DE2726313B2

DE2726313B2 - Verfahren zur in-vitro-Biosynthese von Hormonen, insbesondere von Insulin

Info

Publication number: DE2726313B2
Application number: DE2726313A
Authority: DE
Inventors: Ulrich Dipl.-Biologe Dr.Phil.Nat. 6090 Ruesselsheim Mueller; Herwig Dipl.-Chem. Dr.Phil. Nat. 6078 Neu Isenburg Puchinger; Manfred Prof. Dr.Med.Vet. 6301 Krofdorf Sernetz
Original assignee: Battelle Institut eV
Current assignee: Battelle Institut eV
Priority date: 1977-06-10
Filing date: 1977-06-10
Publication date: 1979-05-31
Also published as: DE2726313C3; US4225671A; JPS5446892A; FR2393849A1; DE2726313A1; GB1567899A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in-vitro-Biosynthese von Hormonen, insbesondere von Insulin, durch in-vitro-Erhaltung bzw. in-vitro-Vermehrung von Zeilen aus Organen und Geweben tierischer oder menschlicher Herkunft unter geeigneten Zellwachstums- und Zellerhaltungsbedingungen und isolierung der gebildeten Substanz in an sich bekannter Weise aus dem Kulturmedium oder durch Aufarbeiten der Zellen.

Hochwertige Naturstoffe tierischen oder menschlichen Ursprungs, z. B. Insulin oder andere Hormone, erfüllen heute in der Medizin und Biochemie wichtige Aufgaben. Hierbei handelt es sich meistens um ,wiche Stoffe, die auf chemischem Wege bisher nicht, oder nur äußerst schwierig hergestellt werden können. Als Rohmaterial für ihre Gewinnung dienen zur Zeit fast ausschließlich Gewebe oder Körperflüssigkeiten von Tieren. Da das zu gewinnende Produkt oft nur in einem geringen Teil der Zellen des aufzuarbeitenden Gewebes enthalten ist, fällt hierbei ein hoher Ballast an unspezifischem Material an. In Zukunft wenden Probleme bei der Beschaffung des Rohmaterials hinzukommen.

Weiterhin ist es aus Gründen der Artspezifitiät un

bedingt erforderlich, zumindest teilweise auf Material menschlichen Ursprungs zurückzugreifen, da entsprechende, aus tierischem Material gewonnene Produkte, zu geringe oder gar keine Wirksamkeit aufweisen. Soweit es sich hierbei um Gewebe handelt, steht das erforderliche Material nur in unzureichender Menge und in meist unbefriedigendem Zustand zur Verfugung. Daher ist es in den meisten Fällen noch immer unmöglich, auf tierisches Material auszureichen.

Für die Massenkultivierung der Zellen fehlen bisher geeignete, allgemein anwendbare Kulturverfahren. Hierbei muß berücksichtigt werden, daß sich die kultivierten Zellen an das empirisch zusammengesetzte Kulturmedium adaptieren und zumindest eine Mikroumgebung mit relativ günstigen Wachstumsbedingungen aufbauen müssen. Bei dem »Oberflächen«- Verfahren ist es prinzipiell möglich, jedoch ist die Zellausbeute gering, da die Zellen nur zweidimensionales Wachstum aufweisen. Bei dem »Suspensions« -Verfahren wird diese Mikroumgebung durch den wechselnden Kontakt mit dem Kulturmedium ständig gestört. Zudem ist dieses Verfahren bisher nur für wenige Zellarten anwendbar.

Aus der DT-OS 2431450 ist ein Verfahren zur invitro-Fortpflanzung oder in-vitro-Erhaltung von Zellen bekannt, das unter Verwendung von Hohlfasermembranen durchgeführt wird. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß der Aufbau eines technischen Systems nicht praktikabel ist.

Die bekannten Kulturverfahren führen ferner meist zu einer Entdiiferenzierung und damit zu einem mehr oder weniger raschen Verlust der spezifischen Syntheseleistungen der Zellen. Die Entdiiferenzierung ist jedoch nicht ein den Zellen inhärenter Prozeß, sie wird in erster Linie durch unzureichende Kulturbedingungen verursacht.

Ein weiterer Nachteil der bekannten Kulturverfahren besteht in den hohen Kulturmediumkosten, die bis zu 90% durch das zugesetzte Blutserum verursacht werden. Dem Kulturmedium müssen nämlich üblicherweise 10% Blutserum zugesetzt werden.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Kulturverfahren zu überwinden und ein Verfahren zu entwickeln, mit dem tierische und menschliche Zellen in wirtschaftlicher Weise in-vitro erhalten oder vermehrt werden können. Ferner soll das Verfahren ermöglichen, den Zusatz von Blutserum im Kulturmediumraum auf weniger als 0,5% zu reduzieren.

Es hat sich nun gezeigt, daß sich diese Aufgabe in technisch fortschrittlicher Weise lösen läßt, wenn man gemäß vorliegender Erfindung hormonproduzierende Zellen in einem oder mehreren durch semipermeable Flachmembranen von mindesten einem Kulturmediumraum getrennten Zellkulturräumen vermehrt bzw. erhält. Einige vorteilhafte Ausführungsarten des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Unteransprüchen 2 bis 5 erläutert.

Zur Durchführung des trfindungsgemäßen Verfahrens werden für das Zellkultur-System Flachmembranen verwendet, die vorzugsweise für Moleküle bis zu einem Molekulargewicht von 100000 durchlässig sein müssen, jedoch undurchlässig für die Zellen sind. Die Flachmembran kann aus einem beliebigen Material hergestellt werden. Das verwendete Material muß jedoch für die Zellen gut verträglich sein und darf keine für die Zellen toxischen Bestandteile erhalten. Hierfür kommen z. B. Cellulose, Cellulosederivate,

Polypeptide, Polyamide, Polysulfon oder Polyacrylnitril in Frage. Die Dicke der Flachmembrane liegt im Bereich von 10 bis 150 μπι, vorzugsweise 30 bis 100 μπι. Die Membran muß jedoch ausreichend dick sein, um nicht zu durchbrechen und ausreichend dünn, um den gewünschten Stoffaustausch zu ermöglichen. Der Einbauabstand der Flachmembranen in dem Zellkultursystem beträgt vorzugsweise 2 mm.

Die Zellen werden in einem geeigneten Kulturmedium unter Zellwachstums- bzw. Zeilerhaltungsbedingungen von pH und Temperatur kultiviert. Ein entsprechendes Kulturmedium wird auch im Zellkulturraum verwendet. Geeignete Kulturmedien sind bekannt und können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Solche Kulturmedien bestehen im allgemeinen aus essentielien Aminosäuren, Kohlehydraten, Vitaminen, Mineralsäuren und Blutserum. Zur Verhinderung des unerwünschten Wachstums von Bakterien und Pilzen können geeignete Bakterizide und Fungizide zugesetzt sein. Der pH-Wert des Kulturmediums wild vorzugsweise zwischen 6,8 bis 8,0 eingestellt. Bei dem verwendeten Gasgemisch handelt es sich um Luft oder um ein anderes Gemisch von Stickstoff oder Sauerstoif, dem vorzugsweise kleine Mengen an Kohlendioxyd, z. B. in der Größenordnung von 2 bis 5% zugesetzt werden. Das Kohlendioxyd dient dazu, um im Kulturmedium einen Karbonatpuffer zu schaffen, der zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes des Kulturmediums im gewünschten Bereich beiträgt. Neben der Verwendung des Karbonatpuffers können auch andere geeignete Puffersysteme, z. B. »HEPES«-Puffer für das Kulturmedium verwendet werden. Die geeignete Temperatur kann leichter ermittelt werden als die Temperatur, bei der ein optimales Zellwachstum bzw. eine optimale Zellerhaltung stattfindet.

Geeignete Zellen für die in-vitro-Biosynthese von Insulin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sind insulinproduzierende B-Zellen aus dem Pankreas tierischen oder menschlichen Ursprungs einschließlich normaler oder abnormaler Zelltypen, z. B. aus Pankreastumoren. Aber auch andere Zellen von Organen und Geweben tierischer und menschlicner Herkunft, einschließlich normaler und abnormaler Zelltypen, die eine spezifische Syntheseleistung für bestimmte Hormone besitzen, können narh dem erfindungsgemäßen Verfahren vermehrt bzw. erhalten werden.

Weitere Merkmale, Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung gehen aus der folgenden Darstellung an Hand der Zeichnungen und Ausführungsbeispiele hervor. Es zeigt

Fig. 1 das Funktionsschema des erfindungsgemäß verwendeten Plattenmembran-Systems,

Fig. 2 das Funktionsschema für das Kreislaufverfahren, bei dem jeweils zwei Kulturmediumräume an einem Zellkulturraum benachbart sind,

Fig. 3 das Funktionsschema für das Kreislaufverfahren, bei dem die Zellkulturräume oben von einem Kulturmediumraum und unten von einem Gasraum begrenzt sind,

Fig, 4 den Vergleich der Insulinsynthese-Leistung Plattenmembran-System/Petrischale, bei dem die Kumulativwerte auf 10' Zellen berechnet sind,

Fig. 5 den Vergleich der Insulinsynthese-Leistung Plattenmembran-System/Petrischale mit Kumulativwerten,

Fig. 6 den Vergleich der Insulinsynthese-Leistung in dem PlattenmemDran-System, bei unterschiedlichem Kulturmedium.

In Fig. 1 ist das prinzipielle Schema des t:rfindungsgemäß verwendeten Plattenmembran-Sysieins dargestellt. Die in das Plattenmembran-System inokulierten Zellen 1 werden zwischen zwei gespannten, semipermeablen Flachmembranen 2 und 3 in dem Zellkulturraum in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert. Die Inokulation der Zellsuspension erfolgt über den Einlaß 7. Der Zellkulturraum 4 ist durch semipermeable Flachmembranen 2 und 3 von entweder zwei Kulturmediumräumen 5 und 6 oder oben von dem Kulturmediumraum 6 und unten vor. dem Gasraum 5 getrennt. Wenn 5 ein Gasraum ist, ist die Membran 2 gasdurchlässig, jedoch nicht wasserdurchlässig. Über den Einlaß 8 bzw. 9 wird der Kulturmediumraum mit einem geeigneten Kulturmedium in Berührung gebracht und kontinuierlich perfundiert. Bei Durchführung des Verfahrens unter Verwendung eines Gasraums wird über den Einlaß 8 ein geeignetes Gasgemisch eingeleitet.

Das Funktionsschema für dao Kreislaufverfahren, bei dem die Zellkulturräume 10 jeweils von oben und von unten von Kulturmediumräumen 11 abgetrennt sind, ist in Fig. 2 dargestellt. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen als Suspension in einem geeigneten Kulturmedium über die Zuleitung 12 unter aseptischen Bedingungen in den Zellkulturraum 10 des sterilen Zellkultur-Systems inokuliert. In dem Zellkuitur-System werden dabei vorzugsweise mehrere Lagen von semipermeablen Flachmembranen 13 übereinander angeordnet, und zwar in der Weise, daß sich jeweils ein Zellkulturraum 10 mit einem Kulturmediumraum 11 abwechselt, die alle seitlich getrennt voneinander zugänglich sind und untereinander keine Verbindung haben. Das Kulturmedium 14 wird aus dem Vorratsbehälter 15 kontinuierlich über eine Pumpe 16 und einem sich anschließenden Oxygenator 17 über die Zuleitung 18 durch den Kulturmediumraum 11 des Zellkultur-Systems und zurück in die Vorratsflasche 15 geführt Der Vorratsbehälter 15 ist mit den Meßeinrichtungen 19 und 20 versehen, um pH- und Sauerstoffmessungen an den Instrumenten 21 und 22 vorzunehmen. Die Instrumente 21 und 22sind mit einem Steuergerät 23 verbunden, um über das Ventil 14 ein geeignetes Gasgemisch des Behälters 25 für den Oxygenator 17 über die Zuleitung 26 zu steuern. Das Kulturmedium 14 in der Vorratsflasche 15 muß bei diesem Verfahren in mehr oder weniger großen Zeitabständen, vorzugsweise 3mal pro Woche, vollständig oder teilweise über den Einlaß 27 irselzt werden, um eine Anhäufung von schädlichen Stoffwechselprodukten der kultivierten Zellen sowie eine zu starke Abnahme der Nährsto.'fe zu verhindern. Das von den Zellen synthetisierte Hormon kann dann durch Aufarbeiten des Kulturmediums in an sich bekannter We^se gewonnen werden. Die Durchflußmenge des Kulturmediums durch den gesamten Kreislauf kann variabel gehandhabt werden.

Das Funktionsschema zur Durchführung des Kreislaufverfahrens, bei dem die Zellkulturräume 10 oben von einem Kulturmediumraum 11 und anlen von einem Gasraum 28 abgetrennt sind, ist in Fig. 3 dargestellt. Die Zellen werden als Suspension in einem geeigneten Kulturmedium über die Zuleitung 29 und aseptischen Bedingungen in den Zellkulturraum 10 des sterilen Zellkultur-Systems inokuliert. Der Zellkulturraum 10 ist dabei nach oben durch eine semi-

permeable Flachmembran 3 von dem Kulturmcdiumrauin 11 und nach unten durch eine speziell gasdurchlässige, jedoch nicht wasserdurchlässige Flachmembran 2 von dem Gasraum 28 abgetrennt. Nach dem erfindungsgemüßen Verfahren werden vorzugsweise mehrere Lagen dieser Anordnung übereinander im Zellkultur-System angeordnet, und zwar in der Weise, daß alternierend ein Kulturmediumraum 11, ein Zellkulturraum 10 und ein Gasraum 28 sieh abwechseln. Der Gasraum 28 ist von dem Kulturmedium ebenfalls durch eine speziell gasdurchlässige, jedoch nicht wasserdurchlässige Flachmembran abgetrennt. Das Kulturmedium 14 wird aus dem Vorratsbehälter 15 kontinuierlich über eine Pumpe 16 über die Zuleitung 30 durch den Kulturmcdiumraum 11 des Zellkultursystems und zunick in den Vorratsbehälter 15 geleitet. Der Vorratsbehälter 15

Lim pll- und Sauerstoffmessungen an den Instrumenten 21 und 22 vorzunehmen. Die Instrumente 21 und 22sind mit einem Steuergerät 23 verbunden, um über das Ventil 31 ein geeignetes Gasgemisch des Behälters 32 über die Zuleitung 33 in den Gasraum 28 des ZeII-kullur-Systems /u steuern. Das durch den Gasratim 28 durchströmende Gasgemisch wird über die Leitung 34 aus dem Zcllkultur-System abgeleitet.

Das erfindungsgemäßc Verfahren kann auch als kontinuierliches Durchflußverfallren durchgeführt werden. Das kontinuierliche Durchflußvcrfahren weist prinzipiell die gleiche Verfahrensführung auf. mit dem Unterschied, daß hierbei das Kulturmedium 14 nicht in den Vorratsbehälter 15 zurückgeführt wird. Das Kulturmedium kann nach Durchführung ti tuch das Zellkultur-System direkt zur Isolierung der Hormone in an sich bekannter Weise verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, daß die kultivierten Zellen, die normalerweise hei Verwendung der üblichen Kulturverfall!cn auf festen Oberflächen, z. B. Glas oder Kunststoff, ein zweidimensionales Wachstum aufweisen, sich auf den semipermeablen Flachmembranen dreidimensional gewebeartig vermehren. Dieser hervorstechende Effekt beruht auf der kontinuierlichen Versorgung der kultivierten Zellen mit Nährstoffen sowie einem kontinuierlichen Abtransport giftiger Stoffwechselprodukte der Zellen aus dem Zellkulturraum über die beiden semipermeablen Flachmembrancn in dem Kulturmediumraum. Durch den Einsatz von semipermeablen Flachmembranen unterschiedlicher Porosität und Dicke wird ermöglicht, daß der Stoffaustausch nach Menge und Größe der Moleküle gesteuert werden kann, um somit eine optimale Versorgung und Entsorgung der kultivierten Zellen sowie eine optimale Abtrennung des synthesierten Hormons zu erreichen.

Dadurch, daß die erfindungsgemäß kultivierten Zellen ein gewebeartiges, dreidimensionales Wachstum zeigen, wird die Forderung zur Massenkultivierung erfüllt. Hinzu kommt, daß der Zusatz von Blutserum im Kulturmediumkreislauf von normalerweise 5 bis 10% auf weniger als 0,5% reduziert werden kann.

Ferner hat sich gezeigt, daß die auf erfindungsgemaße Weise kultivierten Zellen über mehrere Monate kultiviert werden können, ohne daß sich während dieser Zeit ihre spezifische Syntheseleistung verliert. Im Gegensatz zu den üblicherweise angewendeten Oberfläche;!- oder Suspensionsverfahren ist die spezifische Syntheseleislung der mit dem erf;indungsgemäßcn Verfahren kultivierten Zellen mindestens um den Faktor 5 höher, bezogen auf die gleichen Mengen an inokulierten Zellen.

In den nachfolgenden Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erliiulert, wobei auf die Fig. 4 bis 6 Bezug genommen wird.

Beispiel I

a) Herstellung der Zellen

3 bis 5 lage alte kalten beiderlei Geschlechts von Stamm Wistar werden nach Dckapitation die Pankreata unter aseptischen Bedingungen entnommen und in einem eiskalten Phosphat-gepiifferlen Salzmetliiini. pH 7,0. folgender Zusammensetzung gesammelt:

KILPO₁
Nu,] IPO₁
(ilukose
tlest Wassei

O. J g

ί ),^_ H

0.05 g

1000 ml

Die Piinkieala werden anschließend ohne weiten.· mechanische Zerkleinerung zur Herstellung einer Pankrci' ■·/.ellsuspension direkt einer Hn/ymbehand-I unt; mit einer lixpsin- KoI lage nase-1 ösiing mit einem pH-Wert von 7.0 und folgender Zusammensetzung unlerworlcn:

KILPO₄

NaJlPO₄

Gluko'-e

Trypsin

Kollagenase

tlest. Wasser

S.O g

0.2 g

1.15 g

0.05 g

0.5 g

0.02 g

1000 ml

Hierzu wird getrocknetes, pulverförmiges Trypsinen/ym. das unter der Bezeichnung »Trypsin 1:250« von der Firma Difco vertrieben wird, sowie Kollagenase der Firma Worthington verwindet.

Für die Enzvmbehandlung werden etwa 30 bis 40 Pankrcata in einem Erlenmeyerkolhen 5 ml Enzymlösung zugesetzt, 15 min bei 37° C unter leichtem Rühren mit einem Magnetrührer inkubiert, der Überstand nach Sedimentation der Gewebestückchen abpipettiert und wiederum 5 ml Enzymlösung zugesetzt. Dieser Vorgang wird etwa 8- bis lOmal bis zur ollständigen Verdauung des Gewebes wiederholt. Jeder Überstand wird sofort mit 5 ml eiskaltem Kulturmedium versetzt und bis zur Zentrifugalion in einem Eisbad gehalten. Als Kulturmedium wird das Medium 199 (Modified) mit Earles Salzen verwendet, das von der Firma Flow Laboratories vertrieben wird. Dem Kulturmedium werden zusätzlich 1.0% fötales Kälberserum der Firma Flow Laboratories sowie pro Liter Medium 4 X lfl⁵ IE Penicillin G der Firma Hoechst AG zugesetzt. Nach Zentrifugation werden die Zellen der einzelnen Fraktionen vereinigt, nochmals mit Kulturmedium gewaschen und zum Schluß in Kulturmedium auf eine Konzentration von etwa 1-3 X 10⁷ Zellen pro Milliliter resiispendiert.

b) Zeiikuitursystem

Die Kultivierung der Zellen erfolgi in einem runden Plattenmembran-System mit einem Durchmesser von 38 mm, das schematisch in Fig. 1 disrgestellt ist, zwi-

sehen zwei gespannten, durchsichtigen Flachmembranen aus Celluloseacetat. Die Molekulargewiehts-Ausschlußgrenze der verwendeten Membranen liegt hei etwa HOOOO. Diebeiden Kulturmediumrüume sind nach außen hin mit einer Glasscheibe abgeschlossen, um eine mikroskopische Kontrolle des Zellwachstums zu ermöglichen. Der Abstand der beiden Flachrnembraii'.'D betrügt 2 mm und die Zellwathstumsfliiche etwa J 1,3 cm'.

c) Zcllcnkultivierung

[)iis Plattenmembran-Systeni wird in'·, 4 Mrad unler Verwendung einer 50 ₍ ^-Quelle sterilisier! uiiil anschließend als Kreislaufsystem /usammengebaut. Als Verbiiulungen des Plattenmembran-Syslems mit der Vorratsflusche wird Silikonschlauch mit einem inneren Durchmesser von 1 mm verwendet. /MIe diese Teile werden .10 min bei I bar aiitoklaviert. Danach werden K)' Zellen des oben hergestellten Inokiilums in den Zellkulturraum des Plutteniiiemhran-Systcms inokuliert sowie in die Vorralsflasche K)OmI KuI-lurmediuni unter sterilen lledingungen eingeleitet. Dus gesamte Kreislaufsystem wird in einen ummantelten Kohlendioxyd-Inkubatorgestellt und bei 37 ' C inkubiert. In den Inkubator wird kontinuierlich ein l.iiftgemisch mit 5^r'r Kohlendioxyd eingeleitet. Die verwendeten V'erlv.ndungsschlüuclic aus Silikonguinini dienen dabei als Oxygenator für das KuI-t irmedium, da sie sehr gut gasdurchlässig sind. Danach wird die Schlauchpumpe angeschaltet, wobei das Kulturmedium von der Vorratsflasche kontinuierlich mit "iner Durchflußgeschwindigkeit von 2 ml/min durch die beiden Kultiirniediumriiunie des Platlenmembraii-Systems gepumpt und in die Vorratsflusche /iiriickgefuhrt wird. Das gesamte Kulturmedium in der Vorratsflasche wird alle 3 bzw. 4 lage durch neues Kulturmedium vollständig ersetzt.

Zur Kontrolle werden jeweils 5 x K)" /eilen des oben hergestellten Inokulums in Kunstsloff-Petrisihalcn mit einem Durchmesser von 50 mm in 5 ml des oben verwendeten Kulturmediums unter entsprechenden Bedingungen inkubiert. Dies entspricht dem normalerweise verwendeten Monolayer-Verfahren zur Kultivierung von Zellen. Auch hierbei wird das Kulturmedium alle 3 bzw. 4 Tage vollständig ersetzt. Dus jeweils abgezogene Kulturmedium wird getrennt gewimmelt und zur Bestimmung des Instilingehaltes zurückgehalten, um eine Aussage über die Insulinsyntheseleistung der Zellen zu erhalten. Die Bestimmung des Insulingehaltes erfolgt unter Verwendung eines Radioimmuno-Assays für Insulin der Firma Νονό, Kopenhagen, wobei als Standard Katteninsulin verwendet wird.

Die Inkubation der Zellen erfolgt über 35 Tage. Die im Plattenmembran-System kultivierten Zellen zeigen über die gesamte Versuchszeit ein dreidimensionales, gewebeartiges Wachstum; in den Petrischale η hingegen das bckannterweise zweidimcnsionale Wachstum. Das Ergebnis für die Insulinsyntheselei-' stung der so kultivierten Zellen ist in Fig. 4 dargestellt, in der Kumulativkurven der Insulingehalte im Kulturmedium aufgezeigt sind, wobei die Insulinwerte auf gleiche inokulierte Zellzahlen berechnet wurden. Der Vorteil der Plattenniemhnin-Syslenie ist an Hand der wesentlich höheren Insuliitwerte zu erkennen.

H c is ρ ic I 2

Die allgemeine Prozedur des Beispiels I wird mit der Ausnahme wiederholt, daß das verwendete KuI-

' turmcdiuin im Kiilluriiiediumraiim einen Zusatz von nur 0,Vf Serum besitzt, im Gegensatz, zu Heispiel I unter Verwendung eines Kulturmediums mit einem Zusatz von üblicherweise ΙΟ'.'ί. Für die Kontrollen in !'einschulen wird wiederum ein Kulturmedium mil einem Zusatz >on ΙΟ','ί Serum \crweiulet. Die Inkubation der Zellen erfolgt über .'5 lage. Das Zellwachstum zeigt das gleiche wie unter Beispiel 1 beschriebene Bild. Das Ergebnis für die Insulinbiosyntheseleistung der so kultivierten Zellen ist entspre-

■ chend der unter Beispiel I beschriebenen Weise in Fig. 5 dargestellt. Zusätzlich ist die Kumulativkurve des unter Beispiel I beschriebenen Versuchs mit dargestellt. Aus ilen Kurven ist zu erkennen, daß eine Reduzierung des Serumgehaltes im Medium des KuI-

" turmediunirauines von üblicherweise \u^r/r auf 0,5 ^f'f keinen negativen Einfluß auf die Insulinsynthese-I.eistung tier in Plattenmembra:i-Systemen kultivierten Zellen hat, jciloi.li zu einer wesentlichen Reduzierung der Mediumkoslen führt.

Beispiel 3

Die allgemeine Prozedur des Beispiels I wird mit der Ausnahme wiederholt, daß das verwendete Medium im Kultuimediiimraum einen Zusatz von 0,5';

i" Serum hat. Weiterhin wird der Glukosegehalt von normalerweise I g/l auf 3 g/1 erhöht. Es ist hinlänglich bekannt, daß die Insulinsyntheseleistung der Zellen durch Erhöhung des Glukosegehaltes stimuliert werden kann. Die Inkubation der Zellen erfolgt über 35

ι' Tage. Das Zellwachstum zeigt das gleiche wie unter Beispie! 1 beschriebene Bild. Das Ergebnis für die Insulinsyntheseleistung der so kultivierten Zellen ist entsprechend tier unter Beispiel I beschriebenen Weise dargestellt. Zusätzlich ist die Kumulalivkurve

■" des unter Beispiel 2 beschriebenen Versuchs dargestellt. Aus Fig. 6 ist zu erkennen, daß die Insulinsynthcse-Leistung der Zellen durch Erhöhung des Glukosegehaltes im Kulturmedium erhöht und somit die Insulinausbeute wesentlich gesteigert werden kann.

Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur in-vitro-Biosynthese von Hormonen, insbesondere von Insulin, durch in-vitro-Erhaltung bzw. in-vitro-Vermehrung von Zellen aus Organen und Geweben tierischer oder menschlicher Herkunft in geeignetem Zellwachstum- und Zellerhaltungsbedingungen und Isolierung der gebildeten Substanz in an sich bekannter Weise aus dem Kulturmedium oder durch Aufarbeiten der Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man hormonproduzierende Zellen in einem oder mehreren durch semipermeable Flachmembranen von mindestens einem Kulturmedium raum getrennten Zellkulturräumen vermehrt bzw. erhält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturräume durch semipermeable Flachmembranen oben und unten von Kuüurmediumräumen getrennt sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturräume durch semipermeable Flachmembranen oben von einem Kulturmediumraum und unten von einem Gasraum getrennt sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium in einem Kreislaufsystem wiederholt in die Kulturmediumräume geleitet wird, wobei im Kreislauf ein Kulturmediumvorratsbehälter, Meß- und Steuerungsvoriichtungen sowie gegebenenfalls ein Oxygenator vorgesehen md.

5. Verfahren nach Anspruch ! bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das K lturmedium zur Gewinnung der über die Membranen abgegebenen Substanzen in einem kontinuierlichen Durchflußsystem einmal in die Kulturmediumräume geleitet wird.