DE68914412T2

DE68914412T2 - Methode, System und Apparat zur Züchtung von Zellen.

Info

Publication number: DE68914412T2
Application number: DE68914412T
Authority: DE
Inventors: Ryoichi Haga; Masahiko Ishida; Harumi Matsuzaki
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1988-11-30
Filing date: 1989-11-29
Publication date: 1994-08-25
Anticipated expiration: 2009-11-30
Also published as: EP0371783A3; EP0371783A2; US5166067A; JP2777385B2; JPH02150272A; EP0371783B1; DE68914412D1

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zum Züchten lebender Zellen, insbesondere Ausführungsbeispiele für Züchtung in großem Maßstab und mit hoher Konzentration, ein Züchtungssystem sowie einen Züchtungsapparat für lebende Zellen, der Suspensionszüchtung lebender Zellen in einem flüssigen Medium ausführt und Abfallkomponenten wirkungsvol beseitigt.
In jüngster Zeit sind zur bekannten Züchtung von Mikroorganismenzellen die Herstellung von monoklonalen Antikörpern und von Interferon durch die Züchtung von tierischen Zellen, sowie die Herstellung natürlicher Pigmente durch die Züchtung pflanzlicher Zellen hinzugetreten. Um derartige nützliche Stoffe auf industrieller Basis herzustellen, ist eine sogenannte "Züchtung hoher Dichte" erforderlich, durch die Zellen in großem Maßstab über lange Zeitspannen gezüchtet werden können, während sie stabil bei hoher Konzentration gehalten werden.
Nährstoffkomponenten werden verbraucht, während Abfallkomponenten (wie Laktat und dergleichen) während des Zellvermehrungsprozesses in einem Züchtungstank erzeugt werden. Wenn dieser Zustand andauern darf, wird die Vermehrung lebender Zellen behindert, und es wird keine Züchtung mit hoher Dichte erhalten. Daher ist eine sogenannte "Durchspülungszüchtung" wesentlich, die Zellen von der Kulturbouillon trennt und zellenfreie Abfallösung zur Außenseite des Systems befördert, unter Austausch durch frisches Medium.
Da eine Zelle eine Art Teilchen ist, deren spezifisches Gewicht größer als dasjenige des Mediums ist, wenden Durchspülungszüchtungsverfahren bisher bekannte Fest/Flüssig- Trenntechniken an. Als Zellentrennverfahren werden üblicherweise Sedimentationstrennung, Zentrifugaltrennung und Membranfiltrierung verwendet. Eine Membranfiltrierungsvorrichtung ist in einem Züchtungstank eines Züchtungsapparates angeordnet oder außerhalb des Züchtungsapparates. Dies ist z. B. in Scientific American 248 (1), S. 24 (1983) und in JP-B-102187/1985 beschrieben.
Unsere Anmeldung EP-A-336966, die in der Beziehung gemäß Artikel 54(3) EPÜ zum vorliegenden Fall steht, beschreibt Züchtungsverfahren, bei denen die Zellkulturlösung aus dem Züchtungstank über ein Membranfilter ausgefiltert wird, das periodisch durch eine Lösung rückgewaschen wird, um das Verstopfen zu verringern. Eine Blasenbeseitigungsschicht wird im Züchtungstank verwendet, um Schaum zu zerstören, wie er durch Gase (O&sub2; und CO&sub2;) erzeugt wird, die für optimale Züchtungsbedingungen in den Züchtungstank eingeblasen werden. Die Filtrierung kann innerhalb des Hauptzüchtungstanks oder getrennt von diesem erfolgen.
Untersuchungen der herkömmlichen Verfahren durch die Erfinder des vorliegenden Falls haben ergeben, daß dann, wenn eine Membranfiltriervorrichtung im Züchtungsapparat angeordnet wird, sich an der Membranfläche anhaftende Zellen vermehren und zu irreversiblem Verstopfen führen. Wenn die Züchtung einmal begonnen hat, ist das Austauschen der Filtriervorrichtung während des Züchtungsvorgangs nicht möglich. Auch ist das Vergrößern des Maßstabs des Apparates nur schwierig auszuführen, da die Struktur und Position der Filtriervorrichtung stark das Vermischen der Lösungen im Züchtungsapparat beeinflussen, wie auch die Zufuhr von Sauerstoff.
Die letzteren beiden Probleme können dadurch gelöst werden, daß die Filtriervorrichtung außerhalb des Hauptzüchtungstanks angeordnet wird, jedoch hat sich herausgestellt, daß dann, wenn die Filtriervorrichtung außerhalb des Züchtungsapparats angeordnet wird und einfaches Rückwaschen ausgeführt wird, es immer noch schwierig ist, eine Durchspülungszüchtung für eine lange Zeitspanne auszuführen, ohne daß es zu einem Verstopfen des Films kommt, insbesondere bei einer hohen Konzentration von 1 x 10&sup7; Zellen/ml oder mehr.
Es ist wünschenswert, neue Züchtungsverfahren und -vorrichtungen für Zellzüchtung anzugeben, die vorzugsweise Beschädigungen lebender Zellen ausschließen und die das Verseuchen der Kulturbouillon durch Bakterien vermeiden können.
Gemäß einer Erscheinungsform gibt die Erfindung ein Verfahren zum Züchten lebender Zellen an, bei dem Zellen in einer Kulturbouillon in einer Züchtungskammer gezüchtet werden, welches Verfahren folgendes aufweist:
- Entnehmen von Zellkulturbouillon aus dem Züchtungsgefäß in eine Filtriervorrichtung mit einer Mikrofiltriermembran;
- Mikrofiltern der Zellkulturbouillon durch die Mikrofiltriermembran, während die eingetauchte Fläche der Membran mit einem Gas in Berührung gebracht wird, das für die Zellen ungiftig ist;
- Verwenden einer hydrophoben Entschäumungsschicht an der Flüssigkeitsoberfläche, um Blasen zu zerreißen und dadurch das Ausbilden von Schaum zu verhindern; und
- Rückführen von Zellen in das Züchtungsgefäß nach der Mikrofiltrierung, und Entnehmen von Filtrat aus der Kultur.
In einer anderen Erscheinungsform gibt die Erfindung eine Vorrichtung für Zellzüchtung an, mit:
(a) einem Züchtungsgefäß zum Aufnehmen einer Kulturbouillon, in der Zellen in suspendiertem Zustand gezüchtet werden;
(b) einer Filtriervorrichtung mit einer Mikrofiltriermembran;
(c) einer Einrichtung zum Übertragen von Kulturbouillon vom Züchtungsgefäß in die Filtriervorrichtung ;
(d) einer Einrichtung zum Einblasen eines Gases in die Kulturbouillon in der Filtriervorrichtung, um es in Berührung mit der Mikrofiltriermembran zu bringen;
(e) einer Einrichtung zum Verhindern von Schaumbildung auf der Oberfläche der Kulturbouillon;
(f) einer Einrichtung zum Rückführen von Zellen von der Filtriervorrichtung in das Züchtungsgefäß; und
(g) einer Einrichtung zum Entnehmen von Filtrat aus der Filtriervorrichtung.
Die Fig. 1 und 2 sind schematische Darstellungen von Züchtungssystemen gemäß Ausführungsbeispielen der Erfindung.
Ein Merkmal des aktuellen Prozesses liegt darin, daß eine Kulturbouillon in einem Züchtungsapparat zur Außenseite des Apparates entnommen wird und die entnommene Kulturbouillon einer Filtrierung unter Verwendung einer Filtriermembran unterzogen wird, während ein für die Zellen nichtgiftiges Gas unter erniedrigtem Druck in Berührung mit der Membran steht, so daß die Zellen von der Flüssigkeit getrennt werden und in den Züchtungsapparat rückgeführt werden. Da die Filtrierung erfolgt, während sich das Gas in Berührung mit der Membranfläche befindet, ist das Verstopfen der Filtriermembran aufgrund von Zellvermehrung auf der Membranfläche minimiert. Wenn das Gas nicht in Berührung mit der Membranfläche gebracht wird, vermehren sich die an der Membranfläche anhaftenden Zellen und verstopfen die Poren der Membran, so daß der Druckverlust drastisch ansteigt und ein Filtrieren unmöglich wird.
Proteinhaltige Schäume, die nur schwierig abgebaut werden können und die sich auf der Flüssigkeitsoberfläche durch das in die Flüssigkeit eingeblasene Gas bilden, werden wirkungsvoll durch eine Entschäumungsschicht aus einem hydrophoben Material aufgebrochen, so daß der Filtrierprozeß fortgesetzt werden kann. Zusätzlich zu Proteinen wie Serum und Albumin im Medium enthält die Kulturbouillon Proteine, die von den Zellen ausgeschieden werden. Daher wäre das Einblasen von Gas in die Bouillon ohne Schaumbildung auf andere Weise fast unmöglich.
Neben einer äußeren rohrförmigen Membran für Mikrofiltrierung kann eine innere rohrförmige Membran für Ultrafiltrierung in der äußeren rohrförmigen Membran angeordnet sein, um eine zweischichtige Membran mit einem Spalt zwischen den Membranen auszubilden. Der Druck an der Innenfläche der Ultrafiltriermembran wird auf dem Wert des Drucks an der Innenfläche der Mikrofiltriermembran, oder in dessen Nähe, gehalten, um ein Filtrat mit niedrigem Molekulargewicht nur dann zu entnehmen, wenn sich der Druck an der Ultrafiltriermembran erniedrigt. Das Filtrat mit geringem Molekulargewicht und ein Filtrat mit einem Polymeren können voneinander getrennt werden, wenn die Drücke in der Ultrafiltriermembran und der Mikrofiltriermembran erniedrigt werden. Zum Rückwaschen wird eine Nährlösung mit geringem Molekulargewicht nur der Innenfläche der Ultrafiltriermembran oder den Innenflächen beider Membranen zugeführt. Durch diese Anordnung können Abfallkomponenten mit geringem Molekulargewicht insgesamt durch einen einzigen Filtrierapparat beseitigt werden, und das Rückwaschen beider Filme kann gleichzeitig erfolgen. Ferner ist es möglich, Serum und von Zellen abgeschiedene Wachstumsfaktoren rückzugewinnen und wiederzuverwenden. Wenn zwischen den zwei Membranen ein Spalt vorhanden ist, kann die Mikrofiltriermembran von der Innenseite rückgewaschen und gleichzeitig und wirkungsvoll regeneriert werden.
Irgendeine drastische Zunahme der Zellenkonzentration im Filtrierapparat wird durch Filtern einer Kulturbouillon verhindert, die in den Filtrierapparat strömt, und dann wird die durch das Rückwaschen erzeugte konzentrierte Suspension der Zellen in den Züchtungstank rückgeleitet.
Wenn der Boden des Filtrierapparats und der Züchtungstank über eine Leitungsanordnung miteinander verbunden sind und Gas in das Filtriergerät von einer am Boden desselben angeordneten Verteilereinrichtung eingeblasen wird, ist es auch möglich, nicht nur das Anhaften von Zellen an der Membranfläche und ihre Vermehrung an derselben und innerhalb der Membranmatrix zu vermeiden, sondern es ist auch möglich, die Suspension durch einen Gasanhebeeffekt im Filtrierapparat in den Züchtungstank rückzuführen und die Kulturbouillon im Züchtungstank in den Filtrierapparat zu führen. Demgemäß ist es möglich, den Anstieg der Zellkonzentration zum Zeitpunkt der Filtrierung zu verringern und die Lebensdauer der Filtriermembran zu verlängern, wie auch ein Zellaggregat in den Züchtungstank rückzuführen, das zum Zeitpunkt der Filmfiltrierung auftritt. In diesem Fall steigt das in den Filtrierapparat eingeleitete Gas vom Boden des Züchtungstanks her auf und bildet an der Flüssigkeitsoberfläche im Züchtungstank Blasen. Daher ist die Entschäumungsschicht (vom selben Typ wie oben für den Filtrierapparat angegeben) an der Flüssigkeitsoberfläche im Züchtungstank angeordnet. Neben den oben beschriebenen Maßnahmen sind zwei Leitungsanordnungen zum Verbinden des Filtrierapparats und des Züchtungsapparats vorhanden, von denen eine zum Übertragen der Kulturbouillon vom Züchtungstank zum Zeitpunkt der Filtrierung in den Filtrierapparat dient. In die andere Leitungsanordnung sind ein Ventil und eine Pumpe eingefügt, wodurch die Kulturbouillon im Züchtungstank mit linearer Geschwindigkeit von mindestens 2 cm/sec und einem Volumen von mindestens 50 % der eingefüllten Lösungsmenge des Filtrierapparates zum Zeitpunkt des Rückwaschens der Membran oder nach dem Rückwaschen dem Boden des Filtrierapparats zugeführt wird. Die konzentrierte Suspension von Zellen, wie sie zum Zeitpunkt des Rückwaschens auftritt, wird in den Züchtungstank rückgeleitet.
Für die lebenden Zellen, auf die die Erfindung angewandt werden kann, besteht keine besondere Beschränkung, und es gehören hierzu tierische Zellen, Pflanzenzellen und Mikroorganismenzellen. Zu tierischen Zellen gehören z. B. verschiedene Zellen von Wirbeltieren und Wirbel losen. Die Zellen müssen nicht nur Einzelzellen sein, sondern es können auch Zellaggregate sein.
Zu Pflanzenzellen gehören die Zellen und Zellaggregate höherer Pflanzen sowie die Zellen und Zellaggregate von Algen.
Für das Züchtungsverfahren und für die Züchtungsvorrichtung für das Verfahren besteht ebenfalls keine besondere Beschränkung, jedoch sind sie insbesondere für Zellen in suspendiertem Zustand geeignet. Im Fall einer Suspensionskultur, in der Zellen auf Trägern wie Mikroperlen und Gelteilchen zum Ruhigstellen der Zellen gehalten werden, sind viele Zellen vorhanden, die von den Trägerteilchen abfallen, und die Zellen sind in der Lösung suspendiert. Demgemäß werden diese Züchtungsverfahren, die Bedingungen, die Züchtungsvorrichtungen (Züchtungstanks) usw. abhängig von den verwendeten Zellen, dem Ziel der Züchtung, dem Umfang und dem Steuerungsverfahren ausgewählt. Insbesondere werden die Temperatur, der pH-Wert, die Konzentration gelösten Sauerstoffs, die Konzentration von Kohlendioxid, das Redoxpotential usw. geeignet abhängig vom beabsichtigten Ziel eingestellt.
Membranen mit einem Porendurchmesser, der sich dazu eignet, die ins Auge gefaßten Zellen zu trennen, werden geeignet gewählt. Der Porendurchmesser beträgt vorzugsweise 5 um bis 0,5 um. Bekannte Materialien wie Acetylzellulose oder Polytetrafluorethylen können als Membranmaterial geeigneterweise verwendet werden. Obwohl die Form der Membran geeignet gewählt werden kann, ist ein hohler Fasermodul als Beispiel dafür geeignet, die Oberfläche der Membran zu erhöhen und eine Öffnung für Flüssigkeitsübertragung zu schaffen. Filtrat kann geeigneterweise dadurch entnommen werden, daß die beiden Enden mehrerer hohler Fasern dadurch zusammengefaßt werden, daß beide Enden zum Ausbilden einer Schleife zusammengeführt werden und das Filtrat an einer geeigneten Position der Schleife entnommen wird oder daß eines der Enden verschlossen wird und die anderen Enden aller hohlen Fasern zusammengefaßt werden, um das Filtrat den gebündelten Röhrchen zu entnehmen.
Filtrierung unter verringertem Druck wird üblicherweise bei einem Filtriersystem verwendet. Wenn Filtrierung unter erhöhtem Druck verwendet wird, muß ein pH-Abfall aufgrund der Lösung von Kohlendioxidgas in der Lösung berücksichtigt werden wie auch eine Beschädigung zerbrechlicher Zellen. Für die Richtung der Membranfläche innerhalb des Filtrierapparates besteht keine besondere Beschränkung, und die Anordnung und Struktur werden so gewählt, daß die Blasen wirkungsvoll in Berührung mit der Membranfläche kommen. Z. B. kann die Richtung der hohlen Fasern entweder vertikal oder horizontal sein. Auch für das Gasströmungsverfahren besteht keine besondere Beschränkung, jedoch ist ein Fluß von mindestens 0,1 ml/min pro cm² Oberfläche der Membran erforderlich. Der Durchmesser der Blasen wird z. B. geeignet auf 1 bis 10 mm gewählt. Das einzublasende Gas wird geeignet aus solchen ausgewählt, die für die Zellen nicht giftig sind. Beispiele sind Stickstoff, Argon und Luft. Der Filtrierdruck wird geeignet abhängig vom Material, der Lösung, der Zellkonzentration, den Betriebsbedingungen und dergleichen gewählt, und er beträgt geeignet von 0,01 - 5 kg/cm².
Das Beseitigen der Schäume auf der Flüssigkeitsoberfläche erfolgt durch die auf derselben angeordnete Entschäumschicht. Die Entschäumschicht weist eine große Anzahl von Öffnungen auf, durch die Gas hindurchtreten kann. Das Öffnungsverhältnis beträgt vorzugsweise mindestens 50 %, und der Durchmesser der Öffnungen beträgt vorzugsweise 2 bis 50 mm. Mindestens die Oberfläche der Entschäumschicht besteht aus einem hydrophoben Material, das einen Kontaktwinkel von mindestens 80º zur Zellkulturlösung oder zur Flüssigkeit des Mediums bildet. Ein geeignetes Beispiel ist ein organisches Polymer aus Silan oder Siloxan mit einer Kohlenstoffanzahl von mindestens 10. Obwohl die Entschäumschicht als einzelne Schicht oder als Mehrfachschicht verwendet werden kann, ist die letztere angesichts des Abfalls der Wasserabstoßung der hydrophoben Fläche aufgrund der Abscheidung von Zellen beim Betrieb über eine lange Zeitspanne bevorzugt. Der Abfall der Wasserabstoßung der Entschäumschicht kann dadurch beseitigt werden, daß die Oberfläche mit dem Züchtungsfiltrat, dem Medium oder der Kulturbouillon gewaschen wird.
Wie oben beschrieben, wird die Kulturbouillon innerhalb der Vorrichtung nach außen hin entnommen, Gas wird in Kontakt mit der Filtriermembran gebracht, das in die so entnommene Kulturbouillon eingetaucht wurde, und Filtrierung unter erniedrigtem Druck wird ausgeführt, um die Zellen abzutrennen und sie in die Züchtungsvorrichtung rückzuführen. Wenn Filtrierung ohne die Berührung mit dem Gas ausgeführt wird, vermehren sich die in die Membranmatrix eintretenden und an dieser anhaftenden Zellen allmählich und verstopfen die Poren der Membran. Dieses Verstopfen schreitet irreversibel fort, selbst wenn ein Rückwaschen unter Verwendung des flüssigen Züchtungsmediums oder dergleichen als Waschlösung ausgeführt wird. Der Druckabfall beim Filtrieren nimmt drastisch zu, und schließlich wird Filtrierung unmöglich. Es besteht die Wahrscheinlichkeit, daß tierische Zellen an der Membran oder an anderen Zellen anhaften, was zum Verstopfen der Membran führt. Wenn die Filtrierung dagegen ausgeführt wird, während Gas in Berührung mit der Membran gebracht wird, können das Anhaften von Zellen an der Membranfläche und die Vermehrung von Zellen auf der Fläche und in der Matrix völlig verhindert werden, so daß ein Verstopfen der Membran verhindert werden kann. Wenn Filtrierung und Rückwaschen zyklisch ausgeführt werden, können die Regenerierung und die Verwendung der Membran demgemäß über eine Zeitspanne bis zu einem Monat oder mehr vorgenommen werden.
Nachfolgend wird die Erfindung im Detail unter Bezugnahme auf Ausführungsbeispiele derselben beschrieben.

Beispiel 1:

Durchspülungszüchtung tierischer Zellen wurde unter Verwendung des in Fig. 1 dargestellten Züchtungssystems ausgeführt.
Vor der Züchtung wurde jedem Tank im System und jeder Leitungsanordnung Dampf zugeführt, um sie zur Sterilisierung für mindestens 30 Minuten auf 125ºC aufzuheizen. Bei Bedingungen frei von Mikroorganismen wurde ein Medium mit der folgenden Zusammensetzung in einen Mediumtank 11 eingeführt:
- Eagle MEM Medium (ein Produkt der Nissui Seiyaku K.K., Eagle MEM Nissui ) 9,4 g/l
Glutamin 0,92 g/l
7,5 %-ige wässrige Lösung von Natriumhydrocarbonat 20 ml/l
Glukose 20 g/l
Rinderserum 100 ml/l
Rattenleberkrebszellen JTC-1 (Japan Tissue Culture Nr. 1) wurde als Impfzelle verwendet. Eine Suspension der für die Kultur verwendeten Impfzellen wurde auf die folgende Weise hergestellt.
Fünf Milliliter des oben angegebenen Mediums wurden in jeweils einen von 15 ebenen Kolben mit einem Fassungsvermögen von 20 ml eingefüllt, und der oben angegebene Stamm JTC-1 wurde eingeimpft, und es wurde dafür gesorgt, daß die Kultur mit einer Konzentration von 1 x 10¹&sup5; Zellen/ml eingestellt wurde. Nach Züchtung über drei Tage wurden die an der Innenfläche des Kolbens anhaftenden Zellen abgelöst und mit den in der Lösung suspendierten Zellen zusammengeführt, um 75 ml der Zellkulturlösung mit einer Zellkonzentration von 4,0 x 10&sup5; Zellen/ml zu erhalten. Diese Zellkulturlösung wurde bei mikroorganismenfreien Bedingungen unterteilt in ein Zentrifugierröhrchen eingefüllt, das bei mikroorganismenfreien Bedingungen behandelt wurde, und die Zellen wurden durch eine offene Zentrifuge vom Suspensionstyp gewonnen. Die Zellen wurden in zwei Walzenflaschen von 1 l Fassungvermögen mit 75 ml des Mediums eingefüllt und für drei Tage bei 37ºC gezüchtet. Dieser Vorgang wurde mehrfach wiederholt, um die Menge der Kulturbouillon zu erhöhen, um 2 l der Kulturbouillon mit einer Konzentration von 1,0 x 10&sup5; Zellen/ml zu erhalten. Die Zellen werden aus dieser Kulturbouillon auf die oben beschriebene Weise gewonnen und in 500 ml des Mediums suspendiert, um die Impfzellensuspension zu erhalten.
Innerhalb des Züchtungssystems sind ein Membranfilterapparat 6, ein Züchtungsgefäß 1, ein Mediumtank 11 und ein Kulturfiltrattank 13 über Leitungsanordnungen 24, 25, 26 und 29 für Flüssigkeitsübertragung miteinander verbunden. Ein Ventil und eine Flüssigkeitsförderpumpe in jeder Leitungsanordnung für Flüssigkeitsübertragung sind mit einer Prozeßfolgesteuerung 10 verbunden.
Der Züchtungstank weist ein effektives Fassungsvermögen von 5 l auf und besteht aus rostfreiem Stahl. Die Temperatur, der pH-Wert und der DO-Wert wie auch ein Rührer 3 werden automatisch eingestellt. Sauerstoff wird der Flüssigkeitsoberfläche des Züchtungstanks mit einem Überlagerungsverfahren von einem Kompressor 4 über eine Luftförder-Leitungsanordnung 28 durch ein Luftfilter 5 zugeführt. Sauerstoff wird durch Diffusion ausgehend von der Flüssigkeitsoberfläche gelöst und stellt den gelösten Sauerstoff, wie er für die Vermehrung der Zellen erforderlich ist.
Nachdem 4,5 l des Mediums, das dasselbe ist, wie bei der Impfkultur verwendet, unter mikroorganismenfreien Bedingungen in die dampfbehandelte Züchtungsvorrichtung eingeleitet waren, wurden 0,5 l der oben beschriebenen Impfzellösung in das Medium eingeimpft, um die Zellenkonzentration auf 4,1 x 10&sup5; Zellen/ml einzustellen. Während mikrobenfreie Luft mit einer Rate von 10 - 30 l/min von der Seitenwand des Tanks her auf die Flüssigkeitsoberfläche eingeblasen wurde, wurde die Züchtung mit einer Rührgeschwindigkeit von 20 U/min, 37ºC und einem pH-Wert von 7,0 - 7,6 ausgeführt. Die Strömungsgeschwindigkeit der Luft wurde automatisch so eingestellt, daß die Konzentration des gelösten Sauerstoffs (DO = Dissolved Oxygen Concentration) in der Zellkulturlösung 1 ppm wurde.
Ein Liter der Kulturbouillon 2 wurde dadurch in den Filtrierapparat 6 übertragen, daß das Ventil 20 geöffnet wurde und die Pumpe 16 betätigt wurde. Der Filtrierapparat 6 weist ein effektives Volumen von 1,3 l auf und besteht aus rostfreiem Stahl. Ein Hohlfasermodul mit einer Mikrofiltriermembran 7 wird in der Kulturbouillon angeordnet. Fünf Hohlfasermembranen, die aus Tetrafluorethylen bestehen, einen Außendurchmesser von 2 mm, einen Innendurchmesser von 1 mm und einen Porendurchmesser von 0,8 um aufweisen und 1 m lang sind, werden nebeneinanderliegend angeordnet, und beide Enden werden zu einer gemeinsamen Rohranordnung zusammengeführt. Ferner werden beide Rohranordnungen über eine Mediumförder-Leitungsanordnung 25 mit dem Mediumtank 11 verbunden, und sie werden mit dem Züchtungsfiltrattank 13 durch eine Züchtungsfiltratförder-Leitungsanordnung 26 verbunden. Eine Verteilereinrichtung 9 (Durchmesser 30 mm; Spritzrad; 10 Löcher mit einem Durchmesser von 1 mm) wird am Boden des Filtrierapparats 6 so angeordnet, daß Stickstoffgasblasen in Berührung mit der Mikrofiltriermembran 7 ausgehend von einem Drucktank 15 über eine Gasförder-Leitungsanordnung 27 gebracht werden können. Eine Entschäumschicht 8 ist auf der Flüssigkeitsoberfläche angeordnet. Die Entschäumschicht 8 ist ein Netz aus rostfreiem Stahl (Länge der Seite einer Masche: 3 mm), mit einer rechteckigen Maschenöffnung und mit einer dünnen Beschichtung eines silanartigen, organischen Polymeren (Viskosität: 1 x 10&sup5; cps) auf der Oberfläche. Eine Leitungsanordnung 29 ist am Boden des Tanks angeordnet, um die nach dem Filtrieren und Rückwaschen erhaltene Zellensuspension in das Züchtungsgefäß rückzuleiten.
Stickstoffgas wurde von der Verteilervorrichtung mit einer Rate von 100 ml/min in der in den Filtrierapparat 6 eingeleiteten Kulturbouillon 2 zur Mikrofiltriermembran geblasen, und die sich ergebenden Schäume wurden durch die Entschäumungsschicht aufgebrochen. Durch die Pumpe 19 wurde ein Filtrat 14 entnommen und an den Filtratspeichertank 13 übertragen. Die Filtriergeschwindigkeit wurde auf 0,5 l/h eingestellt, und der Filtriervorgang wurde beendet, wenn die Filtratmenge 0,5 l erreichte.
Nachfolgend wurden 0,5 l frisches Medium 12 in den Mediumtank 11 unter Druck als Rückwaschlösung in die Mikrofiltriermembran 7 mit einer Rate von 3 l/h über die Leitungsanordnung 25 eingespeist. Die sich ergebende Zellensuspension wurde durch die Pumpe 17 über die Leitungsanordnung 29 in das Züchtungsgefäß 1 rückgeführt. Dieser Prozeß wurde mit 10 Zyklen/Tag ausgeführt und die Züchtung wurde für 30 Tage fortgesetzt. Die Konzentration lebensfähiger Zellen und das Überlebensverhältnis im Züchtungsgefäß 1 sowie der Druckverlust zum Zeitpunkt der Filtrierung sind für diesen Fall in der untenstehenden Tabelle 1 aufgelistet.
Da das Überlebensverhältnis (lebensfähige Zellen/Gesamtzellen x 100) der Zellen während der Züchtung bis zu 90 % oder mehr betrug und da der Druckverlust bei der Membranfiltrierung nicht anstieg, ist ersichtlich, daß mit dem System wirkungsvoll Zellen ohne Verstopfung der Membran gezüchtet werden konnten. Tabelle 1 Züchtungstage (Tage) Einzelpunkt Konzentration lebensfähiger Zellen (x 10&sup5; Zellen/ml) Überlebensverhältnis (%) Druckabfall zum Zeitpunkt der Filtrierung (kg/cm²)

Beispiel 2:

Durchspülungszüchtung von tierischen Zellen wurde unter Verwendung eines Züchtungssystems ausgeführt, bei dem Medium und tierischen Zellen derselben Art wie beim Beispiel 1 verwendet wurden. Eine Zellensuspension, die durch Zentrifugieren von 2 l einer Kulturbouillon von 1,0 x 10&sup6; Zellen/ml und durch Suspendieren der Zellen im Medium auf dieselbe Weise wie beim Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde als Zellenimpfsuspension verwendet.
Bei diesem Züchtungssystem ist eine Mediumsprühdüse zum Waschen der Entschäumungsschicht 8 dem oberen Teil derselben im Filtrierapparat 6 des in Beispiel 1 verwendeten Systems hinzugefügt. Die Sprühdüse ist vom selben Typ wie die Verteilereinrichtung 9.
Während dieselbe Menge des Mediums wie die Filtratmenge zum Rückwaschen im Beispiel 1 verwendet wurde, wurden bei diesem Beispiel 480 ml zum Rückwaschen verwendet. Das Medium wurde auch zum Waschen der Entschäumungsschicht (400 ml/min, 0,5 min) einmal pro Tag verwendet.
Die Züchtung wurde auf dieselbe Weise und mit denselben Betriebsbedingungen wie beim Beispiel 1 ausgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 aufgelistet. Die Zellen zeigten im wesentlichen denselben Vermehrungstyp wie beim Beispiel 1, mit hohem Überlebensverhältnis. Tabelle 2 Züchtungstage (Tage) Einzelpunkt Konzentration lebensfäbiger Zellen (x 10&sup5; Zellen/ml) Überlebensverhältnis (%) Druckabfall zum Zeitpunkt der Filtrierung (kg/cm²)

Beispiel 3:

Durchspülungszüchtung tierischer Zellen wurde unter Verwendung eines Züchtungssystems ausgeführt, bei dem dasselbe Medium und die tierischen Zellen aus demselben Stamm wie beim Beispiel 1 verwendet wurden. Als Zellenimpflösung wurden zwei l einer Kulturbouillon mit einer Konzentration von 1,0 x 10&sup6; Zellen/ ml, die mit denselben Betriebsbedingungen wie beim Beispiel 1 hergestellt wurde, zum Abtrennen der Zellen zentrifugiert. Eine Zellenimpfsuspension wurde dadurch hergestellt, daß die sich ergebenden Zellen mit Medium suspendiert wurden.
Die Züchtungsvorrichtung war dieselbe wie das System des Beispiels 1, mit der Ausnahme, daß ein Ende jeder hohlen Faser der Mikrofiltriermembran 7 im Filtrierapparat 6 geschlossen war und die anderen Enden der hohlen Fasern zusammengefaßt und mit der Leitungsanordnung verbunden wurden. Die Züchtung wurde auf dieselbe Weise und unter denselben Bedingungen wie beim Beispiel 1 ausgeführt. Die Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle 3 aufgelistet. Es wurde im wesentlichen dieselbe Vermehrung wie beim Beispiel 1 beobachtet, mit hohem Überlebensverhältnis. Tabelle 3 Züchtungstage (Tage) Einzelpunkt Konzentration lebensfähiger Zellen (x 10&sup5; Zellen/ml) Überlensverhältnis (%) Druckabfall zum Zeitpunkt der Filtrierung (kg/cm²)

Beispiel 4:

Durchspülungszüchtung von tierischen Zellen wurde mit einem Züchtungssystem ausgeführt, bei dem dasselbe Medium und die tierischen Zellen desselben Stamms wie beim Beispiel 1 verwendet wurden. Jedoch wurde Serum auf 4,5 l des Mediums zu Beginn der Züchtung mit 10 %-iger Konzentration zugesetzt, während dem Medium nach Beginn der Züchtung nichts zugesetzt wurde. Eine Zellenimpfsuspension wurde durch Zentrifugieren von 2 l der Kulturbouillon mit einer Konzentration von 1,0 x 10&sup6; Zellen/ml, die mit denselben Betriebsbedingungen wie beim Beispiel 1 hergestellt wurde, und durch Suspendieren der so im Medium abgetrennten Zellen hergestellt.
Bei diesem Züchtungssystem war die Filtriermembran des Filtrierapparats 6 eine doppelschichtige Hohlfasermembran, die durch Anordnen ultrafeiner Membranen (nicht dargestellt) innerhalb der Mikrofiltriermembranen mit einem dazwischenliegenden Spalt zwischen den Membranen ausgebildet wurden. Während des Filtrierens wurde der Druck an der Innenseite der Ultrafiltriermembran auf einem Wert unter demjenigen der Innenfläche der Mikrofiltriermembran gehalten, so daß ein Filtrat mit geringem Molekulargewicht an der Innenseite der Ultrafiltriermembran abgenommen werden konnte, und ein Filtrat mit Polymeren wurde getrennt davon zwischen der Mikrofiltriermembran 7 und der Ultrafiltriermembran abgezogen. Das Filtrat mit niedrigem Molekulargewicht wurde in den Tank 13 für Filtrat mit geringem Molekulargewicht rückgeführt, während das Polymer enthaltende Filtrat durch eine (nicht- dargestellte) Pumpe durch eine mit derselben verbundene Leitungsanordnung in das Züchtungsgefäß 1 rückgeführt wurde. Die Mikrofiltriermembran wies die folgende Struktur auf: eine hohle Faser aus demselben Material wie beim Beispiel 1, mit einem Außendurchmesser von 3 mm, einem Innendurchmesser von 2 mm und derselben Länge. Eine Hohlfasermembran für Ultrafiltrierung (Porendurchmesser: 6000 Dalton) aus Acetylzellulose und einem Außendurchmesser von 1 mm und einem Innendurchmesser von 0,5 mm wurde in die oben beschriebene hohle Faser eingeführt, um ein hohles Doppelschichtrohr zu bilden. Beide Enden der Filme wurden zur selben Abflußöffnung geführt, um beide Filtrate getrennt abzuziehen. Die Entnahmerate für das Filtrat mit niedrigem Molekulargewicht wurde auf 0,45 l/h eingestellt, während die Rückführrate für das Polymer enthaltende Filtrat auf 0,05 l/h eingestellt wurde. Wenn die Summe beider Filtrate 0,5 l erreichte, wurde der Filtriervorgang angehalten. Die Züchtung wurde genau auf dieselbe Weise wie beim Beispiel 1 für 30 Tage fortgeführt. Tabelle 4 zeigt die Konzentration der lebenden Zellen, das Überlebensverhältnis und den Druckverlust zum Zeitpunkt des Filtriervorgangs.
Es wurde eine hohe Zellenkonzentration erreicht, während wie bei den Beispielen mit den Nummern 1 bis 3 ein hohes Überlebensverhältnis beibehalten wurde. Die Konzentration lebensfähiger Zellen war höher als in den vorstehenden Beispielen, da von den Zellen abgeschiedene polymere Wachstumsfaktoren rückgewonnen wurden. Tabelle 4 Züchtunhgstage (Tage) Einzelpunkt Konzentration lebensfähiger Zellen (x 10 &sup5; Zellen/ml) Überlebensverhältnis (%) Druckabfall zum Zeitpunkt der Filtrierung (kg/m²) *: Druckverlust zwischen dem Innendruck des Ultrafiltrierfilms und dem Außendruck des Mikrofiltrierfilms

Vergleichsbeispiel 1:

Die Züchtung des Stamms JTC-1 wurde unter Verwendung eines Züchtungssystems ausgeführt, bei dem eine Zellenimpfsuspension auf dieselbe Weise wie beim Beispiel 1 hergestellt wurde und das Medium dieselbe Zusammensetzung wie beim Beispiel 1 aufwies.
Dieses Züchtungssystem wurde dadurch hergestellt, daß die Verteilungseinrichtung 9 und die Entschäumungsschicht 8 des Filtrier/Trenn-Apparats des Systems des Beispiels 1 entfernt wurden und ein Rührblatt 3 zum Rühren der Suspension hinzugefügt wurde. Das Betriebsverfahren war ansonsten dasselbe wie bei den Beispielen der Erfindung.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgelistet. Im Vergleich zu den Beispielen 1 - 4 trat Verstopfung leichter auf, der Druckverlust stieg stark an, und die Züchtung kam am zwanzigsten Tag zum Ende. Sowohl die Konzentration lebensfähiger Zellen als auch das Überlebensverhältnis waren kleiner als bei den Beispielen, und zwar aufgrund von Zellaggregationen an den Membranen. Tabelle 5 Züchtungstage (Tage) Einzelpunkt Konzentration lebensfähiger Zellen (x 10&sup5; Zellen/ml) Überlebensverhältnis (%) Druckabfall zum Zeitpunkt der Filtrierung (kg/cm²) *: Beendigung der Züchtung

Beispiel 5:

Durchspülungszüchtung tierischer Zellen wurde unter Verwendung des in Fig. 2 dargestellten Züchtungssystems ausgeführt. Dieses System unterschied sich von dem beim Beispiel 1 verwendeten Züchtungssystem gemäß Fig. 1 in den folgenden Punkten.
1) Der Filtrierapparat wurde unterhalb des Züchtungstanks angeordnet. Der obere Teil des Filtrierapparats stand mit dem Tankboden über eine Förderleitungsanordnung 40 so in Verbindung, daß Kulturbouillon im Filtrierapparat dem Züchtungstank durch einen Gashebeeffekt aufgrund des Gases rückgeführt werden konnte, das am Boden des Filtrierapparates aussprüht. Das Volumen des Filtrierapparates war dasselbe, jedoch waren sein oberer und unterer Endabschnitt abgeschrägt, um übergangslos eine ansteigende Strömung der Lösung zu bewirken.
2) Im Filtrierapparat wurde keine Entschäumungsschicht angeordnet, jedoch wurde eine Entschäumungsschicht derselben Art wie oben angegeben auf der Flüssigkeitsfläche im Züchtungstank angeordnet.
3) Die Zufuhr von Sauerstoff zum Züchtungstank wurde gegenüber dem Überlagerungssystem von Fig. 1 auf ein System geändert, das das Gas von einer am Boden des Tanks angeordneten Verteilungseinrichtung in die Bouillon bläst.
Das Züchtungssystem von Fig. 2 wurde auf dieselbe Weise wie beim Beispiel 1 mit Dampf sterilisiert, und 4,5 l eines Mediums derselben Art wurde in den Züchtungstank und den Filtrierapparat eingeleitet. Nachfolgend wurden 0,5 l der auf dieselbe Weise wie beim Beispiel 1 hergestellten Zellenimpfsuspension frischem Medium zugeimpft, um eine Zellenkonzentration von 3,9 x 10&sup5; Zellen/ml zu erhalten. Mikrobenfreie Luft wurde mit einer Strömungsrate von 10 - 30 l/min von der Verteilereinrichtung am Boden des Züchtungstanks eingeblasen, und während die sich an der Flüssigkeitsoberfläche bildenden Blasen durch die Entschäumungsschicht zerrissen wurde, wurde ein Züchtungsvorgang bei einer Rührgeschwindigkeit von 20 U/min, bei 37ºC und einem pH-Wert von 7,0 - 7,6 ausgeführt. Die Strömungsrate wurde so eingestellt, daß die Konzentration gelösten Sauerstoffs (DO) in der Kulturbouillon 1 ppm erreichte.
Während des Filtriervorgangs wurde das Ventil 20 geöffnet, und es bildete sich eine umlaufende Strömung durch das Aufsteigen des Gases von der unter dem Filtrierapparat angeordneten Verteilereinrichtung 9 aus. Das Rückwaschen der Membran erfolgte mit 10 Zyklen pro Tag auf dieselbe Weise wie beim Beispiel 1, und die Züchtung wurde für 31 Tage fortgeführt. In diesem Fall waren die Konzentration lebender Zellen und das Überlebensverhältnis in der Züchtungsvorrichtung 1 abgesenkt, und es fand ein beträchtlicher Druckverlust zum Zeitpunkt der Filtrierung statt. Der Verlust trat auf, weil die Kulturbouillon während der Filtrierung dauernd zugeführt wurde und dauernd vom Züchtungstank zum Filtriertank durch den Kontakt von Blasen mit der Membran und durch das aufsteigende Gas umgewälzt wurde. Tabelle 6 Züchtungstage (Tage) Einzelpunkt Konzentration lebensfähiger Zellen (x 10&sup5; Zellen/ml Überlebensverhaltnis (%) Druckabfall zum Zeitpunkt der Filtrierung (kg/cm²)

Beispiel 6:

Durchspülungszüchtung tierischer Zellen wurde unter Verwendung des Züchtungssystems ausgeführt. In diesem System wurde eine Flüssigkeitsförder-Leitungsanordnung entsprechend einer Umgehungsleitung zum Züchtungssystem von Beispiel 5 neben der Flüssigkeitsförderleitung zum Verbinden des Züchtungstanks 1 und dem Boden des Filtrierapparats 6 hinzugefügt. Ein Ventil und eine Pumpe wurden in dieser Leitungsanordnung angeordnet, und sie wurden dazu verwendet, die konzentrierte Zellensuspension im Filtrierapparat nach dem Rückwaschen zwangsweise in den Züchtungstank rückzuführen. In diesem Fall betrug die Rate zum Rückführen der Zellensuspension zum Züchtungstank 200 ml/min über 2 Minuten. Der Prozeß der Filtrierung und des Rückwaschens wurde regelmäßig mit 10 Zyklen pro Tag ausgeführt, auf dieselbe Weise wie beim Beispiel 1, und die Züchtung wurde über 30 Tage fortgeführt. Tabelle 7 zeigt die Konzentration lebender Zellen und das Überlebensverhältnis innerhalb des Züchtungsgefäßes 1 für diesen Fall, sowie den Druckverlust zum Zeitpunkt der Filtrierung. Tabelle 7 Züchtungstage (Tage) Einzelpunkt Konzentration lebensfähiger Zellen (x 10&sup5; Zellen/ml) Überlebensverhältnis (%) Druckabfall zum Zeitpunkt der Filtrierung (kg/cm²)

Claims

1. Verfahren zum Züchten lebender Zellen, bei dem Zellen in einer Zellkulturbouillon (2) in einem Züchtungsgefäß (1) gezüchtet werden; welches Verfahren folgendes aufweist:

- Entnehmen von Zellkulturbouillon (2) aus dem Züchtungsgefäß (1) in eine Filtriervorrichtung (6) mit einer Mikrofiltriermembran (7);

- Mikrofiltern der Zellkulturbouillon (2) durch die Mikrofiltriermembran (7), während die eingetauchte Fläche der Membran (7) mit einem Gas in Berührung gebracht wird, das für die Zellen ungiftig ist;

- Verwenden einer hydrophoben Entschäumungsschicht (8) an der Flüssigkeitsoberfläche, um Blasen zu zerreißen und dadurch das Ausbilden von Schaum zu verhindern; und

- Rückführen von Zellen in das Züchtungsgefäß (1) nach der Mikrofiltrierung, und Entnehmen von Filtrat (14) aus der Kultur.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Membran (7) mit einem flüssigen Medium (12) rückgewaschen wird, um die Zellen in das Züchtungsgefäß (1) rückzuführen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem das Entnehmen von Zellkulturbouillon (2) aus dem Züchtungsgefäß (1) zur Filtriervorrichtung (6) intermittierend ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Mikrofiltriermembran (7) und das ungiftige Gas dadurch in Berührung gebracht werden, daß das ungiftige Gas blasenförmig auf die Membran (7) in der Filtriervorrichtung (6) aufgebracht wird.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das nichtgiftige Gas Stickstoff, Argon oder Luft ist.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Mikrofiltriermembran (7) rohrförmig ist und eine darin unter Einhaltung eines Abstandes eingebettete rohrförmige Ultrafiltriermembran aufweist, wodurch getrennte Filtrate, die polymere Teilchen bzw. solche mit niedrigem Molekulargewicht enthalten, erhalten werden können.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Filtrat polymerer Teilchen in die Kultur rückgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Volumen der der Filtriervorrichtung (6) entnommenen Kulturbouillon (2) mindestens 50 % des Volumens eines flüssigen Mediums (12) ausmacht, das zum Rückwaschen von Zellen aus der Filtriermembran (7) verwendet wird.

9. Vorrichtung zur Zellzüchtung mit:

(a) einem Züchtungsgefäß (1) zum Aufnehmen einer Kulturbouillon (2), in der Zellen in suspendiertem Zustand gezüchtet werden;

(b) einer Filtriervorrichtung (6) mit einer Mikrofiltriermembran (7);

(c) einer Einrichtung (16, 24) zum Übertragen von Kulturbouillon vom Züchtungsgefäß (1) in die Filtriervorrichtung (6);

(d) einer Einrichtung (9) zum Einblasen eines Gases in die Kulturbouillon in der Filtriervorrichtung (6), um es in Berührung mit der Mikrofiltriermembran (7) zu bringen;

(e) einer Einrichtung (8) zum Verhindern von Schaumbildung auf der Oberfläche der Kulturbouillon;

(f) einer Einrichtung (29, 30; 40) zum Rückführen von Zellen von der Filtriervorrichtung (6) in das Züchtungsgefäß (1); und

(g) einer Einrichtung (19, 26) zum Entnehmen von Filtrat (14) aus der Filtriervorrichtung (6).

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, bei der die Mikrofiltriermembran (7) ein langgestrecktes Rohr ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, bei der die Mikrofiltriermembran (7) rohrförmig ist und eine rohrförmige Ultrafiltriermembran in ihr unter Einhaltung eines Spaltes zwischen den Membranen angeordnet ist.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, mit einer Einrichtung zum Waschen der Schaumverhinderungseinrichtung (8).

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, bei der die Gaseinblaseinrichtung (9) eine Verteilereinrichtung unter der Mikrofiltriermembran (7) aufweist.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, bei der die Filtriervorrichtung (6) unter dem Züchtungsgefäß (1) angeordnet ist, wodurch Gasblasen bei Benutzung von der Filtriervorrichtung (6) in das Züchtungsgefäß (1) hochsteigen und die Schaumverhinderungseinrichtung (8) im Züchtungsgefäß (1) angeordnet ist.