DE2726313C3 - Verfahren zur in-vitro-Biosynthese von Hormonen, insbesondere von Insulin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in-vitm-Biosynthese von Hormonen, insbesondere von Insulin, durch in-vitro-Erhaltung bzw. in-vitro-Vermehrung von Zellen aus Organen und Geweben tierischer oder menschlicher Herkunft unter geeigneten Zellwachstums- und Zellerhaltungsbedingungen und Isolierung der gebildeten Substanz in an sich bekannter Weise aus dem Kulturmedium oder durch Aufarbeiten der Zellen.

Hochwertige Naturstoffe tierischen oder menschli chen Ursprungs, ζ. Β Insulin oder andere Hormone, erfüllen heute in der Medizin und Biochemie wichtige Aufgaben Hierbei handelt es sich meistens um solche Stoffe, die auf chemischem Wege bisher nicht oder nur äußerst schwierig hergestellt werden können. Als Rohmaterial fur ihre Gewinnung dienen zur Zeit fast ausschließlich Gewebe oder Körperflüssigkeiten von Tieren, Da das zu gewinnende Produkt oft nur in einem geringen Teil der Zellen des aufzuarbeitenden Gewöbes enthalten ist, fällt hierbei ein hoher Baliäst an unspezifischem Material art. In Zukunft werden Probleme bei der Beschaffung des Rohmaterials hin* zukommen.

Weiterhin ist es aus Gründen der Artspezifität ufi*

bedingt erforderlich, zumindest teilweise auf Material menschlichen Ursprungs zurückzugreifen, da entsprechende, aus tierischem Material gewonnene Produkte, zu geringe oder gar keine Wirksamkeit aufweisen. Soweit es sich hierbei um Gewebe handelt, steht das erforderliche Material nur in unzureichender Menge und in meist unbefriedigendem Zustand zur Verfugung. Daher ist es in den meisten Fällen noch immer unmöglich, auf tierisches Material auszuweichen.

Für die Massenkultivierung der Zellen fehlen bisher geeignete, allgemein anwendbare Kulturverfahren. Hierbei muß berücksichtigt werden, daß sich die kultivierten Zellen an das empirisch zusammengesetzte Kulturmedium adaptieren und zumindest eine Mikroumgebung mit relativ günstigen Wachstumsbedingungen aufbauen müssen. Bei dem »Oberflächen«- Verfahren ist es prinzipiell möglich, jedoch ist die Zellausbeute gering, da die Zellen nur zweidimensionales Wachstum aufweisen. Bei dem »Suspensions«- Verfahren wird diese Mikroumgebung durch den wechselnden Kontakt mit dem Kulturmedium ständig gestört. Zudem ist dieses Verfahren bisher nur fur wenige Zellarten anwendbar.

Aus der DE-OS 2 431 450 ist ein Verfahren zur invitro-Fortpflanzung oder in-vitro-Erhaltung von Zellen bekannt, das unter Verwendung von Hohlfasermembranen durchgeführt wird. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß der Aufbau eines technischen Systems nicht praktikabel ist.

Die bekannten Kulturverfahren führen ferner meist zu einer Entdifferenzierung und damit zu einem mehr oder weniger raschen Verlust der spezifischen Syntheseleistungen der Zellen. Die Entdifferenzierung ist jedoch nicht ein den Zellen inhärenter Prozeß, sie wird in erster Linie durch unzureichende Kulturbedingungen verursacht.

Ein weiterer Nachteil der bekannten Kulturverfahren besteht in den hohen Kulturmediumkosten, die bis zu 9()9f· durch das zugesetzte Blutserum verursacht werden. Dem Kulturmedium nüssen nämlich üblicherweise l()7r Blutserum zugesetzt werden.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Kulturverfahren zu überwinden und ein Verfahren zu entwickeln, mit dem tierische und menschliche Zellen in wirtschaftlicher Weise in-vitin erhalten oder vermehrt werden können Ferner soll das Verfahren ermöglichen, den Zusatz von Blutserum im Kulturmediumraum auf weniger als 0.5% zu reduzieren.

Es hat sich nun gezeigt, daß sich diese Aufgabe in technisch fortschrittlicher Weise losen läßt, wenn man gemäß vorliegender Erfindung hormonproduzierende Zellen in einem oder mehreren durch semipermeable Flachmembranen von mindesten einem Kulturmediumraum getrennten Zellkulturräumcn vermehrt bzw. erhält. Einige vorteilhafte Ausfuhrungsarten des erfindungsgemnlien Verfahrens sind in den Unterart Sprüchen 2 bis 5 erläutert.

/.ur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden fur das Zellkultur-System Flachmembranen verwendet, die vorzugsweise fur Moleküle bis zu einem Molekulargewicht von 100000 durchlässig sein müssen, jedoch undurchlässig für die Zellen sind. Die Flachmembran kann aus einem beliebigen Material hergestellt werden. Das verwendete Material muß jedoch für die Zellen gut Verträglich sein und darf keine für die Zellen toxischen Bestandteile erhalten. Hierfür kommen z. Ö. CellulosCj Cellulosederivate,

Polypeptide, Polyamide, Polysulfon oder Polyacrylnitril in Frage. Die Dicke der Flachmembrane liegt im Bereich von 10 bis 1.50 μίτι, vorzugsweise 30 bis lOü μιη. Die Membran muß jedoch ausreichend dick sein, um nicht zu durchbrechen und ausreichend dünn, um den gewünschten Stoffaustausch zu ermöglichen. Der Einbauabstand der Flachmembranen in dem Zellkultursystem beträgt vorzugsweise 2 mm.

Die Zellen werden in einem geeigneten Kulturmedium unier Zellwachstums- bzw. Zellerhaltungsbedingungen von pH und Temperatur kultiviert. Ein entsprechendes Kulturmedium wird auch im Zellkulturraum verwendet. Geeignete Kulturmedien sind bekannt und können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet weiden. Solche Kulturmedien bestehen im allgemeinen aus essentiellen Aminosäuren, Kohlehydraten, Vitaminen, Mineralsäuren und Blutserum. Zur Verhinderung des unerwünschten Wachstums von Bakterien und Pilzen können geeignete Bakterizide und Fungizide zugesetzt sein. Der pH-Wert des Kulturmediums wird vorzugsweise zwischen 6,8 bis 8,0 eingestellt. Bei dem verwendeten Gasgemisch handelt es sich um Luftodti um ein anderes Gemisch von Stickstoff oder Sauerstoff, dem vorzugsweise kleine Mengen an Kohlendioxyd, z. B. in der Größenordnung von 2 bis 5*2 zugesetzt werden. Das Kohlendioxyd dient dazu, um im Kulturmedium einen Karbonatpuffer zu schaffen, der zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes des Kulturmediums irn gewünschten Bereich beiträgt. Neben der Verwendung des Karbonatpuffers können auch andere geeignete Puffersysteme, z.B. »HEPES«-Puffer fur das Kulturmedium verwendet werden. Die geeignete Temperatur kann leichter ermittelt werden als die Temperatur, bei der ein optimales Zellwachstum bzw. eine optimale Zellerhaltung stattfindet.

Cieeignete Zellen für die in-vitro-Biosynthese von Insulin nach dem erfindungsgemaßen Verfahren sind insulinprodu/ierende B-Zellen aus dem Pankreas tierischen oder menschlichen Ursprungs einschließlich normaler oder abnormaler Zelltypen, z. B. aus Pankreastumoren. Aber auch andere Zellen von Organen und Gewehen tierischer und menschl'cher Herkunft, einschließlich normaler und abnormaler Zelltypen, die eine spezifische Syntheseleistung für bestimmte Hormone besitzen, können nach dem erfindungsgemäßeii Verfahren vermehrt b/w. erhalten werden.

Weitere Merkmale. Vorteile und Anwendungsmoglichkeiten der H^rfindung gehen aus der folgenden Darstellung an Hand der Zeichnungen und Ausfuhrungsbeispiele hervor. Es zeigt

Fig. 1 das Funktionsschema des erfindungsgemaß verwc ndeten Platterimembran-Systems,

Fig. 2 das Funktionsschema für das Kreislaufverfahrcn, bei dem jeweils zwei Kulturmediumräume an einem /ellkulturraum benachbart sind.

I ig 3 das Funktionsschema fur das Kreislaufverfahien. bei dem die Zellkulturräume oben von einem Kulturmediumraum und unten von einem Gasraum begrenzt sind,

Fig. 4 den Vergleich der Insulinsynthese-Leistung Piattenmembran-System/Petrischale, bei dem die Kümulativwerte auf 10⁷ Zellen berechnet sind,

Fig. 5 den Vergleich der insulinsynthcse-Leistung PlaUenmeiTibfan-System/Petrischale mit Kumulativwerten,

Fig. 6 den Vergleich der Insulinsynthese^Leistung in dem Plattenmorabran-System, bei unterschiedlichem Kulturmedium.

In Fig. 1 ist das prinzipielle Schema des erfindungsgemäß verwendeten Platteumembran-Systems dargestellt. Die in das Plattenmembran-System inokulierten Zellen 1 werden zwischen zwei gespannten, semipermeable!! Flachmembranen 2 und 3 in dem Zellkulturraum in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert. Die Inokulation der Zellsuspension erfolgt über den Einlaß 7. Der Zellkulturraum 4 ist durch semipermeable Flachmembranen 2 und 3 von entweder zwei Kulturmediumräumen 5 und 6 oder oben von dem Kulturmediumraum 6 und unten von dem Gas-, raum 5 getrennt. Wenn 5 ein Gasraum ist, ist die Membran 2 gasdurchlässig, jedoch nicht wasserdurchlässig. Über den Einlaß 8 bzw. 9 wird der Kulturmediumraum mit einem geeigneten Kulturmedium in Berührung gebracht und kontinuierlich perfundiert. Bei Durchführung des Verfahrens unter Verwendung eines Gasraums wird über den Einlaß 8 ein geeignetes Gasgemisch eingeleitet.

Das Funktionsschema fur ·■ -.3 Kreislaufverfahren, bei dem die ZeÜkulturräurne lü jeweils von oben und von unten von Kulturmediumräumen 11 abgetrennt sind, ist in Fig. 2 dargestellt. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen als Suspension in einem geeigneten Kulturmedium über die Zuleitung 12 unter aseptischen Bedingungen in den Zellkulturraum 10 des sterilen Zellkultur-Systems inokuliert. In dem Zellkultur-System werden dabei vorzugsweise mehrere Lagen von semipermeablen Flachmembranen 13 übereinander angeordnet, und zwar in der Weise, daß sich jeweils ein Zellkulturraum 10 mit einem Kulturmediumraum 11 abwechselt, die alle seillich getrennt voneinander zugänglich sind und untereinander keine Verbindung haben. Das Kulturmedium 14 wird aus dem Vorratsbehälter 15 kontinuierlich über eine Pumpe 16 und einem sich anschließenden Oxygenator 17 über die Zuleitung 18 durch den Kulturmediumraum 11 d'-s Zellkultur-Systems und zurück in die Vorratsflasche 15 geführt. Der Vorratsbehälter 15 ist mit den Meßeinrichtungen 19 und 20 versehen, um pH- und Sauerstoffmessungen an den Instrumenten 21 und 22 vorzunehmen Die Instrumente 21 und 22 sind mit einem Steuergerät 23 verbunden, um über das Ventil 24 ein geeignetes Gasgemisch des Behalten, 25 fur Jen Oxygenator 17 über die Zuleitung 26 zu steuern. Das Kulturmedium 14 in der Vorratsflasche 15 muß bei diesem Verfahren in mehr oder weniger großen Zeitabständen, vorzugsweise 3mal pro Woche, vollständig oder teilweise über den Einlaß 27 ersetzt werden, um eine Anhäufung von schädlichen Stoffwechselprodukten der kultivierter. Zellen sowi: eine /u starke Abnahme dei Nährstoffe zu verhindern Das von den Zellen synthetisierte Hormon kann dann durch Aufarbeiten des Kulturmediums in an sich bekannter Weise gewonnen werden. Die Durchflußmenge des Kulturmediums durch den gesamten Kreislauf kann variabel gehandhabt werden.

DasFunK'.onsschemazur Durchfuhrung des Kreis laufverfahrens, bei dem die Zellkulturräume 10 oben Von einem Külturmediumraum 11 und unten von einem Gasraum 28 abgetrennt sind, i'st in Fig, 3 dargestellt. Die Zellen werden als Suspension in einem geeigneten Kulturmedium über die Zuleitung 29 und aseptischen B.iiUngupgen in den Zellkulturraum 10 des sterilen Zellkultur-Systems inokuliert. Der Zellkulturraum 10 ist dabei nach oben durch eine semi-

permeable Flachmembran 3 von dem Kulturmedium^ raum 11 und nach unten durch eine speziell gasdurchlässige, jedoch nicht wasserdurchlässige Flachmembran 2 von dem Gasraum 28 abgetrennt. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise mehrere Lagen dieser Anordnung übereinander im Zellkultur-System angeordnet, und zwar in der Weise, daß alternierend ein Kulturmediumraum 11, ein Zellkulturraum 10 und ein Gasraum 28 sich abwechseln. Der Gasraum 28 ist von dem Kulturmedium ebenfalls durch eine speziell gasdurchlässige, je^ doch nicht wasserdurchlässige Flachmembran abgetrennt. Das Kulturmedium 14 wird aus dem Vorratsbehälter 15 kontinuierlich über eine Pumpe 16 über die Zuleitung 30 durch den Kulturmediumraum 11 des Zellkultursystems und zurück in den Vorratsbehälter 15 geleitet. Der Vorratsbehälter 15 ist mit den Meßeinrichtungen 19 und 20 versehen, um pH- und Saiierstoffmessungen an den Instrumenten 21 und 22 vorzunehmen. Die Instrumente 21 und 22sind mit einem Steuergerät 23 verbunden, um über das Ventil 31 ein geeignetes Gasgemisch des Behälters 32 über die Zuleitung 33 in den Gasraum 28 des Zellkultur-Systems zu steuern. Das durch den Gasraum 28 durchströmende Gasgemisch wird über die Leitung 34 aus dem Zellkultur-System abgeleitet.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als kontinuierliches Durchflußverfahren durchgeführt werden. Das kontinuierliche Durchflußverfahren weist prinzipiell die gleiche Verfahrensfuhrung auf, mit dem Unterschied, daß hierbei das Kulturmedium 14 nicht in den Vorratsbehälter 15 zurückgeführt wird. Das Kulturmedium kann nach Durchführung durch das Zellkultur-System direkt zur Isolierung der Hormone in an sich bekannter Weise verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, daß die kultivierten Zellen, die normalerweise bei Verwendung der üblichen Kulturverfahren auf festen Oberflächen, z. B. Glas oder Kunststoff, ein zweidimensionales Wachstum aufweisen, sich auf den semipermeablen Flachmembranen dreidimensional gewebcariig vernichten. Diesel iictvuisicciitinjC Effekt beruht auf der kontinuierlichen Versorgung der kultivierten Zellen mit Nährstoffen sowie einem kontinuierlichen Abtransport giftiger Stoffwechselprodukte der Zellen aus dem Zellkulturraum über die beiden semipermeablen Flachmembranen in dem Kulturmediumraum. Durch den Einsatz von semipermeablen Flachmembranen unterschiedlicher Porosität und Dicke wird ermöglicht, daß der Stoffaustausch nach Menge und Größe der Moleküle gesteuert werden kann, um somit eine optimale Versorgung und Entsorgung der kultivierten Zellen sowie eine optimale Abtrennung des synthesierten Hormons zu erreichen.

Dadurch, daß die erfindungsgemäß kultivierten Zellen ein gewebe artiges, dreidimensionales Wachstum zeigen, wird die Forderung zur Massenkultivierung erfüllt. Hinzu kommt, daß der Zusatz von Blutserum im Kulturmediumkreislauf von normalerweise 5 bis 10% auf weniger als 0,5% reduziert werden kann.

Ferner hat sich gezeigt, daß die auf erfindungsgemäße Weise kultivierten Zellen über mehrere Monate kultiviert werden können, ohne daß sich während dieser Zeit ihre spezifische Syntheseleistung verliert. Im Gegensatz zu den Ob'^herweise angewendeten Oberflächen- oder Suspeffsiöfisveffälifen ist die spezifische Syntheseleistung der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kultivierten Zellen mindestens um den Faktor 5 höher, bezogen auf die gleichen Mengen an -> inokulierten Zellen.

In den nachfolgenden Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert, wobei auf die Fig. 4 bis 6 Bezug genommen wird.

ίο Beispiel 1

a) Herstellung der Zellen
3 bis 5 Tage alte Ratten beiderlei Geschlechts von Stamm Wistar werden nach Dekapitation die Pankreata unter aseptischen Bedingungen entnommen

π und in einem eiskalten Phosphat-gepufferten Salzmedium, pH 7,0, folgender Zusammensetzung gesammelt:

NaCI 8.0 g

KCI 0.2 2

-'" KH₂PO₄ 0.2 g

Na₂HPO. 1.15 g

Glukose 0,05 g

dest. Wasser

1000 ml

-'"> Die Pankreata werden anschließend ohne weitere mechanische Zerkleinerung zur Herstellung einer Parikreas-Zellsuspension direkt einer Enzymbehandlung mit einerTrypsin-Kollagenase-Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung

ii) unterworfen:

NaCl

KCI

KH₂PO₄
)-> Na₂HPO₄

Glukose

Trypsin

Kollagenase

dest. Wasser
w Hierzu wird getrocknetes, pulverförmiges Trypsinenzym, das unter der Bezeichnung »Trypsin 1:250« von der Firma Difco vertrieben wird, sowie Kollage-

Für die Enzymbehandlung werden etwa 30 bis 40

•ίί Pankreata in einem Erlenmeyerkolben 5 ml Enzymlösung zugesetzt, 15 min bei 37° C unter leichtem Rühren mit einem Magnetrührer inkubiert, der Überstand nach Sedimentation der Gewebestückchen abpipettiert und wiederum 5 ml Enzymlösung zugesetzt.

ίο Dieser Vorgang wird etwa 8- bis lOmal bis zur vollständigen Verdauung des Gewebes wiederholt. Jeder Überstand wird sofort mit 5 ml eiskaltem Kulturmedium versetzt und bis zur Zentrifugation in einem Eisbad gehalten. Als Kulturmedium wird das Medium 199 (Modified) mit Earles Salzen verwendet, das von der Firma Flow Laboratories vertrieben wird. Dem Kulturmedium werden zusätzlich 10% fötales Kälberserum der Firma Flow Laboratories sowie pro Liter Medium 4 x 10⁵ IE Penicillin G der Firma Hoechst

ω AG zugesetzt. Nach Zentrifugation werden die Zellen der einzelnen Fraktionen vereinigt, nochmals mit Kulturmedium gewaschen und zum Schluß in Kulturmedium auf eine Konzentration von etwa 1—3 X 10⁷ Zellen pro Milliliter resuspendiert.

b) Zellkultursystem

Die Kultivierung der Zellen erfolgt in einem runden Plattenmembran-System mit einem Durchmesser von 38 mm, das schematisch in Fig. 1 dargestellt ist, zwi-

8.0	g	I
0.2	g
0,2	g	I
1.15	g
0,05	g	I
0,5	g	Ϊ
0,02	g	If
1000	ml

sehen zwef gespannten, durchsichtigen Flacliniembranen aus Celluloseacetat. Die Molekuiargewicius-Ausschlußgrenze der verwendeten Membranen liegt bei etwa 8000(5. Die beiden Kultufrhediumräüme sind nach außen hiri mit einer Glasscheibe abgeschlossen Um eine mikroskopische kontrolle des Zlellwachstums zu ermöglichen, Der Abstand der beiden Flachmembran beträgt 2 rrirri und die Zellwachstümsfläche etwa 11,3 cm²,

c) Zeilenkultivierung

Das Piatterimembran-Systern wird ririt 4 Mrad unter Verwendung einer 50 _t0-Quelle sterilisiert und anschließend als Kreislaufsystem zusammengebaut. Als Verbindungen des Plattenmembran-Systems mit der Vorratsflasche wird Silikonschlauch mit einem inneren Durchmesser von 1 mm verwendet. Alle diese Teile werden 30 min bei 1 bar autoklaviert. Danach werden 10⁷ Zellen des oben hergestellten Inokulums in den Zellkulturraum des Plattenmembran-Systems inokuliert sowie in die Vorratsflasche K)OmI Kulturmedium unter sterilen Bedingungen eingeleitet. Das gesamte Kreislaufsystem wird in einen ummantelten Kohlendioxyd-Inkubator gestellt und bei 37° C inkubiert. In den Inkubator wird kontinuierlich ein Luftgemisch mit 5% Kohlendioxyd eingeleitet. Die verwendeten Verbindungsschläuche aus Silikongummi dienen dabei als Oxygenator für das Kulturmedium, da sie sehr gut gasdurchlässig sind. Danach wird die Schlauchpumpe angeschaltet, wobei das Kulturmedium von der Vorratsflasche kontinuierlich mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 ml/min durch die beiden Kulturmediumräume des Plattenmembran-Systems gepumpt und in die Vorratsflasche zurückgeführt wird. Das gesamte Kulturmedium in der Vorratsflasche wird alle 3 bzw. 4 Tage durch neues Kulturmedium vollständig ersetzt.

Zur Kontrolle werden jeweils 5 x 10⁶ Zellen des oben hergestellten Inokulums in Kunststoff-Petrischalen mit einem Durchmesser von 50 mm in 5 ml des oben verwendeten Kulturmediums unter entsprechenden Bedingungen inkubiert. Dies entspricht dem normalerweise verwendeten Monolayer-Verfahre η

^ tr., ι*:..: T-it α..-u t-:_„i_-: .. ϊ_-ι -ι-

^Ul S-WUIlI τ 1V.1 UtIg VVJIl Z-iCllljll. J-IUWlI 11IdLTCl YV Il U U(U Kulturmedium alle 3 bzw. 4 Tage vollständig ersetzt. Das jeweils abgezogene Kulturmedium wird getrennt gesammelt und zur Bestimmung des Insulingehaltes zurückgehalten, um eine Aussage über die Insulinsyntheseleistung der Zellen zu erhalten. Die Bestimmung des Insulingehaltes erfolgt unter Verwendung eines Radioimmuno-Assays für Insulin der Firma Novo, Kopenhagen, wobei als Standard Ratteninsulin verwendet wird.

Die Inkubation der Zellen erfolgt über 35 Tage. Die im Platterjmernbran-System kultivierten Zellen zeigen über die gesamte Versttcliszeit ei« dreidimensionales, gewebeartiges Wachstuni; in den Petrisclialeri hingegen das bekänntefweisii zweidimensiöriale Wachstum. Das Ergebnis für die Insüiinsyntheseiei-"' stung der so kultivierten Zellen ist in Fig, 4 dargestellt in der Kumulativkürveri der Insulingehalte im Kulturmedium aufgezeigt sind, wobei die Insulinwerte auf gleiche inokulierte Zellzahlen berechnet wurden. perVorteiiderPiattenmembrari-Systemeistan Hand ¹⁽¹ der wesentlich höheren Insulinwerte zu erkennen.

Beispiel 2

Die allgemeine Prozedur des Beispiels 1 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß das verwendete KuI-

i*> turmedium im Kulturmediumraum einen Zusatz von nur 0,5% Serum besitzt, im Gegensatz zu Beispiel 1 unter Verwendung eines Kulturmediums mit einem Zusatz von üblicherweise 10%. Für die Kontrollen in Petrischalen wird wiederum ein Kulturmedium mit einem Zusatz von 10% Serum verwendet. Die Inkubation der Zellen erfolgt über 35 Tage. Das Zellwachstum zeigt das gleiche wie unter Beispiel 1 beschriebene Bild. Das Ergebnis für die Insulinbiosyntheseleistung der so kultivierten Zellen ist entsprechend der unter Beispiel 1 beschriebenen Weise in Fig. 5 dargestellt. Zusätzlich ist die Kumulativkurve des unter Beispiel 1 beschriebenen Versuchs mit dargestellt. Aus den Kurven ist zu erkennen, daß eine Reduzierung des Serumgehaltes im Medium des KuI-

i^(l turmediumraumes von üblicherweise 10% auf 0,5% keinen negativen Einfluß auf die Insulinsynthese-Leistung der in Plattenmembran-Systemen kultivierten Zellen hat, jedoch zu einer wesentlichen Reduzierung der Mediumkosten führt.

Beispiel 3

Die allgemeine Prozedur des Beispiels 1 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß das verwendete Medium im Kulturmediumraum einen Zusatz von 0,5% ■ι» Serum hat. Weiterhin wird der Glukosegehalt von normalerweise 1 g/I auf 3 g/l erhöht. Es ist hinlänglich bekannt, daß die Insulinsyntheseleistung der Zellen uuich Clhühung ücb Giukuacgchaue» sliniuücri weiden kann. Die Inkubation der Zellen erfolgt über 35

•i¹» Tage. Das Zellwachstum zeigt das gleiche wie unter Beispiel 1 beschriebene Bild. Das Ergebnis für die Insulinsyntheseleistung der so kultivierten Zellen ist entsprechend der unter Beispiel 1 beschriebenen Weise dargestellt. Zusätzlich ist die Kumulativkurve

W des unter Beispiel 2 beschriebenen Versuchs dargestellt. Aus Fig. 6 ist zu erkennen, daß die Insulinsynthese-Leistung der Zellen durch Erhöhung des Glukosegehaltes im Kulturmedium erhöht und somit die Insulinausbeute wesentlich gesteigert werden kann.

Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur in-vitro-Biosynthese von Hormonen, insbesondere von Insulin, durch in-vitro-Erhaltung bzw. in-vitro-Vermehrung von Zellen aus Organen und Geweben tierischer oder menschlicher Herkunft in geeignetem Zellwachstum- und Zeilerhaltungsbedingungen und Isolierung der gebildeten Substanz in an sich bekannter Weise aus dem Kulturmedium oder durch Aufarbeiten der Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man hormonproduzierende Zellen in einem oder mehreren durch semipermeable Flachmembranen von mindestens einem Kulturmedium raum getrennten Zellkulturräumen vermehrt bzw. erhält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturräume durch semipermeable Flachmembranen oben und unten von Kulturmediumräumen getrennt sind.

3. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturräume durch semipermeable Flachmembranen oben von einem Kuiturmediumraum und unten von einem Gasraum getrennt sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium in einem Kreislaufsystem wiederholt in die Kulturmediumräume geleitet wird, wobei im Kreislauf ein Kulturmediumvorratsbehälter, Meß- und Steuerungsvc richtungen sowie gegebenenfalls ein Oxygenator vorgesehen sind.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium zur Gewinnung der über die Membranen abgegebenen Substanzen in einem kontinuierlichen Durchflußsystem einmal in die Kulturmediumräume geleitet wird.