同じ呼称を用いる。また、図3おける斜線部分は、剥離液30が存在している領域である。
まず、側壁4b又は4cが下になるようにして、多層培養容器1の内部の培地を、開状態とした給排液口6から排出する。続いて、図3(a)に示すように、側壁4bが下になるように、すなわち、バッファ空間12が下になるように、多層培養容器1を置き(以下、貯留姿勢)、給排液口6から剥離液30をバッファ空間12に供給する。
剥離液30の供給後、図3(b)に示すように、側面4cが下になるように多層培養容器1を置き直す(第1姿勢)。これにより、バッファ空間12の内部に貯留された剥離液30の一部が、複数の連通部14を介して各培養層21に略均等に流れ込む。次に、図3(c)に示すように、側壁4aが下になるように、すなわち、培養空間11が下になるように、多層培養容器1を置き直す(第2姿勢)。すると、バッファ空間12内の剥離液30の全てが、複数の連通部14を介して各培養層21に略均等に流れ込む。その後、図3(d)に示すように、底板2が下になるように多層培養容器1を置くことで(第3姿勢)、各培養層の剥離液30が底板2又は中間板5に沿って均一に広がる。多層培養容器1を第3姿勢のまま所定時間放置することにより、細胞は底板2及び中間板5から剥離する。そして、図3(e)に示すように、側面4cを下にした第1姿勢、又は、バッファ空間12を下にした貯留姿勢(図3(a)を参照)として、給排液口6から細胞を排出する。
本実施形態の多層培養容器1は、境界面10によって、底板2と平行な方向において、内部空間を一方側の培養空間11と他方側のバッファ空間12とに分けられている。また、多層培養容器1は、底板2と平行な方向に沿って延び、培養空間11を4つの培養層21に分ける3つの中間板5と、境界面10において、底板2及び3つの中間板5のそれぞれから天板3側に延びる壁部13と、バッファ空間12とそれぞれの培養層21とを連通させる4つの連通部14と、天板3のバッファ空間12に面する位置に形成された給排液口6と、を備えている。
このような多層培養容器1を用いれば、次のような手順で剥離液30を各培養層21に供給することができる。まず、他方側の側壁4dが下になるように、すなわち、バッファ空間12が下になるように、多層培養容器1を置く(貯留姿勢)。続けて、給排液口6から剥離液30をバッファ空間12に供給する。剥離液30の供給後、側壁4cが下になるように、すなわち、底板2及び中間板5が水平方向に沿って並ぶように、多層培養容器1を置き直す(第1姿勢)。すると、バッファ空間12の内部の剥離液30の一部が、複数の連通部14を介して各培養層21に略均等に流れ込む。次に、側壁4aが下になるように、すなわち、培養空間11が下になるように、多層培養容器1を置き直す(第2姿勢)。すると、バッファ空間12内の剥離液30の全てが、複数の連通部14を介して各培養層21に略均等に流れ込む。最後に、底板2が下になるように多層培養容器1を置けば(第3姿勢)、各培養層21の剥離液30が底板2又は中間板5に沿って均一に広がる。このような手順によれば、剥離液30を給排液口6から供給している間は、剥離液30はバッファ空間12に流れ込み、各培養層21に流れ込むことはない。また、剥離液30の供給後、多層培養容器1を第1姿勢と、第2姿勢とに、2回置き直す際には、各培養層21の一部領域にのみ剥離液30が存在する状況となるが、このような置きなおし作業は短時間で済ませることができる。このため、場所によって、細胞の剥離液30への浸漬時間が異なることによる影響は小さい。つまり、本発明によれば、剥離液30の供給時に、剥離液30を一時的に貯留するバッファ空間12を設けることで、細胞が剥離液30に浸漬する時間にばらつきが生じることを抑制することができる。
本実施形態の多層培養容器1は、底板2に設けられた壁部13の上端から側壁4dに向かって、天板3側に傾斜しながら延びる傾斜板15が設けられている。バッファ空間12に貯留された剥離液30は、その後、連通部14を介して各培養層21に流入する。このとき、底板に設けられた壁部13がある場合、バッファ空間12において壁部13と底板2と側面4dとに囲まれた部分に、剥離液30の一部が残存してしまう。そこで、本実施形態では、底板2に設けられた壁部13の上端から側壁4dに向かって、天板3側に延びる傾斜板15を設けている。これにより、バッファ空間12に残存する剥離液30は、傾斜板15を伝って底板2と中間板5との間の培養層21に流れ込むため、バッファ空間12に残存する剥離液30を減らすことができ、剥離液30を無駄なく使用することができる。
本実施形態の多層培養容器1において、3つの中間板5は、培養空間11において境界面10まで延びている。従来の多層培養容器201では、図6に示すように、中間板205によって各培養層221同士が完全に隔てられていた。このため、各培養層221に剥離液30を供給するためには、中間板205を貫通する円筒形状であって、円筒側面に各培養層221と連通する複数の連通部214が形成されている給排液部206を設ける必要があった。一方で、本実施形態の多層培養容器1では、図1に示すように、中間板5は、一方側の培養空間11において境界面10まで延びており、他方側のバッファ空間12には延びていない。つまり、バッファ空間12は、中間板5によって隔てられていない。そして、バッファ空間12に供給された剥離液30は、境界面10に形成された連通部14を介して各培養層21に流れ込むことが可能である。したがって、本実施形態の構成によれば、各培養層21に剥離液30を供給するためには、バッファ空間12に面する位置に、単に開口(給排液口6)を形成すればよく、中間板205を貫通する円筒形状の給排液部206を形成する必要のある従来の多層培養容器201と比べて、容易に製造することができる。
以上、本発明の好適な実施の形態について説明したが、本発明は、これらの例に限られるものではなく、特許請求の範囲に記載した限りにおいて様々な変更が可能である。
上記実施形態では、中間板5は、培養空間11において、底板2と平行な方向に沿って延び、側壁4a、4c及び4dの内面と接している。しかしながら、中間板5は、培養空間11及びバッファ空間12の両方において、底板2と平行な方向に沿って延びていてもよい。例えば、変形例に係る多層培養容器101では、図4及び図5に示すように、3つの中間板105は、底板2と平行な方向に沿って延び、側壁4a、4b、4c及び4dの内面と接している。この場合、3つの中間板105には、バッファ空間12においてそれぞれを貫通する貫通孔16が形成されている。この構成によれば、図5に示すように、側壁4dまで延びた中間板105によって、バッファ空間12が、4つの培養層21に対応する4つのバッファ層22に分けられている。また、中間板105に貫通孔16が形成されていることによって、それぞれのバッファ層22同士の間で、液体又は気体が連通可能となる。このため、剥離液30をバッファ空間12に供給後、側壁4cが下になるように多層培養容器を置き直す(第1姿勢)と、剥離液30の一部が各培養層21に略均等に流れ込むとともに、剥離液30の残りの一部は各バッファ層22に略均等に分けられて、貯留された状態となる。この状態から、培養空間11が下になるように多層培養容器101を置き直すと(第2姿勢)、各バッファ層22に略均等に貯留された剥離液30の残りの一部が、連通部14を介して各培養層21に流れ込む。よって、剥離液30の全てを、より均等に各培養層21に供給することができる。
なお、上記変形例では、中間板105は、側壁4dの内面と接しているが、側壁4dの内面と接していなくてもよい。この場合、例えば、中間板105は、培養空間12における境界面10と側壁4dとの間の位置まで延びている。また、この場合は、中間板105と側壁4dとの間に隙間があるため、それぞれのバッファ層同士の間で液体又は気体を連通させるための貫通孔16は不要である。
上記実施形態及び上記変形例では、3つの中間板が配置されているが、1つ又は2つでもよく、4つ以上でもよい。
また、上記実施形態では、壁部13は、境界面10において、底板2及び中間板5から天板3側に向かって、底板2及び中間板5と垂直な方向に延びている。しかしながら、壁部13は、一方側又は他方側に傾いていてもよい。また、連通部14は、それぞれの壁部13の上端の一部と、中間板5又は天板3との間に形成されていてもよい。この場合、壁部13の上端のうち、連通部14が形成されていない部分は、中間板5又は天板3と接している。または、壁部13の上端全体と、中間板5又は天板3とが接しており、連通部14は、壁部13の任意の位置に1つ又は複数形成されていてもよい。
上記実施形態では、給排液口6は、天板3のバッファ空間12に面する位置に形成されている。しかしながら、給排液口6は、側壁4b、4c又は4dの、バッファ空間12と面する位置に形成されていてもよい。
上記実施形態では、排気口7は、天板3の培養空間11に面する位置に形成されている。しかしながら、排気口7は、側壁4a、4b、4c又は4dの、培養空間11又はバッファ空間12と面する位置に形成されてもよい。
上記実施形態では、剥離液を加えた多層培養容器1を、第3姿勢のまま所定時間放置することにより、細胞を底板2及び中間板5から剥離させている。しかしながら、例えば、第3姿勢で所定時間放置した後、多層培養容器1を軽く叩き、細胞を培養層から剥離させてもよい。これにより、単に所定時間放置する場合より、剥離させやすくなる。
上記実施形態では、底板2及び天板3は長方形形状である。しかしながら、底板2及び天板3は、台形形状でもよく、その他の多角形形状、楕円形状、又は、これらの複合からなる形状でもよい。
1、101 多層培養容器
2 底板
3 天板
4、204 側壁
5、105、205 中間板
6 給排液口
7 排気口
10 境界面
11 培養空間
12 バッファ空間
13 壁部
14 連通部
15 傾斜板
16 貫通孔
21、221 培養層
2 底板
3 天板
4、204 側壁
5、105、205 中間板
6 給排液口
7 排気口
10 境界面
11 培養空間
12 バッファ空間
13 壁部
14 連通部
15 傾斜板
16 貫通孔
21、221 培養層
Claims (4)
- 複数の培養層で細胞を培養可能な多層培養容器であって、
底板と、前記底板と対向する天板と、前記底板と前記天板とを繋ぐ複数の側壁と、を含む筐体と、
前記筐体の内部空間を、前記底板と平行な方向において、一方側の培養空間と他方側のバッファ空間とに分ける境界部と、
少なくとも前記培養空間において前記底板と平行な方向に沿って延び、前記培養空間を前記複数の培養層に分ける少なくとも1つの中間板と、
前記境界部において、前記底板及び前記少なくとも1つの中間板のそれぞれから前記天板側に延びる複数の壁部と、
前記複数の培養層のそれぞれを前記バッファ空間と連通させる、前記境界部に形成された複数の連通部と、
前記筐体のうち前記バッファ空間に面する位置に形成された給排液口と、
を備えることを特徴とする多層培養容器。 - 前記底板に設けられた前記壁部の上端から前記他方側の側壁に向かって、前記天板側に傾斜しながら延びる傾斜板が設けられていることを特徴とする請求項1に記載の多層培養容器。
- 前記少なくとも1つの中間板は、前記培養空間において前記境界部まで延びていることを特徴とする請求項1又は2に記載の多層培養容器。
- 前記少なくとも1つの中間板は、前記培養空間及び前記バッファ空間の両方において前記底板と平行な方向に沿って延びることで、前記バッファ空間が複数のバッファ層に分けられており、
前記バッファ空間において前記中間板を貫通する貫通孔がさらに形成されていることを特徴とする請求項1又は2に記載の多層培養容器。
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